Resumo: A divergência genética entre Bos taurus taurus e Bos taurus indicus é estimada em ~ 250.000 anos mas, apesar dessa proximidade filogenética, estes dois grupos de bovinos apresentam diferenças marcantes em relação à taxa de crescimento muscular e a maciez da carne. De maneira que este estudo foi delineado para avaliar perfil da expressão gênica diferencial no musculo Longissimus dorsi das raças Nelore e Aberdeen Angus com o objetivo de identificar conjuntos de genes cuja expressão está associada à manifestação das características acima mencionadas. Vinte bezerros machos de cada raça foram criados e terminados em regime de confinamento, metade dos quais foi abatida aos 15 e a metade restante aos 19 meses de idade. Nossos resultados sugerem fortemente que a ação autócrina e/ou parácrina do IGF-1 produzido no tecido muscular deve exercer um papel crucial na modulação da taxa de crescimento muscular e na maciez da carne de bovinos. Por outro lado, nossa análise das redes de interação gênica mostrou um grande número de genes que codificam proteínas que agem na proteólise muscular, pequeno número de inibidores e reguladores de proteases, assim como diversos genes relacionados com a morte celular programada nos animais que apresentaram maior maciez da carne, reforçando a hipótese do envolvimento de um complexo multi-enzimático (incluindo as calpaínas e outras proteases) no processo de amaciamento da carne, o qual seria semelhante ao processo de apoptose. / Abstract: The genetic divergence between Bos taurus taurus and Bos taurus indicus is estimated to be ~ 250.000 years but, in despite of their phylogenetic proximity, this two bovine groups show remarkable differences in regard to the muscle growth rate and meat tenderness. Thus, this study was aimed to evaluate the differential gene expression profile in Longissimus dorsi muscle of Nellore and Aberdeen Angus breeds in order to identify set of genes whose expression is associated with the manifestation of the above-mentioned traits. Twenty male calves of each breed were grown and finished in the feedlot system, half of which was slaughtered at 15 and the remaining half at 19 months of age. Our results strongly suggest that the autocrine and/or paracrine action of the IGF-1 produced in the muscle might play a crucial role in the modulation of muscle growth rate and meat tenderness in beef cattle. On the other hand, our gene interaction network analysis revealed a large number of genes encoding proteins acting in the skeletal muscle proteolysis, a small number of inhibitors and regulators of proteases, as well as several genes related to the programmed cell death in animals that had greater tenderness of meat, reinforcing the hypothesis of the involvement of a multi-enzymatic complex (including calpains and other proteases) in the meat tenderization process, which resembles the apoptosis process. / Orientador: Luiz Roberto Furlan / Coorientadora: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Leandro Marcio Moreira / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Liana Brentano / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Resumo: A técnica de imunocaptura associada com a reação de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) executadas tanto pelos procedimentos convencional como em tempo real foram testadas para a detecção rápida do gene da glicoproteína de Matriz (M) do vírus de influenza aviária (AIV) em amostras de líquido cório-alantóide (LCA) e em suabes traqueais e cloacais. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e otimizar a técnica de IC-RT-PCR para o diagnóstico do vírus da Influenza aviária. Os resultados obtidos foram comparados com um sistema empregando "beads" magnéticas em microplacas (AMBION), que é o método padrão de extração de RNA usado no laboratório de referência para diagnóstico de influenza aviária, o National Veterinary Services Laboratory - Ames, EUA (USDA), acrescido ainda de outros métodos de extração tradicionalmente usados nos laboratórios de referência para AIV, como os procedimentos com o uso do solvente orgânico Trizol® (Invitrogen) e com um sistema robotizado e que utiliza "beads" magnéticas (MagNA Pure - ROCHE). A técnica de IC-RT-PCR em tempo real neste estudo detectou a estirpe H2N2 do