La galactosémie congénitale est une maladie métabolique affectant la voie du galactose. En effet, l'enzyme responsable de la transformation du galactose-1-phosphate en glucose-1-phosphate, la galactose-1-phosphate uridyltransférase, est déficiente et rend donc l'utilisation du galactose par l'organisme quasiment impossible. Ceci entraîne une accumulation de galactose ainsi que ses produits dérivés, le galactose-1-phosphate et le galactitol. Ainsi, notre hypothèse de travail est que les métabolites impliqués dans cette pathologie provoquent des modifications post-traductionnelles des protéines induisant ainsi leur vieillissement prématuré. Nous avons donc étudié l'impact de la « galactation » sur la structure du collagène de type I et montré que ces modifications structurales sont beaucoup plus importantes avec le galactose qu'avec le glucose à la même concentration, aussi bien sur la structure primaire que fibrillaire. Au contact du collagène « galacté », les fonctions des cellules inflammatoires sont modifiées. La technique de spectroscopie infrarouge a été utilisée pour caractériser les métabolites impliqués dans la galactosémie ainsi que les collagènes modifiés. Dans un but de dépistage, une étude en spectroscopie infrarouge de plasmas galactosémiques nous a permis de mettre en évidence le potentiel de cette technique, du fait de sa bonne sensibilité et de son faible coût de revient. En conclusion, les modifications post-traductionnelles des protéines semblent très fortement impliquées dans la physiopathologie de la galactosémie congénitale. / The congenital galactosemia is a metabolic disease involved in the galactose pathway. Indeed, the enzyme responsible of the galactose-1-phosphate transformation in glucose-1-phosphate, the galactose-1-phosphate uridyltransferase, is deficient and then leads to a use of galactose almost impossible. This leads to an accumulation of galactose and its derived products, the galactose-1-phosphate and the galactitol. Thus, our work hypothesis is that metabolites involved in this disease cause post-translational modifications of proteins inducing their premature aging. We then studied the impact of the « galactation » on the type I collagen and showed that the structural modifications are more important with galactose than with glucose at the same concentration, on both the primary and the fibrillar structure. On contact with « galacted » collagen, the inflammatory cells functions are also modified. The infrared spectroscopy technique has been used to characterize the metabolites involved in the galactosemia, just as the modified collagens. With the aim of screening, an infrared spectroscopy study of galactosemic plasmas allowed us to highlight the potential of this technique, with its good sensibility and its low cost price. To conclude, the post-translational modifications of proteins seem strongly involved in the physiopathology of the congenital galactosemia.

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une sécrétion exagérée de cytokines pro-inflammatoires, une hyperactivation des lymphocytes T effecteurs (Teff) et un contrôle insuffisant par les lymphocytes T régulateurs (Treg). Nous avons montré que le traitement par anti-TNFbetas'accompagne d'une augmentation significative des Treg Foxp3+ dans le sang de patients atteints de MICI en poussée. L'infliximab est associé à une potentialisation de leur fonction suppressive. Dans un 2ème travail nous montrons que les Treg sont incapables de prévenir la colite même s'il existe une augmentation du nombre de Treg dans les ganglions mésentériques ainsi qu'une majoration du nombre et de la fonction suppressive ex-vivo des Treg issus du colon inflammatoire. Cet impact fonctionnel positif sur les Treg issus des ganglions mésentériques était sélectif de la sous-population de Treg NRP1- correspondant aux Treg induits. La diminution significative aussi bien in vitro qu'in vivo de la conversion des LT naïfs en Treg en condition inflammatoire contribue probablement à leur incapacité à contenir la colite. Dans un 3ème travail, nous avons étudié la dynamique des LT Th1, Th17 et Treg et