A resistência natural do gambá Didelphis marsupialis ao veneno de serpentes se deve a fatores antibiotrópicos presentes em seu soro, do qual DM43 é um dos responsáveis pela inibição da atividade hemorrágica. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação desta proteína contra a metaloprotease contida no veneno pretendeu-se, neste trabalho, otimizar as condições de cristalização de DM43, na tentativa de determinar sua estrutura por difração de raios-X. Ensaios de cristalização revelaram que o sulfato de amônio é o precipitante mais eficiente na produção de cristais de DM43. A visualização e indexação dos padrões de difração destes cristais permitiram apenas a determinação dos parâmetros de sua cela unitária, devido a baixa qualidade dos mesmos. Deste modo, os seguintes parâmetros de cela unitária foram encontrados: a = b = 117.34 (0.03) Å, c = 193.39 (0.02)Å, ?=?=90° e ? = 120°, correspondentes ao sistema cristalino trigonal ou hexagonal. A recente determinação da sequência de aminoácidos de DM43, possibilitou modelar sua estrutura tridimensional por homologia utilizando o método de satisfação das restrições espaciais. Os três domínios tipo imunoglobulina de DM43 foram modelados em duas partes a partir da estrutura de referência KIR2DL1(1nkr) homóloga a dois domínios C-terminais de DM43, com apenas 27.72% de identidade. O domínio N-terminal denominado D0, foi modelado separadamente contra o domínio C-terminal de KIR2DL1 com um grau de identidade igual a 28.89%. A partir do programa GRASP e PATCHES, foram detectadas as prováveis regiões de ligação entre as duas partes da molécula e uma possível região responsável pela dimerização no domínio D2 de DM43. Interessantemente, resíduos polares em KIR2DLs que foram substituídos por hidrofóbicos em DM43, concentrando-se em uma face do domínio D2 ausente de sítios de glicosilação, o que coincide com as observações de dimerização do receptor do hormônio de crescimento. Um motivo estrutural característico de receptores hematopoiéticos identificados como WSXWS box, foi encontrado em todos os domínios de DM43, especialmente no domínio D2. Supõe-se que a sua existência esteja relacionada com a orientação relativa dos domínios por manter o primeiro triptofano do motivo posicionado exatamente na interface entre os domínios. Surge ainda uma fita extra (F´), no domínio D2, não pertencente ao enovelamento imunoglobulina devido a presença da Pro273, muito bem conservada, a três resíduos do motivo WSXWS. Esta fita parece desempenhar um papel importante na orientação do motivo pois além de formar ligações de hidrogênio com a fita G do domínio anterior, posiciona corretamente o primeiro triptofano do motivo na interface. Somando-se a isto, a presença de resíduos hidrofóbicos na interface dos domínios D1 e D2pode estar contribuindo para a orientação angular relativa menor que 90° entre os dois domínios. Uma interpretação análoga a de hormônios de crescimento sugere que, os loops entre as fitas AB, CC´ e EF do domínio 1, BC e FG do domínio 2 e o linker entre estes dois domínios, estejam envolvidos na interação da metaloprotease com DM43. / The natural resistance of the opossum, Didelphis marsupialis, towards snake venom is due to antibothropic factors present in the blood serum, of which DM43 is one. It is responsible for the inhibition of the hemorrhagic activity of the venom. With a view to better understanding the mechanism of action of this protein against venom metalloproteases, one of the aims of the present work was to optimize the crystallization conditions of DM43 in order to determine its three-dimensional structure by X-ray diffraction. Crystallization trials revealed that ammonium sulphate was the best precipitant. Visualization and indexing of the diffraction patterns from such crystals only allowed for the determination of the unit cell parameters due to their inherently low quality. The values obtained were a = b = 117.34 (0.03) \'ANGSTRON\', c = 193.39 (0.02) Å, ?=?