AIV, sem que nenhum outro dos RNA-vírus heterólogos testados fossem detectados (vírus das doença de Gumboro, de Newcastle e da bronquite infecciosa aviária). Os limites de detecção do IC-RTPCR foram iguais aos obtidos na técnica de extração com o kit da AMBION e menores do que aqueles que foram observados para os métodos de extração com Trizol® (Invitrogen) e com o MagNA Pure. O IC-RT-PCR demonstrou ser um sistema de diagnóstico capaz de conciliar simplicidade operacional e um menor custo com sensibilidade e especificidade analíticas iguais às do procedimento padrão atualmente adotado, podendo ser inclusive por laboratórios dotados de uma infra-estrutura mais simples / Abstract: The polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription-PCR (RT-PCR), including real-time RT-PCR have been used for the rapid detection of Matrix glycoprotein gene (M gene) Avian influenza virus (AIV). Despite the availability of various RNA extraction methods for using in RT-PCR, isolation and detection of viral RNA are still difficult due to the unstable nature of viral RNA molecules and the presence of PCR inhibitory substances. In this study, a simple method using immune-capture (IC) to recover viral RNA from H2 AIV samples was developed and compared to one standard and two others reference methods used for viral RNA extraction, such as Ambion MagMAXTM kit and Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche), respectively, with subsequent analysis by real-time RT-PCR. The real-time IC-RT-PCR developed in was able to detect specifically H2N2 AIV strain, without detecting non-related avian RNA-virus pathogens, such as Newcastle disease virus, avian infectious bronchitis virus and Gumboro disease virus. Comparable detection limits were found for IC and the standard RNA extraction method using Ambion MagMAXTM kit, either for the detection of AIV in allantoic fluid suspension or in seeded tracheal and cloacal swab samples by conventional or real time RT-PCR techniques. These methods were less sensitive than Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche) procedures. Thus, IC was rapid and as sensitive and specific as current standard AIV RNA extraction method for real time or conventional RT-PCR, besides it conciliated simplicity and lower cost and can be applied simultaneously for direct detection of AIV in a large number of samples, including less-equipped laboratories / Mestre

Orientador: Fernando Antônio de Ávila / Banca: José Moacir Marim / Banca: Patricia Amoroso / Banca: Simone Barone Salgado Marques / Banca: Tammy Priscilla Chioda Delfino / Resumo: Foram estudadas 180 amostras de água de 45 consultórios odontológicos da cidade de Barretos-SP, com o objetivo de isolar, identificar, determinar a contagem de isolados de Pseudomonas aeruginosa UFC/mL, determinar o perfil clonal e avaliar a diversidade genômica dos isolados e a suscetibilidade das mesmas frente a diferentes antibióticos. As amostras de água foram filtradas em filtro Millipore® e a membrana colocada sobre o centro de uma placa de Petri contendo agar cetrimida, As colônias típicas de bactérias do gênero Pseudomonas foram identificadas pelo método de Gram, inoculação em TSI agar (Triple Sugar Iron), crescimento a 42ºC, produção de pigmento, produção de alginato, oxidase, motilidade e alcalinização da acetamida. O teste utilizado para análise genômica foi o ERIC-PCR. Dos 76 (42,2%) isolados de Pseudomonas aeruginosa, 15 eram provenientes das amostras de torneira de lavagem das mãos, 18 de reservatório de garrafa pet, 23 de seringa tríplice e 20 do motor de alta rotação. Todos os isolados de Pseudomonas aeruginosa foram submetidos ao teste de suscetibilidade segundo a técnica de Kirby- Bauer. Dos antibióticos testados o que apresentou melhor resultado quanto à sensibilidade (65,8%) foi a ciprofloxacina. Quanto à similaridade genética dos isolados dos diferentes pontos analisados, foram encontrados nove "clusters" de 100% de similaridade. / Abstract: The biofilm found in water supplies and lines of hospitals and dental units is extremely important because it presents a large number of bacteria, leading to risk of infection in immunocompromised patients vulnerable to opportunistic pathogens such as the Pseudomonas aeruginosa. One hundred eighty water