Orientador: Maria do Carmo Bittencourt de Oliveira / Banca: Orlando Necchi Junior / Banca: Daniel Scherer de Moura / Resumo: Florações de cianobactérias tóxicas são atualmente um problema mundial devido a produção de toxinas. A microcistina é uma hepatotoxina comumente encontrada em corpos d'água e é produzida principalmente pelo gênero Microcystis. Recentemente a identificação, clonagem e seqüenciamento do agrupamento de genes responsáveis pela codificação da sintetase de microcistina (MS) tornaram possível a abordagem molecular na detecção de populações tóxicas baseada na técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction). A técnica de PCR tornou-se viável e útil pelo fato do agrupamento de genes da sintetase de microcistina estar presente apenas em organismos tóxicos e pela ausência de diferenças morfológicas entre aqueles tóxicos e não tóxicos. Este estudo objetivou desenvolver e avaliar a técnica de PCR competitiva para quantificação de células de Microcystis tóxicas e não tóxicas utilizando os genes cpcBA e mcyB envolvidos respectivamente, na formação da ficocianina e biossíntese da MS. Testou-se a hipótese de que a PCR competitiva pode ser utilizada como metodologia de quantificação de células tóxicas e não tóxicas de Microcystis em substituição a contagem direta de células por microscopia óptica para atender a Portaria do Ministério da Saúde 518/2004. Para obtenção de DNA competidores foram realizadas amplificações seqüenciais de "células DNA equivalente" das linhagens tóxica (BCCUSP18) e não tóxica (BCCUSP03) de Microcystis spp. utilizando primers descritos na literatura, bem como aqueles desenhados para este estudo. Avaliaram-se os DNA competidores amplificando-os com células DNA equivalente das linhagens. Após determinada a quantidade mais próxima de DNA competidores para quantificar 2,0 x 104 células, realizou-se a PCR competitiva com células DNA equivalente de uma amostra ambiental (reservatório de Duas Unas, PE)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Blooms of microcystin-producing cyanobacteria are a problem worldwide. Mycrocystin is a liver hepatotoxin commonly found in bodies of water and is produced mainly by the genus Microcystis. The recent identification, cloning and sequencing of the genes responsible for coding microcystin synthetase (MS) has allowed a molecular approach to the detection of micocystin-producing populations based on the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. Considering the lack of morphological differences between microcystin-producing and non-microcystin-producing organisms, PCR is viable and useful, as the cluster of microcystin synthetase genes is found in only microcystinproducing organisms. The aim of the present study was to develop and assess an competitive PCR method for the quantification of toxic and non-toxic Microcystis cells using the cpcBA and mcyB genes, which are respectively involved in the formation of phycocyanin and biosynthesis of MS. The hypothesis was that competitive PCR could be used as a quantification method for toxic and non-toxic Microcystis cells, replacing the direct cell count under an optical microscope, while fulfilling Brazilian Ministry of Health Ordinance 518/2004. For the acquisition of competitor DNA, sequences amplifications were carried out of the "cell DNA equivalent" of microcystin-producing (BCCUSP18) and non-microcystin-producing (BCCUSP03) strains of Microcystis spp. using primers described in the literature as well as others designed for the present study. Competitor DNA was assessed by amplifying "cells DNA equivalent" of the strains. After determining the quantity closest to the competitor DNA for quantifying 2.0 x 104 cells, competitive PCR was carried out with "cells DNA equivalent" from an environmental sample (Duas Unas Reservoir, PE, Brazil). The constructed competitor cpcBA quantified 1.45 x 104 cells (R2= 0.989)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A severidade dos sintomas provocados pelo Huanglongbing (HLB) ou Greening, a rápida progressão na incidência de plantas afetadas nos pomares e o fato de esta doença afetar indistintamente todas as variedades comerciais de citros, contribuíram para este estudo que visou conhecer o padrão de colonização da bactéria Candidatus Liberibacter americanus (Lam) e Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) em