= 90° e ? = 120°, corresponding to the trigonal or hexagonal crystal systems. The recent determination of the amino acid sequence of DM43 permitted the homology modelling of its three-dimensional structure by satisfaction of spatial restraints. The three immunoglobulin-like domains of DM43 were modelled in two separate parts from the reference structure KIR2DL1 (1nkr), homologous to the two C-terminal domains of DM43, with which its shares 27.72% sequence identity. The N-terminal domain, denominated D0, was separately modelled based on the C-terminal domain of KIR2DL1, with which it shares 28.89% identity. The programs PATCHES and GRASP were used to detect the probable interface region between the two separate parts of the molecule as well as a region probably responsible for dimerisation. Polar residues in KIR2DL1 which had been substituted by hydrophobic residues in DM43 are observed concentrated on one face of the molecule devoid of glycosilation sites (D2) coinciding with the dimerisation interface observed in the growth hormone receptor. A structural motif characteristic of the haematopoetic receptor family, identified as the WSXWS box, was observed to some extent in all three domains of DM43 and most evident in domain D2. It is speculated that the existence of this motif is related to the relative orientation of the domains, by maintaining the first tryptophan of the motif positioned at the domain interface. An additional ?-strand (F) in D2, which is not characteristic of the immunoglobulin fold, is observed due to the presence of the conserved Pro273, three-residues prior to the WSXWS box. This strand appears to play an important role in correctly positioning the motif as it forms hydrogen bonds with strand G of the previous domain thus orientating the first tryptophan of the motif at the interface. The presence of hydrophobic residues at the interdomain interface, may also contribute to stabilizing the acute angular relationship between D1 and D2. An analogous interpretation to that given for the growth hormone receptor, suggests that the loops between ?-strands AB, CC\' and EF of domain D1 and between strands BC and FG do domain D2 plus the linker region, are involved in the binding of metalloproteinase by DM43.

Diversos estudos buscam identificar novas moléculas com ações regulatórias sobre a via de sinalização da insulina e consequentemente na homeostase da glicose. Assim, este trabalho visa avaliar o potencial de extratos de frutos no controle da homeostase glicêmica. Os frutos avaliados foram o morango (cv. Toianoca, Camarosa, Oso Grande e Camino Real), a amora-preta e a framboesa vermelha, em dois tempos de amostragem, sendo considerado como tempo A1 e tempo A2. As amostras foram caracterizadas quanto ao seu conteúdo de fenólicos totais, conteúdo de antocianinas monoméricas, capacidade antioxidante, avaliada pelos métodos DPPH e ORAC, ácido elágico total, capacidade de inibição da alfa-glicosidase e captação de glicose e lipólise em tecido adiposo de camundongos (ensaio explante). Dentre os frutos, no primeiro tempo de amostragem, a amora-preta e o morango, cv Oso Grande, foram os que apresentaram maior conteúdo de fenólicos totais (62,36 e 34,89 mg AG/g, respectivamente) no entanto não foram mantidos esses valores no segundo tempo de amostragem, com concentração 30% e 60% inferior, respectivamente; e maior concentração de antocianinas monoméricas (45,33 mg/g e 3,09 mg/g, respectivamente). Em relação a inibição da enzima alfa-glicosidase, avaliado em extrato metanólico, o fruto framboesa vermelha e o morango cv. Camino Real foram as que apresentaram alto potencial inibitório nos dois tempos de amostragem (IC50 0,47 mg FT e IC50 0,57 mg FT para framboesa vermelha e IC50 0,50 mg FT e IC50 0,46 mg FT para Camino Real). Quando avaliado os extratos enriquecidos em fenólicos, o valor de IC50 com maior potencial dentre os frutos avaliados foi da amora-preta, nos dois tempos A1 e A2 (0,0023 mg FT e 0,0021 mg FT, respectivamente). Para captação de glicose em tecido adiposo explate, ao utilizar a insulina para estimular a captação de glicose juntamente com o tratamento (extrato), esse estimulo foi efetivo no aumento da captação de glicose somente com as amostras cv. Camino Real e cv. Oso Grande. Isso pode ser explicado pela alta correlação encontrada de antocianinas identificadas no fruto, como pelargonidina-3-O-glicosídeo. Por outro lado, somente a amora-preta A1 aumentou a lipólise em condição basal, mas nenhuma fruta foi eficiente para reduzir a lipólise em condição estimulada pelo isoproterenol. Sendo assim, frutas vermelhas podem ser boas fontes