Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5518.pdf: 1765927 bytes, checksum: 354bfee295ad1873956c15264ad51854 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The photodynamic inactivation (PDI), used for biological control of microorganisms, involves the action of a photosensitizer (PS), activated by visible light, in order to oxidize organic substrates, resulting in cytotoxic effect. The control of free-living amoebae is important both for its pathogenicity and its microorganisms harboring. Additionally, some species may develop serious infections in humans. The present study evaluated the in vitro effectiveness of PDI in Acanthamoeba polyphaga. Salt of curcuminoids, curcumin, methylene blue and Photogem® were used as FS. Besides, this study intended to observe morphological changes caused by the salt of curcuminoids in the microorganism. The samples were grown at 37 ºC in PYG medium for a period of 48 to 72 hours. Curcumin was solubilized in 1 mL DMSO and further diluted in distilled water to obtain final concentrations. The other PS s were directly solubilized in distilled water. The irradiation light-emitting diodes were used at wavelengths 460 and 630 nm at doses of 30 and 50 J/cm2. After treatments, resazurin was added to evaluate the respiratory activity of A. polyphaga and the samples were incubated at 37 °C for 4 hours. The fluorescence intensity was measured in a fluorescence spectrophotometer. In PDI with salt of curcuminoids at concentrations 500, 1000 and 1500 µg/mL, there was a reduction of 27.7%, 61.4% and 82.5% at 30 J/cm2 and 75.2%, 85.0% and 95.9% at 50 J/cm2, respectively. In PDI with curcumin at concentrations 35, 70 and 140 µg/mL, there was a reduction of 16.2%, 24.0% and 25.7% at 30 J/cm2, and 25.4%, 28.3 % and 30.5% at 50 J/cm2, respectively. In PDI with methylene blue at concentrations 24 and 32 µg/mL, there was a reduction of 14.1% and 28.3% at 30 J/cm2, with no reduction in the concentration of 16 µg/mL and 18.7%, 36.9% and 23.9% at 50 J/cm2, respectively. Finally, in PDI with Photogem® at concentrations 50, 100 and 200 µg/mL, there was a reduction of 20.1%, 37.6% and 53.5% at 30 J/cm2, and 17.1%, 38.9% and 57.3% at 50 J/cm2, respectively. The removal of the PS before irradiation showed that the salt of curcuminoids probably didn t stay inside of amoebas, because the reduction obtained previously was not observed in this condition. The PS was toxic to the amoebae in the absence of light, at the concentrations tested, and the isolated use of light showed no phototoxic effect, except the dose of 50 J/cm2 at 460 nm wavelength. The phototoxicity by doses of light together the PS contributed to the death of the amoebae, being more efficient with salt of curcuminoids. The analysis of confocal microscopy images showed that the salt of curcuminoids caused damage in amoebae, confirming its toxicity in the dark. Therefore, it is concluded that contact with only the PS is already able to induce morphological changes in A. polyphaga, leading some of them to death. / A inativação fotodinâmica (IFD), utilizada no controle biológico de microrganismos, envolve a ação de um fotossensibilizador (FS), ativado por luz visível, no intuito de oxidar substratos biológicos, resultando em efeito citotóxico. O controle de amebas de vida livre é importante, tanto pela sua patogenicidade quanto pelo fato de abrigarem microrganismos. Além disso, algumas espécies podem desenvolver sérias infecções em humanos. O presente estudo propôs analisar a efetividade in vitro da IFD em Acanthamoeba polyphaga utilizando sal de curcuminóides, curcumina, azul de metileno e Photogem® como FS, além de observar alterações morfológicas causadas pelo sal de curcuminóides neste microrganismo. As amostras foram cultivadas em meio PYG, incubadas a 37°C por 48 a 72 horas. A curcumina foi solubilizada em 1 mL de DMSO e posteriormente diluída em água destilada para obtenção das concentrações finais. Os demais FS foram solubilizados diretamente em água destilada. Para a irradiação, diodos emissores de luz foram utilizados nos comprimentos de onda 460 e 630 nm, nas doses de 30 e 50 J/cm2. Após os tratamentos, resazurina foi adicionada para avaliar a viabilidade de A. polyphaga, sendo as amostras incubadas a 37°C por 4 horas. A intensidade de fluorescência foi medida em espectrofotômetro de fluorescência. Na IFD com sal de curcuminóides nas concentrações 500, 1000 e 1500 µg/mL, houve redução de 27,7%, 61,4% e 82,5% com 30 J/cm2, e de 75,2%, 85,0% e 95,9% com 50 J/cm2, respectivamente. Já na IFD com curcumina nas concentrações 35, 70 e 140 µg/mL, houve redução de 16,2%, 24,0% e 25,7% com 30 J/cm2, e de 25,4%, 28,3% e 30,5% com 50 J/cm2, respectivamente. Na IFD com azul de metileno nas concentrações 24 e 32µg/mL, houve redução de 14,1% e 28,3% com 30 J/cm2, não havendo redução na concentração de 16 µg/mL e de 18,7%, 36,9% e 23,9% com 50 J/cm2, respectivamente. Por fim, na IFD com Photogem® nas concentrações 50, 100 e 200 µg/mL, houve redução de 20,1%, 37,6% e 53,5% com 30 J/cm2, e de 17,1%, 38,9% e 57,3% com 50 J/cm2, respectivamente. A retirada do FS antes da irradiação mostrou que o sal de curcuminóides provavelmente não permaneceu no interior das amebas, pois a redução obtida anteriormente não foi observada nesta condição. Os FS apresentaram toxicidade para as amebas, na ausência de luz, nas concentrações testadas e o uso isolado da luz não apresentou efeito fototóxico, exceto a dose 50 J/cm2 no comprimento de onda 460 nm. A fototoxicidade proporcionada pelas doses de luz junto aos FS utilizados contribuiu para o efeito de morte das amebas, sendo a IFD eficiente com o sal de curcuminóides. A análise das imagens obtidas pela microscopia confocal mostrou que o sal de curcuminóides causou danos em amebas, confirmando a toxicidade apresentada no escuro. Portanto, conclui-se que apenas o contato com o FS já é capaz de induzir mudanças morfológicas em A. polyphaga, levando algumas células à morte.