des sous-populations de LT CD4+ co-exprimants IL-17/IFNgamma, IL-17/Foxp3 et IFNgamma/Foxp3 chez des patients MICI en rémission clinique suivis tous les 3 mois. Une élévation des LT Foxp3/IL-17 du sang précédait la rechute de la maladie suggérant un rôle potentiel pathogénique de cette sous-population de LT. Ces éléments illustrent les concepts de conversion et plasticité des Treg au cours des MICI mais aussi leur rôle comme cible pour optimiser et développer de nouvelles biothérapies / Inflammatory bowel disease (IBD) are characterized by an excessive secretion of pro-inflammatory cytokines, hyperactivation of effector T cells (Teff) and insufficient control by regulatory T cells (Treg). We showed that treatment with anti-TNFbeta is accompanied by a significant increase in Foxp3+ Treg in the blood of patients with IBD. Infliximab is also associated with a potentiation of Treg suppressive function. In a second study, we showed that Treg are unable to completely prevent colitis, even as we have shown a significant increase in the number of Treg in the mesenteric lymph nodes and also an increase in number and the ex-vivo suppressive function of Treg cells from the inflammatory colon. The positive impact of intestinal inflammation on the suppressive function of Treg from the mesenteric lymph nodes was selective in the sub-population of Treg NRP1- majority representing iTreg. The significant decrease both in vitro and in vivo neo-conversion of LT to naïve Treg in inflammatory conditions, contributing to the inability of Treg to contain colitis. In a third study, we systematically studied the dynamics of LT Th1, Th17 and Treg as well as subpopulations of CD4+ T cells that co-express IL-17/IFNgamma, IL-17/Foxp3 and IFNgamma/Foxp3 from a cohort of IBD patients in clinical remission followed every 3 months. A rise in the blood of a Treg Foxp3+ mixed population producing IL-17 preceded the onset of a relapse of IBD suggesting a pathogenic potential of this subpopulation of LT. All these elements illustrate the concepts of conversion and plasticity of Treg in IBD but also the key role of Treg as a target to optimize and develop new biological therapies

Lors de la liaison d’un glucocorticoïde (GC) naturel ou synthétique (par exemple, la Dexaméthasone) au récepteur des glucocorticoïdes (GR), les GCs régulent l’expression de gènes cibles soit par (i) transactivation par liaison ‘’directe’’ à un élément de liaison à l’ADN de type ‘’(+)GRE’’, (ii) transrépression ‘’directe’’ par liaison à un élément de type ‘’nGRE’’ ou (iii) transrépression ‘’indirecte’’ par interaction physique directe avec des facteurs de transcription pro-inflammatoires tels que AP-1 et NF-κB. Les effets anti-inflammatoires bénéfiques des GCs sont généralement attribués à la transrépression indirecte, alors que nombre de leurs effets secondaires pathologiques indésirables paraissent liés à la transactivation et/ou à la transrépression directe. Notre laboratoire a récemment découvert qu’un composé non-stéroïdien dénommé CpdX ainsi que ses dérivés deutérés, ne présentent ni la fonction de transactivation, ni celle de transrépression directe du GR, tout en stimulant son activité bénéfique de transrépression indirecte. Notre projet a consisté à caractériser un composé non-stéroïdien dit CpdX, ainsi que ses dérivés, quant à leurs activités thérapeutiques et à démontrer qu’elles sont semblables à celles des glucocorticoïdes anti-inflammatoires, couramment utilisés, tout en étant débarrassés de leurs effets pathologiques secondaires, tels que l’ostéoporose, l’atrophie cutanée et le syndrome métabolique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisés des modèles de souris présentant soit les affections cutanées (dermatites de contact ou atopique, psoriasis), l'asthme, l’arthrite rhumatismale, la colite ulcérative ou la conjonctivite allergique, associés à des études d’immunologie et de biologie moléculaire et cellulaire. Mon travail de thèse a démontré que CpdX, et certains de ses dérivés deutérés, présentent une activité anti-inflammatoire dans le traitement de ces modèles ‘’souris’’ (Partie I). Nous avons