de compostos bioativos, principalmente antocianinas, as quais podem ter corroborado positivamente com os resultados. / Several studies seek to identify new molecules with regulatory actions on the insulin signaling pathway and consequently on glucose homeostasis. Thus, this work aims to evaluate the potential of fruit extracts in the control of glycemic homeostasis. The fruits evaluated were strawberry (cv. Toianoca, Camarosa, Oso Grande and Camino Real), blackberry and red raspberry, in two sampling times, being considered as time A1 and time A2. Fruits were evaluated for total phenolic, monomeric anthocyanins and contents, antioxidant capacity, evaluated by DPPH and ORAC methods, alpha-glycosidase inhibition capacity and glucose uptake and lipolysis in adipose tissue of mice (explant assay). Among the fruits, in the first sampling period, blackberry and strawberry, cv. Oso Grande, showed the highest total phenolic content (62.36 and 34.89 mg AG / g, respectively), with a decrease of the 30% and 60%, respectively, in the second sampling time; and higher monomeric anthocyanins concentration (45.33 mg/g and 3.09 mg/g, respectively). The methanolic extracts of raspberry and the strawberry cv Camino Real (A1 and A2) presented the highest alpha-glucosidase inhibitory potential. Otherwise, the enriched-polyphenol extract of blackberry (A1 and A2) presented the highest potential among the evaluated fruits. Adipose tissue treated with strawberry cv. Camino Real and cv. Oso Grande was effective in increasing glucose uptake stimulated by insulin. This can be explained by the high correlation with the anthocyanins pelargonidin-3-O-glycoside identified in this fruit. In addition, blackberry A1 was the only sample to increase the lipolysis in basal condition, but all other fruits were not effective to decrease lipolysis in stimulated condition. Thus, berries could be a good sources of bioactive compounds to maintain the glucose homeostasis.

A aplicação de ureia em manejos conservacionistas favorece a ocorrência de elevadas perdas por volatilização de NH3. Novas fontes nitrogenadas ou processos que possam ser aplicados à ureia têm sido pesquisados a fim de reduzir esse tipo de perda. Considerando as questões: O uso móvel do coletor semi-aberto exige a alteração das equações de ajuste, que foram desenvolvidas a partir de seu uso na forma estática? Há menor perda de N por volatilização, e influência o estado nutricional, qualidade e a produtividade da cultura com a agregação de tecnologias à ureia, como o revestimento com zeolita ou Cu e B, ou sua mistura com sulfato de amônio, aplicadas em superfície para a cultura de milho em plantio direto? A agregação de tecnologias à ureia pode alterar as transformações do N do fertilizante no solo? A ureia agregada a tecnologias de revestimento apresenta perdas de NH3 por volatilização semelhante ou inferior as obtidas com aplicação de sulfato de amônio? Foram realizados três experimentos com objetivo de elucidá-las: (i) a quantificação de NH3 volatilizada pelo método do coletor semi-aberto usado com base móvel comparado ao estático; (ii) a avaliação do uso de ureia revestida com ácido bórico e sulfato de cobre (UR) ou revestida com zeolita (UZ), além das misturas de sulfato de amônio + ureia (SAU) e sulfato de amônio + ureia revestida com ácido bórico e sulfato de cobre (SAUR) comparadas ao uso da ureia e do nitrato de amônio (NA) na cultura de milho em plantio direto, e (iii) a influência da UR e UZ nas transformações do N proveniente do fertilizante no solo por meio de incubação com 15N. A partir do primeiro experimento concluiu-se que o uso do coletor semi-aberto móvel pode ser utilizado na avaliação de perdas por volatilização de NH3 juntamente com o uso de equações de ajustes desenvolvidos para o modelo estático. No segundo experimento, a UR demonstrou menor pico e perda total de NH3 volatilizado quando as condições climáticas foram favoráveis à volatilização, enquanto em condições de elevada precipitação, as fontes a base de ureia se apresentaram similares. Os tratamentos avaliados influenciaram a produtividade e a quantidade de N exportado nos grãos, porém não diferiram quanto a massa de 1000 grãos e teor de proteína bruta. A fração de N-ISNT não apresentou efeito dos tratamentos, embora tenha