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work aimed to develop a procedure for disinfecting water by photodynamic inactivation of microorganisms and subsequent removal of photosensitizers. The Escherichia coli photoinactivation was performed using PHLS (Policromatic Halogen Light System) light system irradiation, Methylene Blue and Rose Bengal as photosensitizers, cationic and anionic dyes , respectively. The phase separation between the photosensitizers and the analyzed sample was studied by coagulation, being used the crushed seeds of Moringa oleifera, Chitosan powder and commercial Aluminum Sulphate. All experiments were performed previously in samples of E. coli (ATCC 25922) prepared with a turbidity of about 01 on the Mac Farland scale and later in a sample of effluent from the Sewage Treatment Plant of Uberlândia - MG. The results were quite significant as much photoinactivation as the photosensitizers removal, being Moringa oleifera the best coagulant used, able to remove, from effluent sample, 96.9% Rose Bengal and 75.9% Methylene Blue, both at a concentration of 3,91x10-5 mol L-1. / O presente trabalho visou desenvolver um procedimento para a desinfecção de águas através da inativação fotodinâmica de micro-organismos e posterior remoção dos fotossensitizadores. A fotoinativação de Escherichia coli foi realizada utilizando sistema de irradiação luminosa PHLS (Policromatic Halogen Light System) e Azul de Metileno e Rosa de Bengala como fotossensitizadores, corantes catiônico e aniônico, respectivamente. A separação de fases entre os fotossensitizadores e a amostra analisada foi estudada através de coagulação, sendo utilizadas as sementes de Moringa oleífera trituradas, Quitosana em pó e Sulfato de alumínio comercial. Todos os experimentos foram realizados previamente em amostras de E. coli (ATCC: 25922) preparadas com turvação de aproximadamente 01 na escala de Mac Farland e posteriormente em amostra de efluente proveniente da Estação de Tratamento de Esgoto de Uberlândia - MG. Os resultados obtidos foram bastante expressivos tanto na fotoinativação, quanto na remoção dos fotossensitizadores, sendo a Moringa oleífera o melhor coagulante utilizado, tendo conseguido remover da amostra de efluente 96,9% do Rosa de Bengala e 75,9% do Azul de Metileno, ambos em uma concentração de 3,91x10-5 mol L-1. / Mestre em Química

No período compreendido entre os meses de Maio de 2010 e Dezembro de 2011 realizou-se, nos laboratórios de Higiene e Qualidade de Alimentos, de Microbiologia e Bromatologia e de Bioquímica e Microbiologia Aplicada do Instituto de Ciências e Tecnologia de Alimento (ICTA) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), experimentos com vista à quantificação de compostos fenólicos e à avaliação da atividade antibacteriana de dois acessos de batata-doce (Ipomoea batatas L. (Lam)) com objetivo de (i) avaliar a atividade antibacteriana nestes acessos perante padrões bacterianos de interesse em alimentos, (ii) determinar a quantidade de compostos fenólicos e (iii) estabelecer a relação entre a composição e quantidade de compostos fenólicos e a atividade antibacteriana nestes diferentes acessos. Com o material colhido em Porto Alegre, Santo Antônio de Patrulha, Palmares do Sul e Cerro grande do Sul, utilizou-se o método de diluição em sistema de tubos múltiplos para avaliar a intensidade de atividade antibacteriana dos diferentes extratos expressa como intensidade de atividade de inibição bacteriana (IINIB) e intensidade de atividade de inativação bacteriana (IINAB); o teor de polifenóis totais foi determinado pelo método de Folin & Ciocalteu, enquanto que a determinação do conteúdo de antocianinas foi efetuada usando o método de pH diferencial. O coeficiente de correlação de Pearson foi usado para estabelecer a relação entre os teores de polifenóis e a atividades antibacteriana. Os extratos alcoólicos inibiram e/ ou inativaram inóculos de Salmonella Enteritidis (ATCC 11076), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 11229) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923), não obstante esta úlima ser significativamente mais resistente. A intensidade de atividade de inibição e/ ou inativação está positivamente relacionada à concentração de compostos fenólicos, ou seja, os compostos fenólicos e/ ou antocianinas seriam responsáveis pelo menos por parte da atividade antibacteriana dos extratos testados nas condições deste experimento. Extratos tidos por decocção e infusão, além de apresentarem concentrações muito baixas de antocianinas, não apresentaram atividade antibacteriana e mostraram menores teores de polifenóis do que os seus correspondentes extratos alcoólicos, sugerindo que o calor da infusão e/ ou decocção provavelmente teria degradado as substâncias essenciais que tomam parte no processo de atividade antimicrobiana. / In the period between the months of May 2010 and December 2011 was held in the laboratories of Higiene and Food Quality, Microbiology and Bromatology and Biochemistry and Applied Microbiology of the Institute for Food Science and Technology (ICTA) of the Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), experiments for the evaluation of antibacterial activity and the quantification of phenolic compounds in two accessions of sweet potato (Ipomoea batatas L. (Lam) in order to (i) evaluate the antibacterial activity in these accessios against interest food bacteria, (ii) determine the quantity of phenolic (iii) establish the relationship between the composition and quantity of phenolic compounds and the antibacterial activity in these different accessions. With material collected in Porto Alegre, Santo Antônio de Patrulha, Palmares do Sul and Cerro Grande do Sul, the method of dilution in system of multiple-tube tests was used to evaluate the intensity of antibacterial activity of different