aussi montré que le traitement par CpdX et ses dérivés n’induit pas les effets secondaires pathologiques des glucocorticoïdes (Partie II), ouvrait ainsi la vue à une nouvelle ère dans le traitement à long-terme de maladies inflammatoires, sans provoquer les effets pathologiques indésirables des traitements actuels aux glucocorticoïdes. / Upon binding of natural or synthetic glucocorticoids (GCs) (e.g. Dexamethasone) to their glucocorticoid receptor (GR), GCs regulate the expression of target genes either by (i) direct transactivation through direct binding to “(+)GRE” DNA binding sites (DBS), (ii) direct transrepression through binding to “IR nGRE” DBSs or (iii) tethered indirect transrepression mediated through interaction with transactivators, such as NFkB, AP1, or STAT3 bound to their cognate DBSs. The beneficial anti-inflammatory effects of GCs have been generally ascribed to tethered transrepression, whereas many of their long-term undesirable side-effects could be due to transactivation and/or direct transrepression. Our laboratory recently reported that a non-steroidal compound, named CpdX, selectively lacks both direct transactivation and direct transrepression functions, while still exerting an indirect transrepression activity. The goal of our project was to characterize CpdX and some of its derivatives as effective anti-inflammatory drugs similar to glucocorticoids, but lacking their main deleterious side-effects, e.g. osteoporosis, skin atrophy and metabolic disorders. To this end, we have used experimental mouse model for skin disorders (atopic dermatitis, contact dermatitis, and psoriasis), asthma, rheumatoid arthritis, ulcerative colitis and allergic conjunctivitis, combined with immunology, molecular and cellular biology. My thesis studies have demonstrated that in mouse models, CpdX and its derivatives exhibit anti-inflammatory activities, which are similar to those of glucocorticoids (Part I). Importantly, we further show that CpdX and its derivatives do not exhibit the long-term debilitating side-effects of glucocorticoids (Part II). Thereby paving the way to a new era in the long-term therapy of major inflammatory diseases.

La pneumonie est la première cause de mortalité chez l'enfant dans le monde. Elle peut être provoquée par un certain nombre d'agents pathogènes connus mais 15 à 35% des pneumonies de l'enfant restent encore non renseignées d'un point de vue étiologique. L'utilisation d'un test moléculaire de découverte de nouveaux pathogènes nous a permis de découvrir de nouvelles espèces de Torque Teno Mini Virus (TTMV, Anelloviridae), nommées TTMV-LY, dans trois épanchements pleuraux provenant d'enfants hospitalisés avec une pleuro-pneumopathie, dont l'étiologie demeurait inconnue. Les TTMV sont des virus ubiquitaires dont l'implication dans une pathologie reste à déterminer. Les voies respiratoires ayant précédemment été décrites pour être un site d'infection des anellovirus, nous avons entrepris de caractériser ces nouveaux virus, ainsi que d'étudier leur potentiel rôle dans la pathogénèse.Les génomes complets de TTMV-LY ont été isolés, caractérisés puis répliqués in vitro. La réponse des cellules épithéliales alvéolaires, ainsi que des cellules présentatrices d'antigènes (CPA), impliquées dans l'inflammation, a été étudiée après infection par les virions néo-synthétisés.Ces travaux ont démontré que : i) les TTMV-LY peuvent coloniser les poumons en profondeur, ii) les cellules pulmonaires sont permissives aux TTMV-LY et permettent une réplication virale efficace, iii) l'infection virale module les réponses cellulaires et immunitaires des cellules pulmonaires en induisant des dérégulations de l'expression génique et la production de médiateurs inflammatoires, iv) les TTMV-LY seraient capables d'interagir avec les CPA et de réguler ainsi différentiellement le processus inflammatoire.L'ensemble de ces résultats ont permis de mettre en évidence une implication potentielle des TTMV-LY dans la pathogénèse des pneumopathies, et souligné la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu lors de l'infection par les virus de cette famille.