apresentado quantidades elevadas de N potencialmente disponíveis em ambas as safras. No terceiro experimento, a perda total de NH3 por volatilização não teve influência dos tratamentos aplicados à ureia. No entanto, com a aplicação de UR foi observado menor quantidade de NH3 perdido nos primeiros dias de incubação, sendo estes resultados consequência do maior tempo de permanência do N do fertilizante na forma de ureia, bem como da alteração no fluxo de N-NH4+, que somados são fatores que permitem maior eficiência de uso do N do fertilizante. / Urea application in no-till is favorable for occurrence of high losses by volatilization of NH3. New nitrogen sources or process that may be applied to urea have been studied to reduce it. Three studies were realized to answer questions as: Is it necessary modifications in adjustment equations with use dynamic of the collector semi-open? Is it possible to get lower losses by volatilization of NH3, nutritional influence, quality and productivity with application of urea coated with zeolite or Cu and B, or urea mix with ammonium sulfate applied in surface for corn in no-tillage? Could these technologies applied in urea modify the dynamic of N from fertilizer in soil? Is it possible the application of coating urea get similar or lower losses of NH3 than ammonium sulfate? The carried out studies were: (i) Evaluation and calibration of the collector semi-open dynamic to quantify losses of NH3 volatilized. (ii) evaluation of urea coated with boric acid and copper sulfate (UC) or with zeolite (UZ), beside the mixes of ammonium sulfate + urea (ASU) and ammonium sulfate + urea coated with boric acid and copper sulfate (ASUC) compared to urea and ammonium nitrate (AN) in corn culture in no-tillage, and (iii) the UC and UZ influence in dynamic of N from fertilizer in soil through 15N incubation. In the first experiment was concluded that dynamic use of collector semi-open can be used in evaluation of losses by volatilization of NH3 with the same adjustment equations developed for static use. In the second experiment, UC showed lower losses of NH3 volatilized when the climatic conditions were favorable to volatilization process occurrence. However, all the treatments with urea were similar when heavy rain occurred. The treatments evaluated influenced the productivity and quantity of N exported by grains; however they had no difference for mass of 1000 grains and crude protein. N-ISNT fraction had no effect of the treatments however they shown high quantities of N potentially available for both harvests. In the third experiment, total losses of volatilization of NH3 had no influence of treatments applied to urea. For other hand, the application of UC showed the lower quantity of losses of NH3 volatilized in the first days of incubation. The results were consequence of the UC effect in the rate of urea hydrolysis, as well as the change on NH4+-N flux for this treatment that could improve N-use efficiency.

A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência, representando cerca de 80% dos casos. A DA é caracterizada por um processo de declínio progressivo e irreversível das funções cognitivas e da memória, que se estende para a desorganização do comportamento. Atualmente, 46,8 milhões de pessoas em todo o mundo foram diagnosticadas com demência. Embora vários fatores tenham sido implicados na DA, sua etiologia ainda não é completamente conhecida. Do ponto de vista neuropatológico, é observado no cérebro de indivíduos com DA atrofia cortical difusa, presença de grande número de placas senis, emaranhados neurofibrilares, processo inflamatório e perda neuronal. A progressão dos sintomas está associada a mudanças estruturais nas sinapses colinérgicas em certas regiões do cérebro, que consequentemente, apresentam neurotransmissão colinérgica reduzida. Os vários eventos patológicos interligados contribuem para o avanço da doença e direcionam diversas pesquisas na busca por tratamentos multialvos com base no processo multifatorial de DA. Assim o presente trabalho descreve a síntese de derivados híbridos dual binding site de donepezila-tacrina (fármacos inibidores de acetilcolinesterase), com potencial para agir em dois alvos terapêuticos pela (i) inibição da acetilcolinesterase em ambos os sítios ativo e