extracts express as intensity of bacterial inhibition activity (IINIB) and intensity of bacterial inativation activity (IINAB); the total phenolic content was determined by the method of Folin & Ciocalteu, while the content of antocianinas was performed using the differential pH method. The Pearson correlation coefficient was used to establish the relationship between the levels of polyphenols and antibacterial activity. The alcoholic extracts inhibited and/or inactivated inocula of Salmonella Enteritidis (ATCC 11076), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 11229) and Staphylococcus aureus (ATCC 25923), although this this last was significantly tougher. The intensity of inhibition and/or inactivation activity is positively related to the concentration of phenolic compounds, ie, phenolic compounds and/or anthocyanins are responsible for at least, part of the antibacterial activity of the extracts tested in this experiment. Extracts got from decoction and infusion besides having very low concentrations of anthocyanins, showed no antibacterial activity and had lower levels of polyphenols than their corresponding alcoholic extracts, suggesting that the higher temperature used for infusion and/or decoction, would probably degraded essential substances taking part in the process of antimicrobial activity.

Devido à grande preocupação com a geração de novas tecnologias mais ágeis, eficientes e de baixo custo, as reações fotodinâmicas (RF) têm ganhado destaque. Estas envolvem a ativação de um fármaco fotossensível (fotossensibilizador (FS)), pela iluminação em uma faixa específica de comprimentos de onda, gerando assim espécies reativas altamente citotóxicas levando as células à morte. As RF são divididas em duas categorias: terapia fotodinâmica (TFD) e inativação fotodinâmica (IFD). A primeira é utilizada para tratamentos oncológicos, dermatológicos, entre outros. A segunda é utilizada para descontaminação de micro-organismos em infecções localizadas. Atualmente a IFD tem sido alvo de muitos estudos pois tem diversas vantagens quando comparadas com as técnicas de descontaminação atuais. Duas das mais importantes são: a seletividade e a não geração de micro-organismos resistentes aos FSs. Apesar desta técnica ser utilizada com sucesso em diversos campos, ela ainda apresenta baixa eficiência quando comparada às técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi criar um novo protocolo de aplicação da IFD visando o aumento de eficiência, bem como um estudo profundo das interações dos FSs com as células, e o monitoramento da dinâmica do FS nestas. O presente estudo utiliza-se de células da levedura Candida albicans e demonstra a interação destas células com dois FSs: Photogem® e Curcumina. Foi proposto um novo protocolo que promove o aumento da internalização de FS pelas células baseado na pré-iluminação de baixa dose durante o tempo de incubação. Foi possível demonstrar através da medida dos espectros de absorção do sobrenadante de uma solução com células e Photogem®, que as amostras que tiveram pré-iluminação internalizaram mais FS do meio do que as células mantidas no escuro. Além disso, a partir de ensaios de viabilidade com a levedura e o Photogem® foi demonstrado que as amostras que tiveram pré-iluminação apresentaram diminuição de até seis ordens de grandeza nas unidades formadoras de colônia quando comparadas com as amostras tratadas pelo protocolo tradicional de IFD. Através das técnicas de microscopia confocal de fluorescência e de imagem de tempo de vida de fluorescência foi possível compreender a interação entre os FSs e as células, bem como estudar a ligação deste FS em diferentes regiões da célula. Além disso, foi estudada ainda a mobilidade destas moléculas dentro das células sob condições com e sem iluminação de baixa dose. Através deste estudo pôde-se inferir que as moléculas de curcumina tem tempos característicos de entrada nas células mais lentos que os tempos característicos do Photogem®. Ainda foi possível tomar vantagem da fluorescência do Photogem® para monitorar a entrada deste nas células de levedura, bem como monitorar a formação do seu fotoproduto, determinando assim que 7,5 minutos é o tempo médio de iluminação durante a incubação com FS necessário para que pelo menos 80% das células tivessem o FS internalizado, sem significante formação de fotoprodutos. Conclui-se ainda que este novo protocolo de incubação com iluminação leva a maior eficiência e seletividade da IFD, abrindo caminho para uma nova linha de pesquisa nas RF em geral, possivelmente podendo este protocolo ser aplicado em diversos tipos de células. / In the last years, due to the increasing need of generation of novel faster and cheaper technologies, the photodynamic reactions (PR) have been highlighted. These reactions involves the activation of a photosensitive drug, named photosensitizer (PS), by light in proper spectral window and generation of highly cytotoxic reactive species, leading cells to death. The photodynamic reactions may be divided in two categories: photodynamic therapy (PDT) and photodynamic inactivation (PDI). The first one is performed in order to treat oncologic, dermatologic and other diseases, whereas the second one is employed in the decontamination of microorganisms in localized infections. When compared with existing decontamination techniques, PDI has several advantages, among which two of the most important are its selectivity of the PS that acts only at the delivered site, as well as not inducing antibiotic resistance, for such reasons are subjected of many current studies. Althought this technique has been performed with great success in many fields, it still has a lack of efficiency. In this context, the purpose of this study was create a new application protocol of this technique in order to increase the efficiency, as well as understand the interactions of the PS with the cells