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont des maladies inflammatoires de l’intestin (MII) caractérisées par une inflammation chronique du tube digestif. Ces maladies à traits complexes sont le résultat d’un dérèglement du système immunitaire. Les études d’association pangénomique ont identifié au total 99 loci de susceptibilité aux MII. La région 1q32 du chromosome 1 a été identifiée comme locus de susceptibilité à la MC, la CU et la sclérose en plaque. La région autour du marqueur génétique (rs11584383) contient quatre gènes : Chromosome 1 open reading frame 106 (C1orf106), Kinesin family member 21B (KIF21B), Calcium channel, voltage-dependant, L type, alpha 1S subunit (CACNA1S) et Chromosome 1 open reading frame 81 (C1orf81). L’objectif de l’étude est de mettre ces quatres gènes dans un contexte biologique et de déterminer leur rôle potentiel dans les MII. Par réaction de polymérisation en chaîne quantitatif (qPCR), nous avons déterminé le profil d’expression de ces gènes dans des tissus murins et des lignées cellulaires humaines. KIF21B et C1orf106 sont exprimés dans les tissus gastrointestinal et immunitaire. Par la suite, nous avons testé l’implication de KIF21B et C1orf106 dans les voies biologiques connues pour leur rôle dans les MII comme l’activité NF-kB et le stress du réticulum endoplasmique (RE). Nos résultats montrent que la surexpression de KIF21B dans les cellules HEK293T diminue l’activité de NF-kB et la surexpression de C1orf106 augmente le stress du RE et l’activité de la voie Wnt. Globalement, ces résultats suggèrent que KIF21B et C1orf106, dans la région 1q32, sont des gènes candidats prometteurs puisqu’ils interviennent dans des voies biologiques connues des maladies inflammatoire de l’intestin. / Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) are inflammatory bowel diseases (IBD) characterized by chronic inflammation along the gastrointestinal tract. These complex diseases appear to be the result of an immune system dysregulation. Genome-wide association studies have identified 99 loci that contribute to IBD susceptibility. Region 1q32 of chromosome 1 has been identified as a CD, UC and multiple sclerosis susceptibility locus and the region around this marker (rs11584383) contains four genes: Chromosome 1 open reading frame 106 (C1orf106), Kinesin family member 21B (KIF21B), Calcium channel, voltage-dependant, L type, alpha 1S subunit (CACNA1S) and Chromosome 1 open reading frame 81 (C1orf81). The goal of the present study is to place these genes in a biological context and to determine their possible involvement in IBD. By using quantitative PCR (qPCR), we determined the expression profile of these genes in murine tissues and human cell lines and we observed that KIF21B and C1orf106 were expressed in immune as well as gastrointestinal tissues. Next, we tested the involvement of KIF21B and C1orf106 in biological pathways previously implicated in IBD, more specifically NF-kB activity and endoplasmic reticulum (ER) stress. We found that overexpression of KIF21B in HEK293T cells decreased the activity of NF-kB whereas C1orf106 overexpression increased ER stress and Wnt activity. Taken together, these results suggest that KIF21B and C1orf106 are good candidate causal genes in the 1q32 region.

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont des maladies inflammatoires chroniques du tube digestif qu’on regroupe sous le terme maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Les mécanismes moléculaires menant au développement des MII ne sont pas entièrement connus, mais des études génétiques et fonctionnelles ont permis de mettre en évidence des interactions entre des prédispositions génétiques et des facteurs environnementaux - notamment la flore intestinale – qui contribuent au développement d’une dérégulation de la réponse immunitaire menant à l’inflammation de la muqueuse intestinale. Des études d’association pangénomiques et ciblées ont permis d’identifier plusieurs gènes de susceptibilité aux MII mais les estimations de la contribution de ces gènes à l’héritabilité suggèrent que plusieurs gènes restent à découvrir. Certains d’entre eux peuvent se trouver dans les régions identifiées par des études de liaison génétique. L’objectif de mon projet de doctorat était d’identifier un ou des facteurs de risque génétique dans la région chromosomale 19p (identifiée comme région de liaison IBD6) et de le/les caractériser au niveau fonctionnel. Nous avons d’abord entrepris une cartographie d’association de la région 19p. À la suite du génotypage successif de deux cohortes indépendantes, nous avons identifié un SNP intronique et quatre SNP codants dont un non-synonyme, rs8108738, tous localisés dans le gène microtubule associated serine threonine kinase gene-3 (MAST3) et associés aux MII. Peu d’information fonctionnelle sur MAST3 était disponible. Par contre MAST2, une protéine encodée par un gène de la même famille, régule l’activité du facteur de transcription inflammatoire NF-kappaB. Nous avons confirmé l’implication de MAST3 dans l’activité de NF-kappaB via un knockdown de MAST3 et des essais gène-rapporteur. Pour poursuivre la caractérisation fonctionnelle de MAST3, nous