plantas cítricas. O PCR convencional é o teste atualmente utilizado na diagnose. Apesar de ser uma técnica reconhecidamente sensível, para o caso do HLB tem sido apenas confirmatório, ou seja, somente permite detecção da presença da bactéria em amostras de folhas sintomáticas. Surgiram aprimoramentos da técnica de PCR, como é o caso do Nested PCR e o PCR quantitativo (qPCR), demonstrado neste trabalho ser o método empregado mais sensível que o PCR convencional. Assim, através deste estudo pode-se concluir que Las e Lam se concentraram prioritariamente nas partes com sintomas de HLB das plantas de campo, naturalmente inoculadas e infectadas por liberibacter, se diferenciando na média do número estimado de cópias de liberibacter por grama de folha de plantas afetadas, sendo Las com 5,63 contra 5,01 em plantas afetadas por Lam (título bacteriano). A proporção de amostras positivas para Lam foram de 21 (19%) contra 12 (11,2%) amostras positivas para Las. A maior parte das amostras foi negativa para ambas as liberibacters (96 - Las e 90 - Lam). O pequeno acréscimo nos resultados positivos obtido pelo método de qPCR, aliado ao seu alto custo, não justifica a substituição do PCR convencional por este método na diagnose laboratorial do HLB, ficando restrito somente a pesquisa / Abstract: The degree of severity of the symptoms developed by Huanglongbing (HLB) or Greening, the fast incidence of diseased plants at different orchards and the fact that this phytopathogen affects various commercial citrus varieties have contributed to the proposition of the present work, that aimed to know the colonization pattern developed by the bacteria Candidatus Liberibacter americanus (LAM) and Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) on citrus plants. The conventional PCR is the current used assay to detect HLB. Besides being a sensitive and specific technique it is currently seen and a molecular technique that confirms the already symptomatic leaves of diseased plants. Improvements of the PCR technique named the Nested PCR and the quantitative PCR is described in this work as the most sensitive to detect the phytopathogen prior to the development of the symptoms disease. So, based on the results obtained in this work it was possible to conclude that LAS and LAM concentrate showed a tendency to appear mostly on parts of the plants exhibiting symptoms and that are already infected by these bacteria, showing difference when mean number of copies of liberibacter per g of leaf of infected plants, with LAS value of 5.63 as compared to 5.01 for LAM on plants with LAM detectable symptoms (high bacterial titer). The ratio of LAM positive samples was 21 (19%) against 12 (11.2%) positive for LAS. The majority of the samples were detected as negative for both bacteria (96% for LAS and 90% for LAM). The small increase on the positive results obtained when qPCR was used and considering its present high analysis cost, this type of PCR is not seen as adequate to diagnose LAM or LAS / Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Silvio Aparecido Lopes / Banca: Nelson Arno Wulff / Banca: Janete Apparecida Desiderio Sena / Mestre

Orientadora: Maria da Glória Buzinaro / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: O presente estudo teve como objetivo determinar a ocorrência de rotavírus do grupo A e a genotipagem G e P de estirpes detectadas em bezerros de rebanhos leiteiros e gado de corte, durante o período de julho de 2006 a setembro de 2008, em propriedades rurais do Estado de São Paulo, Brasil. Foram amostrados 395 bezerros, na faixa etária entre 1 e 60 dias, independentemente da manifestação clínica de diarréia, de 18 rebanhos bovinos, sendo nove de exploração leiteira e nove de gado de corte. Por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), determinou-se a ocorrência de rotavírus em 33,3% (06/18) entre os rebanhos e de 8,6% (34/395) na população amostrada. A maior freqüência de infecção foi detectada em animais com idade entre 16 e 30 dias (p < 0,01). Foram diagnosticados bezerros infectados por rotavírus tanto em animais com sinais clínicos de diarréia (22%;29/133) quanto naqueles clinicamente normais (1,9%;05/262), existindo, porém, uma correlação entre a presença da infecção e a manifestação clínica da diarréia (p<0,01). Em relação ao