and monitoring the drug dynamic in cells. In this study, Candida albicans cells were utilized and the interaction of two PSs (Photogem® and Curcumin) were demonstrated. A new protocol which promotes an increase of the PS cells uptake was proposed, this protocol is based on the low dose illumination during the incubation time. By measuring absorption spectra of the supernatant of two solutions with cells and Photogem®, in which in one of them were applied a low dose light, was demonstrated that the illuminated cells had an uptake increased when compared with the sample kept in the dark. Moreover, viability assays with the Photogem® and the cells proved that the cells that receive low dose light in the incubation stage had more damage in the PDI, showing a decrease of six orders of magnitude when compared with the traditional PDI. Through confocal and lifetime fluorescence microscopy techniques it was possible not only to comprehend the interaction between the PS and cells, as well as to study the binding of this molecules in different regions of the cells. Furthermore, the mobility of the PS molecules inside the cells was studied in conditions of illumination and dark, it could be inferred that the curcumin molecules has higher characteristic time than Photogem® molecules. Monitoring the cell Photogem® uptake, and the photoproduct formation was possible by take advantage of the PS fluorescence. Thus it was possible to determine the average illumination time (7.5 minutes) during the incubation time so at least 80% of the cells had the PS internalized, without much generation of photoproducts. It follows also that this new incubation protocol with low dose illumination leads to greater efficiency of PDI, so this study leads a new field of research in overall photodynamic reaction.

O crescente número de bactérias resistentes é devido principalmente ao número limitado de modos de ação dos antibióticos, contra os quais bactérias criam mecanismo de resistência. Há, portanto, necessidade de terapias com espectro de ação mais amplo, atingindo diferentes alvos moleculares. A inativação fotodinâmica (IFD) pode ser uma dessas terapias, pois baseia-se na geração de espécies reativas que atacam diversas moléculas, e não um alvo específico. Fotossensibilizadores (FSs) absorvem luz em comprimento de onda específico e a energia absorvida pode ser transferida a um oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio (EROs). Tais espécies são altamente citotóxicas e produzem reações de oxidação que levam à morte celular. Um dos alvos das EROs são fosfolipídios insaturados das membranas biológicas. O objetivo desta dissertação é investigar a interação dos FSs curcumina e azul de metileno com fosfolipídios e o efeito da foto-ativação desses FSs em um mimético de membrana bacteriana. Para tanto, foram usados filmes de Langmuir do extrato lipídico de Escherichia coli e dos lipídios sintéticos isolados DOPE, POPG e cardiolipina. As isotermas de pressão com o extrato de E coli indicam interação entre os FSs e os lipídios do filme, aumentando a área ocupada. A irradiação do filme na presença de curcumina aumenta sua estabilidade, o que sugere formação de hidroperóxidos de lipídio, mais hidrofílicos, pela ação do oxigênio singleto. Nos filmes dos lipídios isolados só a curcumina é incorporada, havendo aumento na área ocupada pelo filme, e redução no potencial de superfície. Nenhum efeito decorrente da irradiação desses filmes foi detectado. Um filme Langmuir-Blodgett (LB) de extrato de E. coli com curcumina foi submetido a quatro ciclos de fotoclareamento seguido de recuperação da fluorescência visualizados num microscópio confocal. A intensidade da fluorescência aumentou após o primeiro ciclo, indicativo de mudança conformacional para alocar maior quantidade de curcumina, o que corrobora a hipótese da formação de hidroperóxidos. / The growing number of resistant bacteria is mainly due to the limited number of modes of action of antibiotics, against which bacteria create resistance. There is, therefore, a need for therapies with broader action spectrum, reaching different molecular targets. Photodynamic inactivation (PDI) may be one of these therapies, because it is based on the generation of reactive species that attack several molecules, not a specific target. Photosensitizers (FSs) absorb light at a specific wavelength and the absorbed energy can be transferred to a molecular oxygen, generating reactive oxygen species (ROS). Such species are highly cytotoxic and produce oxidation reactions that lead to cell death. One of the targets of ROS are unsaturated phospholipids from biological membranes. The objective of this dissertation is to investigate the interaction of the FSs curcumin and methylene blue with phospholipids and the effect of photoactivation of these FSs on a bacterial membrane mimetic. For this purpose, Langmuir films of the lipid extract of Escherichia coli and the synthetic lipids DOPE, POPG and cardiolipin were used. The surface pressure isotherms with the E. coli extract indicate interaction between the FSs and the lipids of the film, increasing the occupied area. The irradiation of the film in the presence of curcumin increases its stability, which suggests the formation of more hydrophilic lipid hydroperoxides by the action of singlet oxygen. In the synthetic lipid films only curcumin is incorporated, with increase in the area occupied by the film, and reduction in surface potential. No effect from irradiation of these films was detected. A Langmuir-Blodgett (LB) film of E. coli extract with curcumin was submitted to four cycles of photobleaching followed by fluorescence recovery visualized in a confocal microscope. The intensity of the fluorescence increased after the first cycle, indicative of conformational change to allocate a larger amount of curcumin, which corroborates the hypothesis of hydroperoxide formation.