avons choisi une approche non ciblée pour étudier les effets de la variation des niveaux d’expression de MAST3 sur la cellule. C’est-à-dire que nous avons créé un 1er modèle cellulaire de surexpression du gène MAST3 dans les cellules HEK293 et analysé l’expression pangénomique endogène. La validation de l’expression génique dans un 2e modèle cellulaire de knockdown et de type cellulaire différent (THP1), nous a permis d’identifier et de contrer les effets non-spécifiques dus aux niveaux non-physiologiques. Notre étude d’expression a mené à l’identification d’un groupe de gènes dont l’expression est régulée par MAST3. Ces gènes sont majoritairement impliqués dans des fonctions immunitaires (cytokines pro-inflammatoires, régulateurs de NF-kappaB, migration cellulaire, etc.) et une forte proportion est régulée par NF-kappaB. Nous avons évalué l’importance du groupe de gènes régulés par MAST3 dans la présentation clinique des MII à travers des études d’expression dans des biopsies intestinales de patients atteints de CU. Nous avons constaté que l’expression de ces gènes est significativement supérieure dans les régions enflammées par rapport aux régions saines de la muqueuse intestinale des patients atteints de CU. Globalement, les résultats de nos études suggèrent que le facteur de risque aux MII MAST3 agit via la voie du facteur de transcription NF-kappaB pour influencer l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans l’inflammation intestinale typique des MII. Chaque étude génétique sur les MII a le potentiel d’orienter les recherches fonctionnelles vers de nouvelles voies biologiques causales. Le dévoilement des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces voies permet d’augmenter les connaissances sur le développement de ces maladies vers une compréhension plus complète de la pathogenèse qui permettra d’optimiser le diagnostic et le traitement de ces maladies. / Inflammatory bowel diseases (IBD) refer to different chronic inflammatory diseases of the digestive tract mainly Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Mechanisms leading to the pathogenesis of IBD are not completely understood, but genetic and functional studies have highlighted interactions between genetic predispositions and environmental factors, such as the intestinal microbiota, as contributors to the deregulation of the immune response that leads to inflammation of the intestinal mucosa. Genome-wide and targeted association studies have identified several IBD susceptibility genes. However, estimations of the contribution of these genes to heritability of the disease suggest that more are to be discovered. Some of these genes may be in previously identified IBD linkage regions. The objective of my doctoral project was first, to identify risk factors in the 19p chromosomal region (IBD6), previously identified following a genome-wide linkage study, then to characterise them functionally. We first performed a comprehensive association mapping study of the 19p region. Our two-stage genotyping strategy led to the identification of one intronic SNP and four coding SNP –including one non-synonymous SNP, rs8108738 – all located in the microtubule associated serine threonine kinase gene 3 (MAST3) and associated to IBD. Very limited functional information on MAST3 was available at that time. However MAST2 (a gene in the same family as MAST3), is involved in the regulation of inflammation master switch, transcription factor NF-B. We confirmed the involvement of MAST3 in the modulation of NF-B via a knockdown of MAST3 and gene reporter assays. In order to further characterize the function of MAST3, we chose a non-targeted approach to study the effects of the modulation of MAST3 levels on the cell. More specifically, we created a 1st cell model of MAST3 overexpression in HEK293 cells and analysed the resulting genome-wide endogenous gene expression. Validation in a 2nd cell model consisting of a knockdown of MAST3 in THP1 cells, allowed to identify non-specific gene expression due to non-physiological MAST3 levels. Our expression study led to the identification of a group of genes whose expression is modulated by MAST3. These genes are mainly involved in immune functions (pro-inflammatory cytokines, NF-B regulation, cellular migration, etc) and a majority is regulated by transcription factor NF-B. We evaluated the importance of this MAST3-regulated gene set in the clinical manifestation of IBD through an expression study on biopsies of UC patients. We found that the expression the MAST3-regulated gene set was significantly enriched in inflamed region of the intestinal mucosa of UC patients compared to healthy region. Taken together, the results of our study suggest that IBD risk factor MAST3 acts on the NF-B pathway to influence the expression of a group of genes involved in intestinal inflammation typical of IBD. Every genetic study on IBD has the potential to lead functional research towards new causal biological pathways. The unravelling of the molecular mechanisms underlying these pathways aims to improve the comprehension of the pathogenesis of IBD and hopefully will allow for optimization of diagnostic and treatment of these diseases.

La maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique font partie des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Le principal objectif des traitements anti-inflammatoires est de favoriser la délivrance du principe actif localement, spécifiquement sur les zones enflammées et de limiter les effets indésirables. Ainsi, plusieurs systèmes à libération colonique de molécules actives ont été développés. Parmi eux, les pellets présentent de nombreux avantages par rapport aux formes solides unitaires conventionnelles. Dans un premier temps, des pellets comptant une substance anti-inflammatoire naturelle et nutritive, la rutine, ont été développés. L'intérêt de cette molécule est de réduire considérablement les effets secondaires qui constituent un véritable problème dans les traitements actuels des MICI. Les pellets ont été enrobé avec les polysaccharides naturels se dégradant avec la flore colonique. Les études in vitro ont démontré une libération minimale du principe actif au niveau de l'estomac et du petit intestin. Par contre, une libération rapide et totale a été observée lors de l'exposition des pellets dans les conditions du milieu colonique. Les résultats des tests in vivo ont démontré que la rutine a atténué considérablement l'inflammation au niveau de colon et les pellets enrobés ont été aussi efficaces que les pellets d'acide 5-aminosalicylique (5-ASA) commercialisés. L'administration orale de rutine via les pellets enrobés et préparés avec le chitosan semble être une approche prometteuse, permettant la libération du principe actif au niveau des zones enflammées, pour le traitement des MICI tout en réduisant les effets secondaires. Le deuxième but de notre travail était d'élucider l'impact du chitosan, un polymère mucoadhésif, sur l'efficacité thérapeutique. Les pellets de 5-ASA ont été préparés à partir de cellulose microcristalline avec ou sans chitosan. Un enrobage constitué d'un polymère pH dépendant,1' Eudragit® FS, a ensuite été réalisé autour du noyau. Les tests de dissolution ont montré que le principe actif n'était pas libéré du pellet après 2 h en milieu acide. En revanche,la libération était rapide dans un milieu simulant l'environnement colonique. Les tests ex vivo avec les pellets contenant le chitosan ont montré des propriétés mucoadhésives importantes qui ont été confirmées par la concentration élevée du métabolite de 5-ASA dans les tissus coloniques des rats. De plus, nous avons a démontré que les pellets permettaient d'atténuer de façon significative l'inflammation du côlon. Ainsi, les pellets bioadhésifs enrobés possèdent des propriétés bénéfiques supplémentaires pour la libération du 5-ASA au niveau du côlon par rapport à des formes multidoses commercialisées pour le traitement des MICI. / Crohn's disease and ulcerative colitis are two related but distinct chronic inflammatory disorders of gastrointestinal tract (GIT), commonly denoted as inflammatory bowel disease(IBD). The main goal of the anti-inflammatory treatment of this disorder is to achieve maximal drug concentration in inflamed area and reduce systemic adverse effects. For this purpose several colon-spécifie drug delivery systems have been investigated. In addition, the design of pellets as oral drug delivery systems may provide many advantages over single unit preparations and thus improve patient compliance. It is well known that most existing treatments of IBD are associated with significant side effects and for this reason the formulation with a " food like " composition was designed. In the first part of our study, therapeutic efficiency of rutin/chitosan pellets with coatings based on natural polysaccharides degraded by colonie microbiota compared to commercialized 5-aminosalicylic acid (5-ASA) pellets was investigated. Release profiles ofcoated pellets showed a minimal drug release in simulated stomach and small intestine following by rapid drug release upon exposure to the colonie fluid. The results from in vivo testing showed that rutin attenuated efficiently inflammation in the colon and coated pellets were as effective as 5-ASA pellets in mitigating experimental colitis. The studies demonstrated that rutin administration via chitosan core coated pellets seems to be apromising approach for colon-specific delivery since they could interact easily with the mucin layer and deliver drug especially to the inflamed colonie area to relieve symptoms of IBD omitting side effects related to conventional treatment. The second objective of this thesis was to explore the impact of additional mucoadhesive polymer chitosan in the pellets core on the therapeutic efficiency. For this purpose, 5-ASA loaded pellets were produced by extrusion/spheronisation method and subsequently coated with pH-sensitive polymer Eudragit® FS. No drug release at pH 1.2within 2 h, and release as intended in the simulated distal ileum and colon was observed. Chitosan-core pellets showed efficient mucoadhesive properties in ex vivo bioadhesion testing which were also confirmed by increased concentration of 5-ASA metabolite in the colonie tissues in rats. The pellets were tested in preexisting colitis and the results revealed significant attenuation of the colonie inflammation. We can conclude, that bioadhesive chitosan-corepellets showed additional beneficial properties for colonie 5-ASA delivery in the treatment of IBD over marketed dosage formulation.