samples from dental units of the city of Barretos-SP were evaluated. The water samples filtered in Millipore® filter were incubated in plates containing Cetrimide ágar. The bacteria colonies were identified through the gram-staining test, inoculation in agar T.S.I (triple sugar Iron), growth at 42 ° C, pigment production, production of alginate, oxidase acetamide alkalization and motility observation. All Pseudomonas aeruginosa bacteria were submitted to the susceptibility test according to the Kirby-Bauer technique. The test used for genomic analysis was the ERIC-PCR. From the total microorganisms studied, 76 (42,2%) were positive for Pseudomonas aeruginosa, isolates from 180 water samples, where 15 strains were from hand washing incoming local water supplies, 18 from PET bottled water, 23 from 3-in-1 syringes and 20 from the high speed handpiece. In relation to the antibiotics tested, the one presenting the best result with regard to sensibility was ciprofloxacin with 65.8%. The genetic similarity of isolates from different points analyzed, there were nine clusters of 100% similarity. / Doutor

Resumo: Sabendo que o processo de transformação do músculo em carne no estágio postmortem é largamente governado pela proporção de distintos tipos de fibras, e tendo em vista a necessidade de suprir as demandas do setor da pecuária bem como as exigências do consumidor por um produto de maior qualidade, inclusive da carne, o presente projeto objetivou relacionar a maciez da carne do músculo Longissimus dorsi (LD) com a expressão gênica e protéica das isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC) em dois grupos genéticos de bovinos. Foram analisados 28 bovinos jovens de dois grupos genéticos, 14 Nelores e 14 Canchins. Os animais receberam a mesma dieta, o mesmo manejo no mesmo ambiente, com a finalidade de mantê-los no mesmo estado fisiológico. Atingindo o tempo pré-estabelecido de confinamento de 140 dias, os animais foram abatidos e amostras do músculo LD foram coletadas para análise da maciez da carne e também para a quantificação das expressões gênicas e protéicas das isoformas de MHC através das técnicas de RT-qPCR e de separação eletroforética (SDS-PAGE) respectivamente. O grupo Canchim apresentou maior maciez da carne em relação ao grupo Nelore em ambas as metodologias utilizadas, força de cisalhamento e índice de fragmentação miofibrilar, bem como uma menor expressão gênica da isoforma de MHC 2X. Foi verificada uma correlação negativa da expressão das isoformas 2A e 2X e uma correlação positiva da expressão da isoforma de MHC Slow com a maciez da carne nos dois grupos genéticos. Os resultados sugerem que a menor maciez da carne do grupo Nelore em relação ao grupo Canchim possa estar relacionada com a maior expressão gênica da isoforma de MHC 2X no grupo Nelore / Abstract: Knowing that the meat tenderness process that turns muscle in meat on postmortem are largely governed by the proportion of different fiber types, and in view of the need to supply the needs of livestock industry and consumer demands for a higher quality product, including meat, this project aimed to relate meat tenderness of Longissimus dorsi muscle (LD) with gene and protein expression of myosin heavy chain (MHC) isoforms in two genetic groups of cattle. Twenty-eight steers of two genetic groups, 14 Nellores and 14 Canchins were used. The animals received the same feed, the same management in the same environment, in order to keep them in the same physiological state. After 140 days of feedlot, the animals were slaughtered and LD muscle samples were collected for meat tenderness analysis and also for gene and protein expression quantification of MHC isoforms using RT-qPCR and electrophoretic separation (SDS-PAGE) technique, respectively. The Canchim group had better meat tenderness in relation to Nellore group in both methodologies used, shear force and myofibrillar fragmentation index and lower MHC 2X isoform gene expression. It was observed a negative correlation between 2A and 2X isoforms expression and a positive correlation of MHC Slow isoform expression to meat tenderness in the two genetic groups. The results suggest that lower meat tenderness of Nellore group in relation to Canchim group may be related to higher gene expression of MHC 2X isoform in Nellore group / Orientador: Henrique Nunes De Oliveira / Coorientadora: Maeli Dal Pai Silva / Banca: Robson Francisco Carvalho / Banca: Rafael da Costa Cervieri / Mestre