Neste trabalho, foram determinadas as propriedades dielétricas e a condutividade elétrica de quatro tipos leite (leite humano e 3 tipos de leite vaca - cru, integral e semi-desnatado) e de três fórmulas infantis (FIs) empregando a técnica de cabo coaxial de ponta aberta. As medições das propriedades dielétricas foram realizadas na faixa de frequência de (500 a 3000) MHz e em temperaturas de (5 a 90) ºC. O comportamento dielétrico de todos os tipos de leite e das FIs foi caracterizado por dois mecanismos principais (condução iônica e rotação dipolar), que se mostraram dependentes da frequência e da temperatura. Também foi estudada a inativação da enzima fosfatase alcalina (ALP), presente em leite de vaca e humano, utilizando um reator de micro-ondas focalizadas em processo térmico descontínuo. Durante o processamento, por meio de um sensor de fibra óptica, em contato direto com o leite, foram obtidos os históricos de temperatura dos quais os parâmetros cinéticos D e z foram calculados no intervalo de temperatura de (50 a 80) ºC e tempos de (15, 30, 45, 60, 180 e 300) s. A inativação térmica da ALP obedeceu a cinética de primeira ordem e os parâmetros cinéticos determinados foram: z = 4,4 ºC e D70ºC = 1,1 s para o leite humano e z = 7,4 ºC e D70ºC = 44,3 s para o leite de vaca tipo B. Os resultados desse estudo mostraram que o tratamento térmico assistido por micro-ondas, na condição ótima de 60 ºC por 30 s, foi eficiente na inativação de micro-organismos patogênicos (Staphylococcus aureus e Salmonella) e na preservação do perfil de ácidos graxos em leite humano. Além disso, o tratamento térmico assistido por microondas resultou em menores perdas de proteínas, como as imunoglobulinas e lactoferrina, quando comparado ao processamento térmico convencional (Holder), utilizado nos Bancos de Leite Humano (BLH), demonstrando que pode ser considerado uma tecnologia alternativa para o processamento de alimentos líquidos. / In this work, the dielectric properties and electrical conductivity of four types of milk (human milk and 3 types of cow milk - raw, whole and low-fat) and three infant formulae (IFs) were measured using the open-ended coaxial method. The measurements of the dielectric properties were performed at frequency range from (500 to 3000) MHz and temperatures from (5 to 90) ºC. The dielectric behavior of all types of milk and IFs was characterized by two main mechanisms (ion conduction and dipole rotation), which showed dependency in relation to frequency and temperature. The inactivation of alkaline phosphatase (ALP), present in cow and human milk, was also studied using a microwave reactor focused on a batch process. During the processing, by means of a fiber optic sensor, the temperature histories were obtained from which the kinetic parameters D and z were calculated at temperature range from (50 to 80) °C and times from (15, 30, 45, 60, 180 and 300) s. The thermal inactivation of the ALP followed the first-order kinetics and the kinetic parameters determined were: z = 4.4 °C and D70°C = 1.1 s for human milk and z = 7.4 °C and D70 °C = 44.3 s for the type B cow\'s milk. The results of this study showed that microwave-assisted heating, under optimum condition (60 ºC for 30 s), was efficient for inactivation pathogenic microorganisms (Staphylococcus aureus and Salmonella) and preservation of fatty acids profile in human milk. In addition, microwave-assisted heating resulted in lower losses of important proteins, such as immunoglobulins and lactoferrin, compared to conventional thermal processing (Holder), used in Human Milk Banks (BLH), demonstrating that it can be considered an alternative technology for the processing of liquid foods.