La progression tumorale MSI (Microsatellite Instable) est un processus multi-étapes résultant de mutations générées par un processus d'instabilité génétique qui affecte en majorité les motifs répétés en tandem de l'ADN (microsatellites). Ces mutations contribuent à l'oncogenèse lorsqu'elles perturbent la fonction d'oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs. Le trait phénotypique MSI est consécutif à l'inactivation du système de réparation des mésappariements de l'ADN (système MMR). Dans ce travail, je me suis intéressé au rôle des microARNs dans l'oncogenèse MSI. Les microARNs régulent l'expression de nombreux gènes pouvant avoir un rôle clé dans le cancer. J'ai donc fait l'hypothèse d'un rôle de ces microARNs lors des différentes étapes du processus tumorigénique MSI. Tout d'abord nous avons mis en évidence une surexpression du miR-155 (ciblant les principales protéines MMR) au niveau de la muqueuse colique non transformée des malades atteints d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale, qui pourrait constituer un évènement pré-tumoral favorisant l'émergence de clones MMR-déficients (notion d'effet de champs). Dans une deuxième partie, nous avons pu identifier la première mutation somatique touchant un microARN. Il s'agit du miR-3613 dont la répétition microsatellite est entièrement localisée dans le miR mature. L'instabilité au niveau de ce miR conduit à des changements de séquence à l'extrémité 3' du miR (notion d'IsomiRs). Les isomiRs produits ont un répertoire de cibles qui pour certaines sont communes à la forme sauvage et pour d'autres spécifiques à chacun des variants.

IntroductionLa neurostimulation vagale (NSV) à haute fréquence (30 Hz) est utilisée commethérapeutique de certaines formes d'épilepsie et de dépression réfractaires aux traitements chezl'Homme. De plus, la NSV à basse fréquence (5 Hz) a été expérimentée avec succès chez l'animalpour traiter différentes inflammations périphériques, notamment digestives. Des travaux récents ontmis en évidence que cet effet anti-inflammatoire est induit par l'activation des fibres efférentesvagales, libérant en périphérie de l'acétylcholine, inhibant la sécrétion des cytokines proinflammatoires.Cette voie est connue sous le nom de voie anti-inflammatoire cholinergique.Toutefois, le mécanisme d'action de la NSV 5 Hz reste mal connu et d'autres voies pourraient êtremises en jeu impliquant le système nerveux central (SNC) et le système immunitaire périphérique.ButLes travaux réalisés ont eu pour objectif d'étudier l'implication du SNC et du systèmeimmunitaire dans la modulation de l'inflammation induite par la NSV basse fréquence chez unmodèle de rat anesthésié. Tout d'abord, afin d'étudier l'implication du SNC lors de la NSV 5 Hz, uneétude d'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) a été réalisée sur le rat "sain"anesthésié. Ensuite, une étude a été effectuée sur l'effet de la NSV sur les cellules immunitairesspléniques ainsi que sur le tube digestif chez un modèle de rat "sain" puis chez un modèle de ratatteint d'une colite expérimentale induite par une injection intra-colique d'acide trinitrobenzènesulfonique (TNBS).RésultatsLes données obtenues lors de l'étude d'IRMf ont mis en évidence un rôle important desfibres afférentes vagales; elles modulent certaines structures du SNC qui pourraient participer à larégulation de l'inflammation digestive induite par la NSV 5 Hz. Les études réalisées sur les souspopulationslymphocytaires spléniques ont révélé que d'autres cellules immunitaires que lesmacrophages étaient impliquées lors de la NSV. Chez le modèle de rat "sain", les résultats decytométrie en flux ont montré que la NSV 3h 5 Hz induisait une diminution de l'activation deslymphocytes T CD4 ainsi que du pourcentage de NKT par rapport aux lymphocytes T. Ces résultatssont en faveur d'un rôle de la NSV 3h inhibant l'activation lymphocytaire et jouant un rôle sur les NKTpossédant des propriétés immunorégulatrices. La NSV 3h n'a pas le même effet chez le modèle de ratprésentant une colite. En effet, le dosage de cytokines sécrétées par les splénocytes en culturemontre que