tipo de exploração, nos rebanhos leiteiros 0 percentual de ocorrência foi de 5,3% (14/264), enquanto que nos rebanhos de gado de corte o rotavírus teve maior ocorrência (15,3%; 20/131). A análise do perfil do genoma de rotavírus por EGPA identificou dois eletroferótipos distintos, cujas diferenças estavam localizadas na posição de migração dos segmentos 2, 3, 7, 8 e 9. A genotipagem pela reação em cadeia pela polimerase (RT-SNMPCR) das amostras de rotavírus revelou a que as estirpes circulantes nos rebanhos eram G6P[5], G10P[5], não foi possível fazer associação com o genotipo P[1]. / Abstract: The present study aimed to determine the Group A rotavirus and G/P genotyping in detected virus strains in dairy and beef cattle calves from July 2006 to September 2008 in São Paulo State-Brazil farms. 395 calves in 18 flocks (9 dairy cattle and 9 beef cattle) from 1 to 60-day-old were sampled, independently whether manifesting clinically diarrhea or not. By using Poliacrylamide Gel Electrophoresis Technique (PAGE), the rotavirus occurrence of 33.3% (06/18) among flocks and 8.6% (34/395) among the population sampled were determined. The higher infection frequency was detected in 16-to-30-day-old calves (P<0.01). Rotavirus-infected flocks rotavirus-infected were diagnosticated as much the ones having clinical symptoms of diarrhea (22%, 29/133) as the ones clinically normal (1.9%, 05/262), shawing a correlation between the presence of infection and the diarrhea manifestation (p<0.01). Related to the kind of exploration, the occurrence in dairy cattle was 5.3% (14/264) while in the beef cattle the occurrence was higher (15.3%, 20/131). The rotavirus genome profile analysis by PAGE identified two distinct electroferotypes, in which differences were located in the following segment migration positions: 2, 3, 7, 8 and 9. The genotyping of the Rotavirus sample by polymerase chain reaction (RT-snmPCR) revealed that the circulating strains among the flocks were G6P[5], G10P[5] e G?P[1]. / Mestre

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Fernando Antonio de Ávila / Banca: Felipe Perecin / Resumo: Escherichia coli O157:H7 é uma cepa de importância crescente por estar associada a vários surtos graves de doença em humanos, a maioria derivada do consumo de carne bovina crua ou mal cozida. Os bovinos constituem seu reservatório mais importante, aventando-se a hipótese de que mudanças do regime alimentar em confinamentos atuariam favoravelmente ao aparecimento de cepas shigatoxigênicas. Neste estudo objetivou-se verificar, comparativamente durante o abate, a prevalência desse sorotipo e o comportamento de métodos indicadores como a contagem total de microrganismos viáveis (CTMV) e de contaminação fecal - coliformes totais e E. coli, em amostras de fezes e em carcaças de bovinos terminados a pasto e em confinamento, possibilitando a disponibilização de subsídios necessários aos programas de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) e de Análise de Risco (RA), empregados na redução do risco de doenças transmitidas por alimentos. Identificados os lotes de acordo com a terminação (dez de cada tipo), desses foram aleatoriamente colhidas e analisadas 100 amostras de suabe retal, 100 amostras de carcaças e 67 amostras de "recortes" da desossa (carne industrial) utilizando-se, para a E. coli O157- H7, técnica automatizada de PCR. À exceção de uma única amostra de recortes (0,37%), as demais, tanto de fezes quanto de carcaças, foram negativas para a cepa pesquisada. Além de contatar-se uma prevalência muito baixa, não se evidenciou diferenças entre os tipos de terminação dos animais. Os resultados dos indicadores - CTMV, de coliformes totais e E. coli, foram considerados aceitáveis em 91%, 85% e 93% das amostras, respectivamente, oferecendo suporte e concordância com a baixa prevalência encontrada. / Abstract: Escherichia coli O157:H7 is an important strain that has been associated with outbreaks of serious disease in humans, most being derived from consumption of raw or poorly cooked beef. It is likely that cattle are an important reservoir, suggesting the possibility that changes in feedlot diet favor the emergence of shigatoxigenic strains of E. coli. This study is intended to verify, comparatively during bovine slaughter, the occurrence of E. coli O157:H7 associated with the sampling results obtained by means of general indicator methods (total viable count) and fecal contamination indicators (coliforms and E. coli). Samples will be taken from both excreta and carcasses of cattle finished either on pasture or feedlot, allowing the provision of subsidies necessary for Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) and Risk Analysis (RA) programs and applied in the reduction of the risk of foodborne diseases. After identification of batches according to the type of finishing (feedlot or pasture), samples were randomly collected and analyzed. 