No período compreendido entre os meses de Maio de 2010 e Dezembro de 2011 realizou-se, nos laboratórios de Higiene e Qualidade de Alimentos, de Microbiologia e Bromatologia e de Bioquímica e Microbiologia Aplicada do Instituto de Ciências e Tecnologia de Alimento (ICTA) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), experimentos com vista à quantificação de compostos fenólicos e à avaliação da atividade antibacteriana de dois acessos de batata-doce (Ipomoea batatas L. (Lam)) com objetivo de (i) avaliar a atividade antibacteriana nestes acessos perante padrões bacterianos de interesse em alimentos, (ii) determinar a quantidade de compostos fenólicos e (iii) estabelecer a relação entre a composição e quantidade de compostos fenólicos e a atividade antibacteriana nestes diferentes acessos. Com o material colhido em Porto Alegre, Santo Antônio de Patrulha, Palmares do Sul e Cerro grande do Sul, utilizou-se o método de diluição em sistema de tubos múltiplos para avaliar a intensidade de atividade antibacteriana dos diferentes extratos expressa como intensidade de atividade de inibição bacteriana (IINIB) e intensidade de atividade de inativação bacteriana (IINAB); o teor de polifenóis totais foi determinado pelo método de Folin & Ciocalteu, enquanto que a determinação do conteúdo de antocianinas foi efetuada usando o método de pH diferencial. O coeficiente de correlação de Pearson foi usado para estabelecer a relação entre os teores de polifenóis e a atividades antibacteriana. Os extratos alcoólicos inibiram e/ ou inativaram inóculos de Salmonella Enteritidis (ATCC 11076), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 11229) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923), não obstante esta úlima ser significativamente mais resistente. A intensidade de atividade de inibição e/ ou inativação está positivamente relacionada à concentração de compostos fenólicos, ou seja, os compostos fenólicos e/ ou antocianinas seriam responsáveis pelo menos por parte da atividade antibacteriana dos extratos testados nas condições deste experimento. Extratos tidos por decocção e infusão, além de apresentarem concentrações muito baixas de antocianinas, não apresentaram atividade antibacteriana e mostraram menores teores de polifenóis do que os seus correspondentes extratos alcoólicos, sugerindo que o calor da infusão e/ ou decocção provavelmente teria degradado as substâncias essenciais que tomam parte no processo de atividade antimicrobiana. / In the period between the months of May 2010 and December 2011 was held in the laboratories of Higiene and Food Quality, Microbiology and Bromatology and Biochemistry and Applied Microbiology of the Institute for Food Science and Technology (ICTA) of the Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), experiments for the evaluation of antibacterial activity and the quantification of phenolic compounds in two accessions of sweet potato (Ipomoea batatas L. (Lam) in order to (i) evaluate the antibacterial activity in these accessios against interest food bacteria, (ii) determine the quantity of phenolic (iii) establish the relationship between the composition and quantity of phenolic compounds and the antibacterial activity in these different accessions. With material collected in Porto Alegre, Santo Antônio de Patrulha, Palmares do Sul and Cerro Grande do Sul, the method of dilution in system of multiple-tube tests was used to evaluate the intensity of antibacterial activity of different extracts express as intensity of bacterial inhibition activity (IINIB) and intensity of bacterial inativation activity (IINAB); the total phenolic content was determined by the method of Folin & Ciocalteu, while the content of antocianinas was performed using the differential pH method. The Pearson correlation coefficient was used to establish the relationship between the levels of polyphenols and antibacterial activity. The alcoholic extracts inhibited and/or inactivated inocula of Salmonella Enteritidis (ATCC 11076), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 11229) and Staphylococcus aureus (ATCC 25923), although this this last was significantly tougher. The intensity of inhibition and/or inactivation activity is positively related to the concentration of phenolic compounds, ie, phenolic compounds and/or anthocyanins are responsible for at least, part of the antibacterial activity of the extracts tested in this experiment. Extracts got from decoction and infusion besides having very low concentrations of anthocyanins, showed no antibacterial activity and had lower levels of polyphenols than their corresponding alcoholic extracts, suggesting that the higher temperature used for infusion and/or decoction, would probably degraded essential substances taking part in the process of antimicrobial activity.

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental (paterna ou materna), está envolvido no desenvolvimento placentário. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se vários genes importantes para o desenvolvimento fetal e da placenta, os quais são regulados por duas principais regiões controladoras de imprinting (ICR1 e 2) onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1, respectivamente. O imprinting genômico e a inativação aleatória do cromossomo X são processos epigenéticos presentes em mamíferos placentários. O presente trabalho teve como objetivo principal verificar a presença de mosaicismo do perfil epigenético entre tecidos extraembrionários de estágios precoces da gravidez (primeiro trimestre), e em vilosidade coriônica de placentas a termo (terceiro trimestre). Foram coletadas amostras de 10 gestações de primeiro trimestre (vilosidade coriônica, âmion, membrana de cordão umbilical e tecido embrionário) e 14 de terceiro trimestre (vilosidade coriônica), das quais 10 foram consideradas como controles e quatro utilizadas para estudo de mosaicismo restrito à vilosidade coriônica (coleta de amostras de todos os cotilédones). Após extração do DNA, foi utilizado o Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real para o estudo do padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em diferentes tecidos do primeiro trimestre gestacional e em tecido placentário do terceiro trimestre. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado em todos os cotilédones de duas placentas a termo, de fetos do sexo feminino, por meio do ensaio do receptor de andrógeno humano (HUMARA assay), utilizando eletroforese capilar, e com acréscimo de um novo marcador de inativação do cromossomo X (ICX1). Na análise estatística foram utilizados o teste t não pareado, teste de Turkey e teste t pareado. A média de metilação da KvDMR1 das amostras de vilosidade coriônica do primeiro trimestre gestacional foi estatisticamente diferente da média de metilação do terceiro trimestre. Enquanto que a metilação da H19DMR não apresentou diferença estatística entre amostras de vilosidade coriônica do primeiro e do terceiro trimestre gestacionais. Com relação ao mosaicismo, a KvDMR1 não apresentou variação com relação ao tamanho ou a posição dos cotilédones, enquanto que a H19DMR apresentou diferença estatisticamente significativa na média de metilação com relação ao tamanho dos cotilédones e ao posicionamento nos quadrantes; em consequência da hipometilação em cotilédones pertencentes a uma das placentas estudadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na média de metilação da KvDMR1 e da H19DMR entre diferentes tecidos das amostras do primeiro trimestre gestacional. No entanto, a comparação entre tecidos pareados de um mesmo indivíduo mostrou que a metilação não é correspondente entre os tecidos. Os dados obtidos mostram que o imprinting genômico provavelmente é um processo dinâmico, que evolui ao longo da gestação, estando relacionado a formação e ao amadurecimento da placenta. No presente estudo foi possível verificar que cotilédones de uma mesma placenta apresentam diferentes padrões de inativação do cromossomo X. Diferenças que podem ser explicadas pela expansão clonal das células trofoblásticas progenitoras com o cromossomo X paterno ou o cromossomo X materno inativo. Devido à variabilidade epigenética, exames em tecidos placentários devem considerar as diferenças intra-placentárias e as diferenças entre tecidos embrionários e extraembrionários. / Genomic imprinting, a mechanism of allele-specific expression depending on parental origin, is an epigenetic process that regulates the expression of many genes involved in placental development. Several important genes for fetal and placental growth are located on the human chromosome region 11p15.5, which are regulated by two imprinting control regions (ICR1 e 2), which have the differentially methylated regions H19DMR and KvDMR1, respectively. Genomic imprinting and random inactivation of X chromosome are two epigenetic processes present in placental mammals. The present study aimed to verify the presence of epigenetic mosaicism between extra-embryonic and embryonic tissues from early stages of pregnancy (first trimester), and in chorionic villi of term placentas (third trimester). Samples were collected from 10 pregnancies in the first trimester (chorionic villous, amnion, umbilical cord membrane, and embryonic tissue) and 14 from third trimester (chorionic villus sampling), of which 10 were considered as controls and four used to study mosaicism restricted to chorionic villi (sampling of all cotyledons). After DNA extraction, we used real time PCR associated to enzymatic restriction with a methylation sensitive enzyme to study the methylation pattern of KvDMR1 and H19DMR in different tissues from first trimester and placental third trimester tissue. The pattern of X chromosome inactivation was evaluated in all cotyledons from two term placentas of female fetuses, using the human androgen receptor (HUMARA) assay, capillary electrophoresis, and adding a new X chromosome inactivation (ICX1) marker. Unpaired and paired t and Turkey tests were used in statistical analysis. The average methylation of KvDMR1 of chorionic villi samples in first trimester was statistically different from average methylation of the third trimester. While the methylation of H19DMR showed no statistically significant difference between chorionic villi samples in the first and third trimester of pregnancy. In relation to the mosaicism, the KvDMR1 methylation did not vary in respect to the size or position of the cotyledons, while H19DMR showed statistically significant difference in average methylation relative to the size of the cotyledons, to the position in quadrants, due to the hypomethylation in cotyledons from one studied placenta. There were no statistically significant differences in the mean methylation KvDMR1 and H19DMR among different tissues from the first trimester of pregnancy, however, the comparison between paired tissues from the same individual showed that the methylation is different between tissues. The data from this study showed that genomic imprinting is probably a dynamic process and evolved across human pregnancy. This process is probable connected to placenta formation and maturation. We observed different patterns of X chromosome inactivation in cotyledons from the same placenta. This difference could be explained by clonal expansion of a limited number of trophoblastic progenitor cells with either an inactive maternal or paternal X chromosome. Due to the epigenetic variability, placental tissue examinations must consider the differences intra-placental and differences between embryonic and extra-embryonic tissues.