la NSV augmente le potentiel de sécrétion d'IL-10 (cytokine anti-inflammatoire) dessplénocytes et plus particulièrement des lymphocytes T CD4 spléniques. Parallèlement, l'effet antiinflammatoirede la NSV a été mis en évidence au niveau du côlon transverse (au-dessus de la zonelésée) par une diminution des ARNm de SOCS3 et du TNF-α et de la myéloperoxidase. Ces donnéesont démontré un rôle de la NSV sur la fonctionnalité des lymphocytes T CD4 spléniques. La NSV 3h 5Hz orienterait la réponse immunitaire vers une réponse anti-inflammatoire en phase d'initiationd'inflammation digestive. De plus, l'effet anti-inflammatoire de la NSV est retrouvé au niveau du tubedigestif au-dessus de la zone lésée (côlon transverse).ConclusionCes données expérimentales montrent que d'autres voies impliquant différents typescellulaires sont susceptibles d'être mises en oeuvre par la NSV basse fréquence. Elle induitl'implication du SNC par l'activation des afférences vagales et des cellules immunitaires spléniquestelles que les lymphocytes T CD4 et les NKT. Un effet anti-inflammatoire de la NSV est retrouvé auniveau du côlon transverse, mais pas au niveau des lésions dans le côlon distal. Ces résultatsprésentent des implications thérapeutiques : la NSV basse fréquence est actuellement en essaiclinique pour être utilisée comme traitement dans la maladie de Crohn.

La maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique font partie des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Le principal objectif des traitements anti-inflammatoires est de favoriser la délivrance du principe actif localement, spécifiquement sur les zones enflammées et de limiter les effets indésirables. Ainsi, plusieurs systèmes à libération colonique de molécules actives ont été développés. Parmi eux, les pellets présentent de nombreux avantages par rapport aux formes solides unitaires conventionnelles. Dans un premier temps, des pellets comptant une substance anti-inflammatoire naturelle et nutritive, la rutine, ont été développés. L'intérêt de cette molécule est de réduire considérablement les effets secondaires qui constituent un véritable problème dans les traitements actuels des MICI. Les pellets ont été enrobé avec les polysaccharides naturels se dégradant avec la flore colonique. Les études in vitro ont démontré une libération minimale du principe actif au niveau de l'estomac et du petit intestin. Par contre, une libération rapide et totale a été observée lors de l'exposition des pellets dans les conditions du milieu colonique. Les résultats des tests in vivo ont démontré que la rutine a atténué considérablement l'inflammation au niveau de colon et les pellets enrobés ont été aussi efficaces que les pellets d'acide 5-aminosalicylique (5-ASA) commercialisés. L'administration orale de rutine via les pellets enrobés et préparés avec le chitosan semble être une approche prometteuse, permettant la libération du principe actif au niveau des zones enflammées, pour le traitement des MICI tout en réduisant les effets secondaires. Le deuxième but de notre travail était d'élucider l'impact du chitosan, un polymère mucoadhésif, sur l'efficacité thérapeutique. Les pellets de 5-ASA ont été préparés à partir de cellulose microcristalline avec ou sans chitosan. Un enrobage constitué d'un polymère pH dépendant,1' Eudragit® FS, a ensuite été réalisé autour du noyau. Les tests de dissolution ont montré que le principe actif n'était pas libéré du pellet après 2 h en milieu acide. En revanche,la libération était rapide dans un milieu simulant l'environnement colonique. Les tests ex vivo avec les pellets contenant le chitosan ont montré des propriétés mucoadhésives importantes qui ont été confirmées par la concentration élevée du métabolite de 5-ASA dans les tissus coloniques des rats. De plus, nous avons a démontré que les pellets permettaient d'atténuer de façon significative l'inflammation du côlon. Ainsi, les pellets bioadhésifs enrobés possèdent des propriétés bénéfiques supplémentaires pour la libération du 5-ASA au niveau du côlon par rapport à des formes multidoses commercialisées pour le traitement des MICI.