periférico, como demonstrado pelos estudos de modelagem molecular, e (ii) na agregação do peptídeo A? neurotóxico induzido pela acetilcolinesterase, na tentativa de interromper a progressão da doença. A estratégia sintética envolveu a condensação da 5,6-dimetóxiindanona com a unidade 4-piperidinil carbaldeído, a qual forneceu o intermediário 5,6- dimetóxindan-1-ona-4-piperidinil-metileno-1-[(4-cloroquinolin-2-il)metil], seguido de redução da dupla ligação, gerada na reação de condensação anterior, e substituição do átomo de cloro-quinolina por amino para obtenção do produto final, ou manutenção da função olefina, seguido de substituição do átomo de cloro-quinolina por azido ou amino, gerando cinco híbridos estruturalmente correlacionados. Os híbridos foram testados em ensaio de inibição de acetilcolinesterase e butirilcolinesterase pelo método de Ellman, e o híbrido insaturado, contendo a função amino-quinolina foi o mais ativo da série com IC50 na faixa de nanomolar (0,014 ?M). Futuramente, os intermediários da reação e produto final serão submetidos ao ensaio de inibição da agregação do peptídeo A? neurotóxico pelo método da tioflavina T. Neste trabalho, também são descritos os testes de predição in vitro para permeação pela barreira hematoencefálica, bem como sua absorção intestinal, pelo método PAMPA. / Alzheimer\'s disease (AD) is the most commom form of dementia in almost 80% of the cases. AD is a process that causes a progressive and irreversible decline of cognitive functions, memory and includes disorganized behavior. Currently, 46.8 million people live with dementia around the world. Although several factors have been implicated in AD, its etiology is not fully understood. In the point of neuropathologic view, diffuse cortical atrophy, presence of senile plaques, neurofibrillary tangles, inflammatory process and neuronal loss are observed in the brain of the patients with AD. The progression of the disease symptoms is associated with structural changes in cholinergic synapses in certain brain regions and consequent impairment of cholinergic neurotransmission. The various interconnected pathological events contribute for the progression of the disease and drive several studies in the search for multitarget treatments based on the multifactorial process of AD. Therefore, this work describes the synthesis of dual binding site tacrine-donepezil hybrids, with the potential to act in two therapeutics targets by: (i) inhibition of the acetylcholinesterase in both peripheral and active sites, as demonstrated in molecular modeling studies, and (ii) the peptide A? neurotoxic aggregation induced by acetylcholinesterase, in an attempt to stop the progression of the disease. The synthetic strategy was based on the condensation between 5,6- dimethoxy-indanone and the 4-piperidinyl carbaldehyde core, which afforded the 5,6- dimethoxy-indanone-4-piperidinyl-methylene-1-[(4-chloroquinolin-2-yl)methyl] intermediate, followed by the reduction of the olefinic bond, formed in the previous condensation, and substitution of the chloro-quinoline atom by amine group to give the final product, or keeping the olefin function, followed by replacement of the chloro-quinoline atom by azide or amine to produce five structural related hybrids. The hybrids were tested in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibition assays using Ellman method, and the unsaturated hybrid containing the amino-quinoline function was the most active of the series with IC50 in a nanomolar range (0,014 ?M). The ability of the hybrids to inhibit protein A? neurotoxic aggregation will be assessed by thioflavin T method. In addition, the blood brain and intestinal barrier permeation by PAMPA methodology were also predicted.