100 rectal swabs, 100 samples from carcasses sponging, and 67 samples of "sliced meat" from the boning room (industrial meat). An automatic PCR technique for detection of E. coli O157:H7 was used. Except for one sample of sliced meat (0.37%), all others, both for excreta and carcasses, were negative for the O157:H7 E. coli strain. There were no significant differences in prevalence between the types of cattle finishing of the animals. The results of the indicators methods (TVC, coliforms and E. coli); were considered acceptable in 91%, 85% and 93% of tested samples, respectively, supporting and in agreement with low prevalence of O157:H7 found. / Mestre

Orientador: Fernando Antonio de Ávila / Banca: Hélio José Montassier / Banca:Antonio José Piantino Ferreira / Resumo: Foram isoladas 90 estirpes de E. coli de fígados e de intestinos, de pintainhas de postura comercial, com sete dias de idade. Com o objetivo de caracterizar as estirpes isoladas, a patogenicidade das mesmas foi determinada, em inoculação "in vivo". O teste revelou 44 estirpes de alta ou de intermediária patogenicidade, que foram analisadas por PCR multiplex quanto á presença de oito genes de virulência (astA, iss, iucD, irp2, papC, tsh, vat e cva/cvi) e tiveram os sorotipos O:H identificados. Os resultados demonstraram que todas as estirpes analisadas continham pelo menos um dos oito genes pesquisados e que a maioria (93,20%) possuíam o gene iss. Foram detectados 17 perfis genéticos diferentes, sendo 15 deles com combinações de dois ou mais genes, representando 70,45% do total de estirpes analisadas. Onze sorogrupos e onze antígenos "H" foram identificados, sendo O8 (15,89%) e o H17 (23,8%) os mais frequentes. Com o objetivo de verificar a susceptibilidade das estirpes aos antimicrobianos: ampicilina, enrofloxacina, eritromicina, espectinomicina, estreptomicina, fosfomicina, kanamicina, lincomicina, norfloxacina, sulfa+trimetoprim e tetraciclina, comumente utilizados na avicultura, todas as estirpes de E. coli isoladas foram analisadas. O antimicrobiano que apresentou maior atividade antibacteriana foi a espectinomicina (92,2%) e o de menor atividade foi a lincomicina. Nenhuma das estirpes foi sensível a todos os antimicrobianos testados. Os resultados demonstraram uma diversidade de sorotipos e de genes de virulência envolvidos no quadro clínico de colibacilose estudado, como também sorogrupos que não haviam sido relatados em APEC e a alta incidência de resistência antimicrobiana / Abstract: A total of 90 strains of E. coli were isolated from the livers and intestines of seven-day-old commercial layer chicks. With the objective of characterising the isolated strains, their pathogenicity levels were determined by in vivo inoculation. These tests identified 44 strains with high or intermediate levels of pathogenicity, which were then analysed by multiplex PCR for the presence of eight virulence genes (astA, iss, iucD, irp2, papC, tsh, vat e cvi/cva) and the serotypes O:H were identified. The results demonstrated that these isolated strains contained at least one of the eight genes of interest, and the majority (93.20%) possessed the iss gene. Seventeen different genetic patterns were detected, 15 of which had combinations of two or more genes, representing 70.45% of all analysed strains. Eleven serogroups and eleven antigens "H" were identified, O8 (15.89%) and H17 (23.80%) were most frequent. Aiming to verify the susceptibility of strains to antimicrobial agents: ampicillin, enrofloxacin, erythromycin, spectinomycin, streptomycin, fosfomycin, kanamycin, lincomycin, norfloxacin, trimethoprim sulfa and tetracycline, commonly used in poultry, all strains of E. coli isolates were analyzed. The antibiotics that showed the highest antibacterial activity was spectinomycin (92.2%) and less activity was the lincomycin (100%) strains were resistant. None of the strains were sensitive to all antibiotics tested. The results showed a diversity of serotypes and virulence genes involved in the clinical study of colibacillosis, as well as serogroups that had not been reported in APEC and the high incidence of antimicrobial resistance / Mestre