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Lia de Alencar Coelho / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: César Roberto Esper / Banca: Gilson Helio Toniollo / Resumo: Os objetivos deste trabalho foram de facilitar os procedimentos de formação de gradientes de- densidade de Percoll e OptiPrep para separação de espermatozóides X; avaliar a eficiência da sexagem de espermatozóides X, a viabilidade espermática e integridade do acrossoma e do DNA após a centrifugação nestes gradientes e avaliar taxa de clivagem e blastocisto durante a produção in vitro de embriões. Para isso, doses de sêmen de touros foram descongeladas e cerca de 40 milhões de espermatozóides foram colocados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas que variaram entre 1.11 Og/mL a 1.123g/mL em tubos de poliestireno de 15mL. Centrifugou-se o gradiente a 500xg por 15 min a 22°C. Os sobrenadantes foram aspirados e recuperados para verificação da viabilidade espermática e integridade do acrossoma, fragmentação do DNA, produção in vitro de embriões, avaliação da eficiência da sexagem pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e sexagem dos embriões pela PCR. A porcentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto diminuiu (P<0,05) após a centrifugação nos gradientes de densidade, mas não influenciou, de modo geral, a produção in vitro de embriões (taxa de clivagem e blastocistos) utilizando estes espermatozóides centrifugados. Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozóides nas amostras centrifugadas. Os resultados demonstraram que o Percoll enriqueceu as amostras com espermatozóides X (62% de fêmeas, P<0,05). No OptiPrep e grupo Controle a porcentagem de fêmeas foi de 47,1 e 48,7%, respectivamente. Estes resultados foram confirmados pela qPCR do DNA dos espermatozóides, com uma subestimação apenas no Percoll. Foi possível realizar a sexagem, por uma metodologia mais simples, facilitando o procedimento de centrifugação em gradiente de densidade e sem provocar danos aos espermatozóides. / Abstract: The objectives of this work were to facilitate the procedures of formation of density gradients of Percoll and OptíPrep for separation of X-bearing bovine spermatozoa; to evaluate the efficiency of sexing and viability of acrosome integrity and DNA after centrifugation in these gradients and to assess the cleavage and blastocyst rate during in vitro production of embryos. For this, frozen-thawed spermatozoa (20 to 40 millions) were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers that varied between 1.110g/mL to 1.123g/mL, in 15mL polystyrene tubes. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 min at 22oC. Supernatants were carefully aspirated and sediments recovered for verification of sperm quality, DNA fragmentation, in vitro fertilization of embryos, evaluation of the efficiency of sexing by real time polymerase chain reaction (qPCR) and sexing of embryos by PCR. Percentage of live spermatozoa with intact acrosome decreased (P<0.05) after centrifugation in density gradients, however, it not influence, in general, the production of embryos in vitro (cleavage and blastocyst rates) using these centrifuged sperm. No sperm DNA fragmentation was detected in centrifuged samples. The results of embryo sexing by PCR showed deviation to female in the Percoll group (62%, P<0.05). In the OptiPrep and Control group the percentage of females was 47.1 and 48.7%, respectively. These results were confirmed by qPCR of DNA of spermatozoa, with an underestimation only in the Percoll group. It was possible the sexing, by a simple approach, facilitating the process of the centrifugation in density gradient and without damage to sperm. / Doutor