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Acridinas sÃo molÃculas policÃclicas aromÃticas planares que possuem a capacidade de intercalar no DNA nuclear. Muitos dos seus representantes apresentam propriedades antibacterianas, antiparasitÃrias e antitumorais. O presente estudo avaliou o potencial citotÃxico de 22 novos compostos acridÃnicos em linhagens de cÃlulas tumorais humanas. Dentre esses, quatro compostos [5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-metil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC4; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC7; 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC10; e 5-(acridin-9-il-metileno)-3-(4-flÃor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, AC23] foram ativos, especialmente em HCT-8 (cÃlon) e SF-296 (glioblastoma), com valores de CI50 variando de 2,3 a 5,3 Âg/mL. Os compostos apresentaram seletividade para cÃlulas tumorais, desde que nÃo inibiram (IC50 > 25 Âg/mL) a proliferaÃÃo de cÃlulas monocucleares de sangue perifÃrico humano (CMSPH), bem como, nÃo foram capazes de induzir dano ao DNA dessas cÃlulas. Nenhum dos compostos mostrou atividade hemolÃtica contra eritrÃcitos de camundongos (EC50 > 200 Âg/mL), o que sugere uma citotoxicidade por mecanismos mais especÃficos. A fim de determinar o mecanismo envolvido na citotoxicidade seletiva dos compostos, foi realizada uma seqÃÃncia de experimentos in vitro, usando a linhagem HCT-8 como modelo. As cÃlulas foram tratadas em diferentes concentraÃÃes dos compostos (2,5; 5 e 10 Âg/mL) por 12 e 24 horas. Todos os compostos foram capazes de reduzir a viabilidade (teste do azul de tripan) e a proliferaÃÃo (ensaio do BrdU) de cÃlulas HCT-8 apÃs o tratamento. A induÃÃo de apoptose pelos derivados acridÃnicos foi determinada por citometria de fluxo (integridade da membrana, fragmentaÃÃo do DNA internucleosomal e potencial transmembrÃnico) e por anÃlise morfolÃgica das alteraÃÃes celulares (brometo de etÃdeo/laranja de acridina e hematoxilina/eosina). A anÃlise por citometria de fluxo revelou que os compostos avaliados promoveram despolarizaÃÃo mitocondrial, o qual evidencia a ativaÃÃo da apoptose pela via intrÃnseca nas cÃlulas HCT-8. Na anÃlise do screening em 3 diferentes linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, foi observado que a linhagem Top1Δ (sem topoisomerase I) mostrou moderada resistÃncia aos compostos acridÃnicos testados na concentraÃÃo de 50 Âg/mL. AlÃm disso, as acridinas inibiram parcialmente o relaxamento do DNA por topoisomerase I, sugerindo que os compostos AC4, AC7, AC10, AC23 tem o potencial antiproliferativo, em parte, relacionado a inibiÃÃo da atividade catalÃtica desta enzima. Esses dados apontam o potencial anticÃncer dos compostos testados. / Acridines are planar aromatic polycyclic molecules that have the ability to progress in nuclear DNA. Many of its representatives have antibacterial, antiparasitic and antitumor. This study evaluated the cytotoxic potential of 22 new acridine compounds in strains of human tumor cells. Among these, four compounds [5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-methyl-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC4; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-bromine-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC7; 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC10; and 5-(acridin-9-yl-methilene)-3-(4-fluor-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione, AC23] were active, especially in HCT-8 (colon) and SF-296 (glioblastoma), with IC50 values ranging from 2.3 to 5.3 mg / mL. The compounds were selective for tumor cells, provided they do not inhibit (IC50 > 25 Âg/mL) cell proliferation monocucleares human peripheral blood (CMSPH) and were not able to induce DNA damage to these cells. None of the compounds showed hemolytic activity against erythrocytes of mice (EC50 > 200 Âg/mL), suggesting a cytotoxicity by more specific mechanisms. In order to determine the mechanism involved in the selective cytotoxicity of compounds was carried out a sequence of in vitro experiments, using the line HCT-8 as a model. The cells were treated in different concentrations of compounds (2.5, 5 and 10 Âg/mL) for 12 and 24 hours. All compounds were able to reduce the viability test (trypan blue) and proliferation (BrdU assay) of HCT-8 cells after treatment. Induction of apoptosis by acridine derivatives was determined by flow cytometry (membrane integrity, DNA fragmentation and internucleosomal transmembrane potential) and morphological analysis of cellular changes (ethidium bromide/acridine orange, and hematoxylin-eosin). The analysis by flow cytometry showed that the compounds evaluated promoted mitochondrial depolarization, which shows the activation of apoptosis by intrinsic pathway in HCT-8 cells. In the analysis of screening in 3 different mutant strains of Saccharomyces cerevisiae, it was observed that the line Top1Δ (without topoisomerase I) showed resistance to acridine compounds tested at a concentration of 50 Âg/mL. In addition, the acridines partially inhibited the relaxation of DNA by topoisomerase I, suggesting that the compounds AC4, AC7, AC10, AC23 has the potential antiproliferative partly related to inhibition of catalytic activity of this enzyme. These data indicate the potential anticancer compounds tested.