Resumo: Com a crescente disponibilidade das biotécnicas de reprodução animal, o comércio dos produtos envolvidos com essas práticas também está em expansão, oferecendo a possibilidade de melhoria dos índices zootécnicos às produções de bovinos. Porém deve-se levar em consideração que há riscos sanitários em práticas como a inseminação artificial caso não se realize o controle do material biológico utilizado. Dentre os agentes infecciosos que podem estar presentes no sêmen e passíveis de serem transmitidos por esse estão a leptospirose e a brucelose, enfermidades responsáveis por grandes perdas reprodutivas e econômicas na bovinocultura mundial. Este projeto teve como objetivos detectar molecularmente esses patógenos em amostras de sêmen bovino provenientes de centrais de comercialização brasileiras, utilizando um kit comercial para extração de DNA ("RTP Bacteria DNA Mini Kit" (Invitek®), aperfeiçoá-lo para a extração de DNA bacteriano a partir de sêmen e avaliar sua aplicabilidade à rotina laboratorial. O DNA bacteriano foi extraído e quantificado por eletroforese em gel de agarose. Pretendeu-se também realizar reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os "primers" B4 e B5 para amplificação do DNA de Brucella spp. e os "primers" Lep 1 e Lep 2 para Leptospira spp. O kit de extração foi otimizado com sucesso, e todas as 96 amostras examinadas foram negativas para qualquer DNA bacteriano. Os resultados podem ser úteis para estabelecer alternativas de controle sanitário em touros doadores de sêmen e permitir o fornecimento de material genético livre de patógenos, aumentando o "status" sanitário da reprodução de bovinos no Brasil / Abstract: With the increasing disponibility of animal reproduction biotechniques, trading of products involved with these activities is also in expansion offering improving possibilities in zootecnic indexes of bovine herds. However, considerations should be taken about sanitary risks in practices like artificial insemination if any control is applied to this biological material. Among infectious agents that could be present and transmitted by semen are leptospirosis and brucellosis, diseases that are responsible for numerous reproductive and economic losses in world's cattle culture. The goals of this project were to molecularly detect these pathogens in bovine semen samples from Brazilian artificial insemination centers using a commercial kit for DNA extraction (RTP Bacteria DNA Mini Kit (Invitek®), to improve it for extracting bacterial DNA from semen and to analyze its applicability in laboratory routine. Bacterial DNA was extracted and quantified by agarose gel electrophoresis. We also intended to realize polymerase chain reaction (PCR) using primers B4 and B5 for amplification of Brucella spp. DNA and primers Lep 1 e Lep 2 for Leptospira spp. DNA. The extraction kit was successfully optimized and all of 96 examined samples were negative for any bacterial DNA. Results could be useful to establish alternative measures of sanitary control in semen donors and to allow the supplying of genetic material free of pathogens, increasing sanitary status of bovine reproduction in Brazil / Orientador: Raul José Silva Gírio / Coorientadora: Fernanda Senter Magajevski / Banca: Luis Antonio Mathias / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Cursi / Mestre