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: José Maurício Barbanti Duarte / Banca: Natalino Hajime Yoshinari / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo pesquisar no sangue de cervos-do-pantanal (B. dichotomus), a presença de DNA de agentes rickettsiais, tais como Ehrlichia chaffeensis, E. ewingiii, E. canis, Anaplasma phagocytophilum, A. marginale e Neorickettsia risticii, pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), além de estudar a prevalência de anticorpos anti-E. chaffeensis e anti-A. phagocytophilum utilizando-se a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Os 143 animais utilizados foram capturados durante o desenvolvimento do Projeto Cervo-do-Pantanal (1998 a 2002) na área de inundação da Usina Hidrelétrica de Porto Primavera, no Rio Paraná, e divididos em quatro sub-populações de acordo com o local e momento da captura, em áreas denominadas MS01, MS02 (Mato Grosso do Sul, antes e após a inundação, respectivamente), PX (Rio do Peixe, depois da primeira cota de inundação) e AGUA (Rio Aguapeí, depois da inundação). Na avaliação sorológica, as freqüências de animais positivos para anticorpos anti-E. chaffeensis e anti-A. phagocytophilum foram de 76,76% e 20,20% em MS01, 88,88% e 22,22% em PX, 88,88% e 5,55% em MS02, e 94,12% e 5,88% em AGUA, respectivamente. Na pesquisa de DNA, dos 143 animais testados, 61 (42,65%) foram positivos para E. chaffeensis, sendo 38 (38,38%) de MS01, 4 (44,44%) de PX, 12 de MS02 (66,66%) e 7 (41,18%) de AGUA. Amostras positivas enviadas para seqüenciamento revelaram 100% de similaridade com amostras de Ehrlichia chaffeensis da Argentina e dos Estados Unidos (números de acesso no Genbank EU826516.2 e AF416764.1, respectivamente). Já para o genogrupo de A. phagocytophilum, 70 cervos (48,95%) foram considerados positivos. Destes, 51 (51,51%) são provenientes de MS01, 12 (66,66%) de MS02 e 7 (41,18%) de AGUA. Animais provenientes de PX foram todos negativos. Amostras positivas enviadas para seqüenciamento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present work had as objective to research in the blood of marsh deer (B. dichotomus), the presence of rickettsial agents DNA such as Ehrlichia chaffeensis, E. ewingii, E. canis, Anaplasma phagocytophilum, A. marginale e Neorickettsia risticii, by the Polimerase Chain Reaction (PCR), as well as studying the prevalence of anti-E. chaffeensis and anti-A. phagocytophilum antibodies using Indirect Imunofluorescence Reaction (IFA). The 143 animals that were used were captured during the development of the Marsh Deer Project (1998 to 2002) in the flood area of the Porto Primavera Hydroelectric Power Station, in Parana River, and divided in four sub-populations according to the local and moment of the capture, in areas denominated MS01, MS02 (Mato Grosso do Sul, before and after flood respectively), PX (Peixe's River, after the first flood quota) and AGUA (Aguapeí River, after flood). In the serological avaliation, the frequency of positive animals for anti-E. chaffeensis and anti-A. phagocytophilum antibodies were 76,76% and 20,20% in MS01, 88,88% and 22,22% in PX, 88,88% and 5,55% in MS02, and 94,12% and 5,88% in AGUA, respectively. In the DNA research, from the 143 tested animals, 61 (42,65%) were positive for E. chaffeensis, 38 (38,38%) from MS01, 4 (44,44%) from PX, 12 from MS02 (66,66% and 7 (41,18%) from AGUA. Positive samples send to sequency demonstrate 100% of similarity with samples of Ehrlichia chaffeensis from Argentina and United States (numbers of access in Genbank EU826516.2 and AF416764.1, respectively). For the A. phagocytophilum genogroup, 70 deers (48,95%) were considered positive. Of these, 51 (51,51%) come from MS01, 12 (66,66%) from MS02 and 7 (41,18%) from AGUA. The animals that come from PX were all negative. Positive samples send to sequencing demonstrated 99% of similarity with a sample of Anaplasma... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ruben Pablo Schocken-Iturrino / Banca: Alessandra Aparecida Medeiros / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Anna Monteiro Correia Lima / Banca: Fernando Antônio de Ávila / Resumo: O presente estudo foi realizado com o intuito de desenvolver o PCR quantitativo para detecção dos níveis de mRNA da toxina botulínica tipo A em palmito. Foram desenhados primers para o gene codificador da toxina botulínica tipo A, os quais apresentaram especificidade e sensibilidade elevadas. Cepas referência de Clostridium botulinum tipo B, C, D, E, F, G e Clostridium butyricum, baratii e argentinense foram utilizadas para verificação da especificidade dos primers sintetizados. Diluições