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Cinco inibidores de tripsina da famÃlia Kunitz (JB1, JB2, JB3-1, JB3-2 e JB4) foram purificados de sementes de Pithecellobium dumosum, uma Ãrvore da subfamÃlia Mimosoideae, por precipitaÃÃo com Ãcido tricloroÃcetico (TCA), cromatografia de afinidade sobre tripsina imobilizada em Sepharose e coluna de fase reversa em sistema de CLAE. Os cinco inibidores possuem massa molecular entre 18 e 20 kDa formados por uma cadeia polipeptÃdica como determinado por SDS-PAGE na presenÃa ou ausÃncia de -mercaptoetanol. JB1, JB3-1 e JB3-2 tÃm massas moleculares de 19,70, 19,69 e 19,69 kDa, respectivamente, por MALDI-TOF. JB2 e JB4 tÃm massa molecular de 18,08 e 20,85 kDa, respectivamente. A seqÃÃncia N-terminal de JB1, JB3-1 e JB3-2 mostrou identidade com outros inibidores da famÃlia Kunitz. Os cinco inibidores foram estÃveis Ãs variaÃÃes de temperatura e pH. A inibiÃÃo da tripsina por JB1, JB2 e JB4 foi do tipo competitivo. JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 tiveram Kis de 3,56 x 10-8 M, 1,65 x 10-8 M, 4,20 x10-8 M, 2,88 x 10-8 M, respectivamente para a tripsina bovina. Em comparaÃÃo com os outros inibidores JB4, com Ki de 5,70 x 10-10 M, apresentou maior afinidade para tripsina. Entre os inibidores purificados apenas JB4 inibiu moderadamente a atividade da quimotripsina. A atividade da elastase e bromelaÃna nÃo foi inibida efetivamente por esses inibidores. A inibiÃÃo de JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 sobre a papaÃna variaram entre 32,93 a 48,82% e foi indicativo de sua bifuncionalidade, com exceÃÃo de JB4 que inibiu fracamente essa atividade (9,93% de inibiÃÃo). A inibiÃÃo da papaÃna por JB1 e JB2 foi do tipo nÃo competitiva e os valores de Ki foram de 7,6 x 10-7 e 5,1 x 10-7 M, respectivamente. Ensaios in vitro sobre as proteinases digestÃrias de Lepidoptera, Diptera e Coleoptera foram feitos. Esses inibidores foram efetivos para enzimas digestÃrias semelhantes à tripsina desses insetos em diferentes graus. As enzimas digestivas de Zabrotes subfasciatus e Ceratitis capitata foram inibidas por JB1 em 68,87 e 65,53%, respectivamente, e as enzimas de Callosobruchus maculatus, Alabama argillaceae e Plodia interpunctella foram inibidas entre 29,18 e 44,35%. Enzimas digestÃrias de Z. subfasciatus, C. maculatus e C. capitata foram inibidas por JB2 entre 70,04 e 74,54% e as enzimas de larvas de A argillaceae e P. interpunctella foram suprimidas em 13,58 e 48,67%, respectivamente. A atividade semelhante à tripsina de larvas de Z. subfasciatus foi suprimida em 67,33 e 56,93% por JB3-1 e JB3-2, respectivamente, e a atividade de C. maculatus, A argillaceae, P. interpunctella e C. capitata foram suprimidas por esses inibidores entre 5,17 e 49,00%. JB4 inibiu entre 54,53 a 66,15 % as enzimas digestivas de C. maculatus, Z. subfasciatus e A argillaceae e inibiu as enzimas digestivas de larvas de P. intepunctella e C. capitata em 8,97 e 37,47%, respectivamente. A inibiÃÃo de proteinases semelhantes à tripsina e à papaÃna presentes no intestino de vÃrios insetos sugere que esses inibidores possam afetar o crescimento e sobrevivÃncia desses insetos pragas quando incorporados em sementes artificiais e esta bifuncionalidade à indicativo de que estes inibidores possam ser fortes candidatos para os programas de melhoramento de plantas via transgenia. / Five Kunitz-type trypsin inhibitors (JB1, JB2, JB3-1, JB3-2 and JB4) were purified from Pithecellobium dumosum seeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose and reverse phase HPLC using Vydac C-18 column. The five inhibitors had Mr between 18 and 20 kDa with a single polypeptide chain as determined by SDS-PAGE with and without reduction. JB1, JB3-1 and JB3-2 had Mr of 19.70, 19.69 and 19.69 kDa, respectively, by MALDI-TOF. JB2 