Este trabalho teve o objetivo de estimar a frequência de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X entre pacientes do sexo masculino, que constituem casos isolados de deficiência mental. A estratégia adotada foi a determinação do padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados, com base (a) nas indicações de que desvios extremos do padrão casual de inativação do cromossomo X têm alta probabilidade de estar relacionados à presença de mutações do cromossomo X e (b) na observação de que a frequência desses desvios está significantemente aumentada em mulheres certamente portadoras de mutações que causam deficiência mental de herança ligada ao X. A vantagem seletiva das células que possuem o alelo não mutado no cromossomo X ativo é uma explicação para tais desvios extremos da inativação do cromossomo X, raramente encontrados na população geral. Selecionamos 115 meninos portadores de deficiência mental moderada a grave associada a outros sinais clínicos, não característicos de síndrome conhecida e que tinham cariótipos normais e teste negativo para a síndrome do cromossomo X frágil; suas genitoras concordaram com a participação no estudo. Esses pacientes foram encaminhados ao Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, por diferentes serviços médicos, para diagnóstico e orientação quanto a riscos de recorrência na família. O padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados foi investigado, com base na metilação diferencial dos alelos do gene AR (Androgen Receptor gene) , no cromossomo X ativo e inativo. As mães de 100 desses meninos se revelaram heterozigóticas quanto à repetição polimórfica CAG do gene AR, requisito do teste para determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Onze mulheres (11%) apresentaram desvios extremos do padrão de inativação do X (≥ 98:2), frequência significativamente maior (P = 0.0001; teste exato de Fisher) do que aquela que a literatura registra, em estudo utilizando o mesmo ensaio, entre mulheres adultas da população geral (0,017; IC 95% = 0,007 0,034). A raridade de desvios tão extremos na população geral permite admitir que as mães dos afetados que apresentam tais desvios sejam portadoras de mutação no cromossomo X, que causa a deficiência mental em seus filhos. Sendo assim, estimamos em 11% a frequência de deficiência mental em nossa amostra de 100 meninos casos isolados de deficiência mental (IC 95% = 0,056 0,188), sem incluir a síndrome do X frágil, responsável por 2,5% a 3% da deficiência mental no sexo masculino. Essa nossa estimativa para a proporção de deficiência mental moderada grave ligada ao X entre indivíduos do sexo masculino com DM é da mesma ordem de grandeza daquelas relatadas na literatura, baseadas (a) na frequência da síndrome do X frágil em coortes de homens com deficiência mental e entre famílias com deficiência mental de herança ligada ao X ou (b) nas inferências da prevalência de deficiência mental e de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X na população geral masculina. Entretanto, a frequência por nós determinada deve ser uma subestimativa, considerando que os desvios extremos do padrão de inativação ocorrem em apenas um terço das portadoras obrigatórias de mutações que causam deficiência mental com herança ligada ao X. Com base nos resultados deste estudo, consideramos indicada a avaliação do padrão de inativação do cromossomo X em mães de indivíduos do sexo masculino, casos isolados de deficiência mental. A detecção de desvio extremo da inativação deve ser considerada indicativa de deficiência mental de herança ligada ao X, constituindo subsídio para o aconselhamento genético da família e podendo levar á identificação da mutação causadora da deficiência mental. / Nearly a third of obligate carriers of mutations causative of X-linked mental retardation (XLMR) have been reported to have extreme X-inactivation skewing in peripheral blood cells, compared to their non-carrier relatives. Selective advantage of cells with the non-mutated allele on the active X chromosome would explain this skewing. Based on these findings, we used the pattern of X-inactivation in mothers of mentally retarded boys, as a parameter to evaluate the frequency of XLMR among non-familial cases. To determine the X-inactivation pattern in these women, we investigated the methylation status of the AR (Androgen Receptor) alleles in blood cells. We selected 115 boys with moderate to severe mental retardation of unknown cause, who had normal karyotypes and tested negative for fragile X syndrome; the mothers of 100 of these boys were found to be heterozygous for the polymorphic CAG repeat of the AR gene, a requisite of the X-inactivation assay. Eleven women (11%) had extremely skewed X-inactivation (≥ 98:2), a frequency significantly higher (P = 0.0001; Fisher exact test) than the frequency reported for adult women from the general population (1.7%; 95% CI = 0.007 0,034). Assuming that every mother with extremely skewed X-inactivation is a carrier of an X-chromosome mutation that causes mental retardation in her son, the frequency of XLMR in our sample of 100 boys is 11% (95% CI = 0,056 0,188), the fragile X syndrome being excluded. Although these figures are quite in agreement with previous estimations of the frequency of XLMR among mentally retarded men, they might be an underestimation, when it is taken into account that only about a third of obligate carriers of XLMR mutations have highly skewed X inactivation.

Orientador: Prof. Dr. Anderson Orzari Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, Santo André, 2017. / Neste trabalho apresentamos a sintese e caracterizacao de derivados de xantenos para emprego como fotossensibilizadores em Terapia Fotodinamica. A sintese de 08 diferentes compostos foi realizada utilizando-se o alcool resorcinol e derivados do anidrido ftalico, na presenca de ZnCl2. Foram utilizadas tecnicas como RMN de 1H, FTIR, espectrometria de massas para comprovar as estruturas e a pureza dos compostos sintetizados. Em solucao aquosa, empregando tecnicas para obter os espectros de absorcao, excitacao e emissao na regiao do UV-vis, foi possivel observar que os compostos apresentam altos valores de coeficiente de absortividade molar, baixos valores de rendimento quantico de fluorescencia (¿¶F) e alto valores de oxigenio singlete (¿¶¿'), conjunto de propriedades estas que os tornam interessantes compostos para serem estudados como fotossensibilizadores em TFD. No processo de Inativacao Fotodinamica os compostos apresentaram bons resultados para microorganismos Gram-positivos, apresentando alta taxa de inibicao no crescimento de suas colonias e ate mesmo a morte destes no caso dos derivados halogenados. / In this work we present the synthesis and characterization of xanthenes for application as photosensitizers in Photodynamic Therapy. The 08 compounds studied were synthesized by reaction of phthalic anhydride derivatives with resorcinol and ZnCl2 and were characterized by spectroscopic and spectrometric techniques such as FTIR, 1H NMR and UV-vis. The fluorescence quantum yield (....), and singlet oxygen quantum yield (....) in biological media indicate that these compounds are good candidates for photosensitizers. In the Photodynamic Inactivation, the compounds presented good results for Gram-positive microorganisms, with high inhibition rate in the growth and death, in the case of halogenated derivatives.