seriadas de cultura da cepa referência de Clostridium botulinum tipo A foram inoculadas em amostras de palmito e separadas em dois grupos: palmito comercial com conservantes e palmito sem conservantes e incubadas a 4°, 25° e 37°C. Alíquotas dessas amostras contaminadas experimentalmente foram submetidas a extração de RNA, para determinação do limiar de detecção da técnica de PCR quantitativo, assim como inoculadas em camundongos para o teste de toxicidade aguda (bioensaio). O bioensaio apresentou sensibilidade característica e detectou a presença da toxina botulínica nas amostras de palmito sem conservantes. No entanto, o PCR quantitativo, apresentou sensibilidade maior que aquela observada no bioensaio, detectando a expressão do gene para BoNT/A (botulinum neurotoxin type A) no tratamento de palmito sem conservantes e no tratamento de palmito comercial incubado a 37°C. Isto evidencia a possível utilização desta técnica no diagnóstico de contaminação de amostras de alimento por C. botulinum tipo A. / Abstract: The present study was realized in order to develop the quantitative assay for the detention of the levei mRNA of the botulinic toxin type A production in palm heart. Primers were designed for the gene encoding the botulinic toxin type A, which showed high specificity and sensitivity. Reference of strains of C. botulinum type S, c, D, E, F, G, C/ostridium butyricum, baratii and argentinense were used for verification of the specificity of the primers synthesized. Serial dilutions culture of the reference strain of C/ostridium botulinum type A were inoculated in the palm heart samples and separated in two groups: commercial palm heart (with preservatives) and palm heart without preservatives and incubated at 4°, 25° and 37°C. Aliquots these contaminated experimentally samples were subjected to extraction of RNA, for determination of the threshold of detection of the technique of quantitative PCR, well as inoculated into mice to test the acute toxicity (bioassay). The bioassay presented its characteristic sensitivity and detected the presence of the botulinic toxin in samples of palm heart without preservatives. However, the quantitative PCR presented greater sensibility than that observed in the bioassay, detecting the expression of the gene for SoNT/A (botulinic neurotoxin type A) in the treatment of palm heart without preservatives and treatment of commercial palm heart incubated at 37°C. This highlights the possible use of this technique in the diagnosis of contamination of samples the food by C. botulinum type A. / Doutor

Orientador: Ciro Moraes Barros / Resumo: Em células da teca e da granulosa, de folículos bovinos, foram detectados quatro transcritos alternativos do receptor do hormônio luteinizante (LHR). Apenas dois deles são traduzidos em proteínas funcionais com afinidades distintas em relação aos ligantes. Em humanos e símios, a isoforma completa ("full-length") tem afinidade pelo LH e hCG, enquanto que a isoforma que apresenta deleção do exon 10 tem afinidade somente pelo hCG. Além disso, isoformas com deleção do exon 3 foram observadas em ratos, embora nenhum outro estudo tenha investigado essa região do gene bovino. Objetivouse com este trabalho caracterizar o padrão da expressão do gene do LHR nas células da teca e da granulosa de folículos antrais bovinos. Ovários foram coletados em matadouro, os folículos (5-14 mm) foram dissecados e as células da teca e da granulosa separadas para extração de RNA total com Trizol. As concentrações de esteróides no fluido folicular foram determinadas por radioimunoensaio (RIE). A expressão gênica do LHR foi mensurada por RTPCR semiquantitativo com oligonucleotídeos iniciadores ("primers") específicos para amplificar o fragmento entre o final da região extracelular e o final da intracelular (LHRBC; "primers" posicionados nos exons 9 e 11). A ocorrência de transcritos alternativos oriundos do início da região extracelular (LHRA; "primers" posicionados nos exons 2 e 9) foi investigada mediante amplificação por RT-PCR. Como controle interno no PCR, utilizou-se a expressão da GAPDH. Paralelamente, células da granulosa cultivadas in vitro foram tratadas com 1 ou 10 ng de FSH no meio de cultura. Mediante RT-PCR, foi investigada a expressão das isoformas do LHRBC nas células da granulosa cultivadas e tratadas com FSH... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Growth of dominant follicle in the absence of circulating FSH and the events following the LH surge that culminate in ovulation, are dependent on the interaction between LH and its receptor (LHR). Four LHR alternative transcripts were described in theca and granulosa cells from bovine follicles. Only two of them can be translated to functional proteins (receptors coupled with G protein) with different affinities to their ligands. In humans and marmosets, the full-length isoform has affinity to both LH and hCG molecules, whereas the isoform with deletion of only exon 10 has affinity to hCG exclusively. Additionally, isoforms with deletion of exon 3 were observed in rats, although no previous report have investigated this region of the bovine gene. The objective of this study was to characterize the pattern of gene expression of the LHR in theca and granulosa cells from bovine antral follicles. Additionally, LHR expression was determined in cultured granulosa cells under FSH treatment. From ovaries collected in abattoir, antral follicles were dissected (5 to 14mm of diameter), and samples of theca and granulosa cells were obtained to total RNA extraction (Trizol protocol). Steroids concentrations in the follicular fluid were determined by RIA. Gene expression of LHR was measured by semiquantitative RT-PCR with specific primers to amplify part of extracellular region (LHRA; primers annealing on exons 2 and 9) and the fragment from the end of extracellular region, including the transmembrane domain and finishing near the end of intracellular region (LHRBC; primers annealing on exons 9 and 11). As internal control of the PCR, it was used GAPDH expression. Cultured granulosa cells were treated with 0, 1 or 10 ng of FSH (3 replicates each dose). As in vivo and positive control, theca cell sample was utilized to comparison... (Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Doutor

Orientador: Oswaldo Durival Rossi Júnior / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Ana Maria Centola Vidal Martins / Banca: Hirasilva Borba / Banca: Angela Cleusa de Fátima Banzatto de Carvalho / Resumo: Tendo em vista a importância da Yersinia enterocolitica e Salmonella spp. como agentes zoonóticos e a carne suína a veiculação, realizou-se o presente estudo objetivando determinar a ocorrência desses agentes na linha de abate de suínos. Para tal, foram analisadas 175 amostras compostas de línguas (L), tonsilas (T), linfonodos submandibulares (LS), linfonodos mesentéricos (LM), carcaças (SC), conteúdo retal (SR) de suínos e de facas (SF) utilizadas pela inspeção. Para a pesquisa de Salmonella spp. utilizou-se a técnica convencional de isolamento e para a de Yersinia enterocolitica, além desta técnica foi empregada a da reação em cadeia da polimerase, com um par de primer específico para a determinação da espécie e outro para a detecção do gene ail. Yersinia enterocolitica foi isolada em 8% das amostras por meio de técnica convencional em L, T, LS, LM e em SF e foi detectada em 4,6% por PCR em L, LM, SC, SR e SF. Salmonella Anatum foi isolada apenas em amostras de língua, correspondendo a 1,2% do total de amostras. O antibiograma revelou 100% dos isolados de Y. enterocolitica resistentes à ampicilina, amoxicilina+clavulanato, cefalotina e imipenem, em menor porcentagem à cefuroxima (92,9%), ceftazidima (85,7%), sulfametoxazol+trimetropim (78,6%), ciprofloxacina (78,6%), amicacina (71,4%) e também gentamicina (71,4%). Todos os isolados de Salmonella Anatum foram resistentes ao meropenen, à oxitetraciclina e à eritromicina. Os resultados destacam a região da cabeça do suíno, especialmente língua, tonsilas e linfonodos, como potenciais disseminadores, principalmente de Yersinia enterocolitica, aos humanos. Além da adoção de práticas de higiene durante as operações de abate, algumas adaptações nos procedimentos de inspeção poderiam contribuir para minimizar o risco de disseminação desses patógenos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Considering the importance of Yersinia enterocolitica and Salmonella spp. as zoonotic pathogens and to the pork their vehiculation, the purpose of the present study was to