Resumo: O tumor venéreo transmissível canino (TVTC) é uma neoplasia transmitida entre cães saudáveis pelo contato direto de pele e/ou mucosas lesionadas. Face aos escassos estudos relacionados aos eventos celulares envolvidos nas fases de crescimento do TVTC, o presente estudo teve por objetivo identificar a presença do gene TP53 e o RNAm referente a proteína codificada, além de detectar a expressão das proteínas p53, Bcl-2 e p63 em cortes histológicos de 13 amostras de TVTC. Com relação à evolução da neoplasia, 46% das amostras foram consideradas em fase de progressão e 54% no estágio de regressão. Foram utilizadas as técnicas de hibridização in situ (ISH) e RT-PCR in situ, que demonstrou a presença do DNA homólogo ao TP53 e seu respectivo RNAm em 92,30% das amostras. A expressão das proteínas p53, p63 e Bcl-2 foram detectadas em 50%, 70% e 100% das amostras, respectivamente. A p63 foi expressa de forma evidente nas amostras em regressão, porém a p53 e a Bcl-2 não apresentaram relação com o estágio evolutivo do tumor e provavelmente não podem ser analisados como fatores de prognóstico do TVTC. Observou-se, nesse estudo que, através das técnicas de ISH e RT-PCR in situ foi possível detectar o DNA do TP53 e seus transcritos, porém esse fato não significou a transcrição da p53, devido aos baixos níveis de expressão nas análises quantitativa e qualitativa nas amostras de TVTC / Abstract: The canine transmissible venereal tumor (CTVT) is transmitted by direct contact of skin or mucosal presenting lesions. In fact, few reports have been found describing the cellular immune response related to the evolution of the tumor. The objective of this study was to identify the TP53 gen and its transcription in CTVT in different stages of evolution, collected from dogs (N=13) examined at veterinary school, UNESP, Aracatuba, SP, Brasil. In addition, it was also evaluated the expression of p53, p63 and Bcl-2 in histological sections by the use of immunohistochemystry assay. The p53, p63 and Bcl-2 were evident in 50, 70 and 100% of analyzed samples. Regarding to tumor evolution, 6 out of 13 were considered in a progressive stage (46%), was list 7 out of 13 were classified in a regressive stage (54%). The use of in situ hybridization and reverse transcriptase polymerase chain reaction in situ (RT-PCR), revealed that TP53 was present in all samples and P63 was more expressed than p53. Take all results together, the real role of those marker are extremely important to understand the biological behavior and to improve therapeutic procedures for CTVT / Orientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Coorientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Paula Rahal / Mestre

Resumo: O Brasil é o segundo maior produtor de soja no mundo, cuja cultura requer o elemento nitrogênio em quantidades elevadas para manutenção do alto teor protéico dos grãos. A entrada de nitrogênio nos sistemas agrícolas pode ocorrer pela adição de fertilizantes nitrogenados ou por processos naturais como a Fixação Biológica do Nitrogênio, que se constitui como supridor de nitrogênio mais viável para a cultura da soja, tanto economicamente como ecologicamente. Este processo ocorre graças à simbiose que ocorre entre esta leguminosa e as bactérias do gênero Bradyrhizobium, resultando na formação de nódulos radiculares onde se dá a obtenção de todo o nitrogênio que a cultura necessita para alta produtividade. A introdução destas bactérias no solo se dá através da utilização de inoculantes comerciais, que incluem as bactérias Bradyrhizobium elkanii e Bradyrhizobium japonicum em sua composição. Aspectos relacionados à formulação e fabricação dos inoculantes comerciais reúnem os fatores mais importantes para a obtenção de um produto de qualidade, obedecendo à legislação vigente. Tendo em vista a análise de qualidade de inoculantes comerciais para soja em diferentes períodos de armazenamento, um estudo do metabolismo respiratório de bradirrizóbios foi realizado in vitro e em simbiose. Inoculantes comerciais com 12, 27 e 48 meses de idade foram analisados quanto suas características bioquímicas e fisiológicas, assim como testados em casa de vegetação. Adicionalmente, os mesmos testes foram realizados com Bradyrhizobium elkanii sob diferentes condições de oxigênio. Análise da expressão gênica indicou que um processo de expressão de genes relacionados à fixação biológica de nitrogênio (genes sensores a baixas tensões de oxigênio) foram expressos, entretanto não ocorrendo expressão do gene nifH, este só expresso em condições... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is the second major soybean producer in the world, whose culture requires the element nitrogen in large amounts for the maintenance of the high protein content in grains. The input of nitrogen in agricultural systems can occur by adding nitrogen fertilizer or by natural processes such as biological nitrogen fixation (BNF). BNF is the most feasible way to delivery nitrogen for the soybean crop, both economically and ecologically. This process occurs through the symbiosis between the legume and the bacteria of the genus Bradyrhizobium, resulting in the formation of root nodules where all nitrogen that the crop needs for high productivity is acquired. The introduction of these bacteria in soil is given by use of commercial inoculants, which include the bacteria Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium elkanii in its composition. Aspects related to formulation and manufacture of inoculants include the most important factors affecting the product quality, according to law. In order to analysis of the quality of commercial inoculants for soybean in different storage periods, a study of respiratory metabolism of bradyrhizobia was performed in vitro and in symbiosis. Inoculants with 12, 27 and 48 months old were analyzed accessing their biochemical and physiological characteristics, and tested at greenhouse. In addition, the same tests were conducted on cultures of Bradyrhizobium elkanii under different oxygen conditions. Analysis of gene expression have indicated that genes related to biological nitrogen fixation (genes sensors at low oxygen tension) were intensively expressed, but not occurring nifH gene expression which is only expressed under symbiosis. Similar data were found for the expression of these genes when B. elkanii grown at different oxygen tensions. These data indicate that as the oxygen level is reduced some genes related to nitrogen fixation are expressed... (Complete abstract click electronic access below) / Orientadora: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Emanuel Maltempi de Souza / Mestre

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo avaliar a agressividade de linhagens de Ralstonia solanacearum provenientes de solanáceas, plantas ornamentais e eucalipto, em plantas de batata, tomate e fumo, bem como caracterizar as linhagens por meio de técnicas moleculares. Vinte e duas linhagens foram utilizadas nos ensaios de avaliação da agressividade, em experimentos conduzidos em casa-de-vegetação evidenciaram alta severidade da doença pelas linhagens de R. solanacearum quando inoculadas em plantas de tomate e batata, sendo a batata mais afetada nas inoculações. Todas as linhagens mostraram-se agressivas, sendo que o fumo mostrou baixa suscetibilidade ao ataque das bactérias. As linhagens mais agressivas em plantas de tomate foram IBSBF 309, IBSBF 1712, IBSBF 1839, IBSBF 1882, IBSBF 1883 e IBSBF 2000, pertencentes às biovares I, II e III. As linhagens mais agressivas às plantas de fumo foram IBSBF 309, IBSBF 2131 e IBSBF 292T, pertencentes à biovar I. Foi efetuado também ensaio de microbiolização in vitro em sementes de eucalipto, a fim de se identificar possíveis linhagens patogênicas a esta espécie vegetal e concluiu-se que todas as linhagens utilizadas infectaram plantas de eucalipto ou afetaram seu crescimento. A caracterização molecular de 41 linhagens de Ralstonia solanacearum, provenientes de diversas plantas hospedeiras, incluindo solanáceas, bananeira, helicônia, plantas ornamentais e eucalipto, foi efetuada empregando-se ERIC e BOX-PCR e os resultados mostraram grande diversidade genética entre as linhagens. A análise de PCR-RFLP da região espaçadora 16S-23S DNAr permitiu distinguir os isolados pertencentes à biovar III das demais biovares (I, II, IIA e IIT), quando digeridos com as enzimas Taq I e Hin6 I. A análise de sequenciamento de parte dos genes Endoglucanase (Egl) e MutS possibilitou a classificação em filotipos e os resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to evaluate the aggressiveness of strains of Ralstonia solanacearum from solanaceus, ornamental and eucalyptus plants, on potato, tomato and tobacco, and to characterize the strains through molecular techniques. Twenty-two strains were used in this study to evaluate the aggressiveness and, the experiments conducted in a greenhouse revealed the high susceptibility of tomato and potato plants, with the potato being the most affected on through the inoculations. All isolates proved to be aggressive and higher tolerance to the attack of bacteria was verified on tobacco plants. Strains more aggressive on tomato were IBSBF 309, IBSBF 1712, IBSBF 1839, IBSBF 1882, IBSBF 1883 and IBSBF 