asses the occurrence of these pathogens on pork slaughter chain. At the swine abattoir, a hundred seventy five samples of tongues (TG), tonsils (TS), submandibular lymph nodes (SL), mesenteric lymph nodes (ML), carcasses (CS) rectal content (RS) and inspection knives (IK) were collected. Traditional isolation method was used to investigate Salmonella spp. and for Yersinia enterocolitica investigation, besides this method was also used a polymerase chain reaction (PCR) method, with specific primer for specie detection and another for ail gene detection. By traditional method, Yersinia enterocolitica was isolated in 8% of the samples in TG, TS, SL, ML and IK and by PCR was detected in 4.6% in TG, ML, CS, RS and IK. Salmonella Anatum was isolated from tongues only, in 1.2% of total samples. The antibiogram showed 100% of Yersinia enterocolitica strains resistant to ampicillin, amoxicillin + clavulanate, cephalothin and imipenem, cefuroxime in lower percentage (92.9%), ceftazidime (85.7%), sulfamethoxazole + trimethoprim (78.6%), ciprofloxacin (78.6%), amikacin (71.4%) and gentamicin (71.4%). All Salmonella Anatum strains were resistant to meropenen, oxytetracycline and erythromycin. The results showed the head region, especially the tongue, tonsils and lymph nodes might represent contamination risks for Yersinia enterocolitica. Besides the hygienic practices during slaughter process, changes in inspection procedures could reduce the risk of spread these pathogens. The results of this study represent an important contribution for public health / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Clarice Weins Arns / Banca: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho / Resumo: A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença infecciosa que está amplamente disseminada entre as criações avícolas brasileiras e é uma das enfermidades virais que mais têm causado perdas econômicas na atualidade. Portanto, a rápida detecção e identificação do agente causal são imprescindíveis para que medidas eficazes de controle sejam prontamente tomadas. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos, rápidos e também de baixo custo. Nesse contexto, a técnica de RTPCR em tempo real abordada no presente estudo permitiu a amplificação de duas regiões de hipervariabilidade do gene S1 de 17 estirpes diferentes do vírus da BIG (VBI), que foram testadas, mas não foi capaz de amplificar nenhum dos RNAvírus heterólogos analisados (vírus da doença de Newcastle, pneumovírus aviário e vírus da doença de Gumboro). Com essa mesma técnica foi possível fazer a diferenciação em grupos geneticamente distintos, de estirpes do VBI através de análises das curvas de dissociação de fragmentos amplificados a partir das regiões de hipervariabilidade gênica I e II do gene S1. A RT-PCR em tempo real desenvolvida apresentou maior sensibilidade na detecção do VBI em amostras teciduais, quando comparada à técnica padrão de Isolamento Viral em ovos embrionados de galinha... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The avian infectious bronchitis virus (IBV) is an infectious disease widely spread in Brazilian commercial poultries where causes significant economical losses. Rapid and accurate diagnosis of the IBV strain involved in a field outbreak is necessary to establish an effective control of this disease. The real-time RT-PCR performed in this study to amplify two hypervariable regions of S1 gene, was able to detect 17 IBV strains, e.g., nine reference strains (including Massachussets, Connecticut, JMK, SE 17 and Iowa serotypes) and eight Brazilian field isolates, whilst non-related avian viral pathogens such as Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Gumboro disease virus were not detected. The differentiation between IBV strains was accomplished using the melting curve analysis of the amplified fragments corresponding to the hypervariable regions I and II of S1 gene. The real-time RT-PCR developed here showed a higher rate of IBV detection in tissue samples of experimentally infected chickens, when compared to the goldstandard technique of Viral Isolation in embryonated chicken eggs, and the same rate of detection was found for the conventional RT-PCR... (Complete abstract, click electronic access below) / Mestre