2000, belonging to biovars I, II and III. The more aggressive strains on the tobacco plants were IBSBF 309, IBSBF 292T and IBSBF 2131 belonging to biovar I. Tests in vitro of microbiolization of eucalyptus seeds were also performed in order to identify possible pathogenic strains to this species and the results showed that all strains used cause infection on emerging plants or affected their growth. To molecular characterization of 41 strains of Ralstonia solanacearum from several host plants including solanaceous, banana, heliconia, ornamentals and eucalyptus were employed to ERIC and BOX-PCR, and the results showed high genetic diversity among strains. The analysis of PCR-RFLP of 16S-23S spacer region rDNA allowed us to distinguish the isolates belonging to biovar III from the others (biovars I, II, IIA and IIT) when digested with enzymes Taq I and Hin6 I. The sequence analysis of the partial of Endoglucanase (Egl) and MutS genes allowed the classification in phylotypes and the results revealed a predominance of the phylotype II in Brazil, and four isolates were classified in the phylotype I, all belonging to biovar III / Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Coorientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano / Banca: Valdemar Atilio Malavolta Junior / Banca: Ivan Paulo Bedendo / Mestre

Resumo: Os prejuízos causados à pecuária brasileira pelo carrapato (Rhipicephalus (B.) microplus) são significativos e, uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade dos rebanhos nas regiões tropicais tem sido a utilização de raças mais resistentes a esse ectoparasita. O objetivo desse projeto foi aplicar a tecnologia de microarray de DNA para a prospecção de genes relacionados com os mecanismos de resistência/tolerância ao carrapato, mediante a análise da expressão gênica diferencial em linfonodos de bovinos suscetíveis (Aberdeen Angus) e resistentes (Nelore) infestados artificialmente com este parasita. Os bezerros foram mantidos livres de carrapato desde o nascimento e foram infestados artificialmente com larvas de carrapato aos quatro meses de idade. As biópsias de linfonodo foram realizadas antes e após a infestação e mantidas a -80°C até o seu processamento. Essas amo stras foram submetidas a extração de RNA, síntese de cDNA e marcação . Depois elas foram submetidas a hibridização pela técnica de microarray. Foram identificados 341 genes diferencialmente expressos nos bovinos da Raça Angus e 254 para bovinos da Raça Nelore, os quais foram agrupados em categorias funcionais. Foram identificadas diferenças no padrão de expressão de genes de resposta imune entre as raças, tais como: Moléculas CD, Imunoglobulinas, Fator de Necrose tumoral, Integrinas e Interferon-γ. Para validação dos resultados de expressão diferencial foi empregada a técnica de PCR em tempo real, onde se verificou a expressão dos genes das citocinas IL-5 e IL12p40 nas duas Raças estudadas. / Abstract: Significant losses are brought by ticks (Rhipicephalus (B.) microplus) to Brazilian beef farming. One of the strategies to increase yield in tropical regions is the use of resistant breeds. This study was undertaken to apply the DNA microarray technology for the prospection of genes related to tick resistance/tolerance mechanisms, through differential gene expression analysis in lymphonodes of susceptible (Aberdeen Angus) and resistant (Nelore) breeds artificially infested with the parasite. Calves were kept tick-free since birth and infested with tick larvae when they reached four months of age. Lymphonode biopsies were performed before and after infestation and kept at -80°C until analyses. Samples were subjected to RNA extraction, cDNA synthesis and labelling. Hybridization was then performed through the microarray technique. In Angus, 341 differentially expressed genes were found against 254 in Nelore, which were grouped in functional categories. Different expression patterns were identified immune response genes between breeds, such as: CD molecules, Immunoglobulines, Tumor Necrosis Factor, Integrins and Interferon-γ. Real-time PCR was used to validate results, which showed the expression of cytokines IL-5 and IL12p40 in both breeds. / Orientador: Luiz Roberto Furlan / Coorientador: Márcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Maribel Elizabeth Funes Huacca / Mestre