and JB4 had Mr of 18.08 and 20.85, respectively, by SDS-PAGE. The N-terminal sequences of JB1, JB3-1 and JB3-2 showed identity with others Kunitz-type inhibitors. The five inhibitors were stable over a wide range of temperature and pH. The inhibition of trypsin by JB1, JB2 and JB4 was competitive. JB1, JB2, JB3-1 and JB3-2 showed Ki values of 3.56 x 10-8 M, 1.65 x 10-8 M, 4.20 x 10-8 M, 2.88 x 10-8 M, respectively, against bovine trypsin. In comparison with others inhibitors JB4, with Ki of 5.70 x 10-10 M, showed a high affinity toward trypsin. Among the inhibitors purified only JB4 inhibited chymotrypsin activity. The activities of elastase and bromelain were not inhibited for these inhibitors. The inhibition of JB1, JB2, JB3-1 and JB3-2 on papain varied between 32.93 to 48.82% of inhibition and was indicative of its bifunctionality with exception of JB4 that inhibited this activity in 9.9%. The papain inhibition by JB1 and JB2 were noncompetitive type and the Kivalues were 7.6 x 10-7 and 5.1 x 10-7 M, respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. These inhibitors were effective towards trypsin-like digestive enzymes of the insect in different degrees. The digestive enzymes from Zabrotes subfasciatus and Ceratitis capitata were inhibited by JB1 in 68.87 and 65.53% respectively, and Callosobruchus maculatus, Alabama argillaceae and Plodia intepunctella enzymes were inhibited in the range of 29.18 to 44.35%. Digestive enzymes from Z. subfasciatus, C. maculatus and C. capitata were inhibited by JB2 in the range of 70.04 to 74.54%, and the enzymes of A. argillaceae and P. intepunctella were suppressed in 13.58 and 48.67%, respectively. Trypsin-like activities of larval from Z. subfasciatus were suppressed in 67.33 and 56.93% by JB3-1 and JB3-2, respectively, and the activities of C. maculatus, A. argillaceae, P. intepunctella and C. capitata were inhibited by these inhibitors in the range of 5.17-49.00%. JB4 inhibited around 54.53 to 66.15% the digestive enzymes of C. maculatus, Z. subfasciatus and A. argillaceae and the digestive enzymes from P. intepunctella and C. capitata larvae in 8.97% and 37.47%, respectively. The inhibition of trypsin-like and papain-like proteinases of several insects suggested that these inhibitors may affect the growth and survival of these insect pests when incorporated into artificial diet and their bifunctionality are indicative that these inhibitors could be strong candidates to plant management programs cross transgenia.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-08-02T11:48:25Z No. of bitstreams: 1 2011 - Wellington Oliveira da Cruz.pdf: 7968929 bytes, checksum: 9dd68ee567386fa437d5f3438c9db428 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T11:48:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011 - Wellington Oliveira da Cruz.pdf: 7968929 bytes, checksum: 9dd68ee567386fa437d5f3438c9db428 (MD5) Previous issue date: 2011-09-16 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior, CAPES. / CRUZ, Wellington Oliveira. Characterization of Alphitobius diaperinus (Coleoptera, Tenebrionidae) ?-amylase: Effect of Different Birds Diet and Inhibitors from Phaseolus vulgaris. 2011. 50 p Disserta??o (Mestrado em Qu?mica, ?rea de Concentra??o Bioqu?mica). Instituto de Ci?ncias Exatas, Departamento de Qu?mica, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Serop?dica, RJ, 2011. Alphitobius diaperinus known as mealworm of poultry litter, is one of the main poultry pests. It uses high protein and carbohydrates substrate of birds as a food source, colonizing all the production area finding a favorable environment for its proliferation. This insect causes sanitary and economic problems, affecting not only healthy and growth of the poultry but also acting as a microorganisms transmitter like bacterias, protozoas and virus. In this work it was identified an ?-amylase activity in crude extracts of A. diaperinus larvae and adults. This enzyme is responsible for starch degradation used as a energy source extremely important for survival of many insects. The ?-amylase was partially purified by ammonium sulfate precipitation (25-75%) in a chromatographic Sephadex column G (50-80), polyacrylamide gel revealed only one band with molecular weight of approximately 30 kDa, its purity was confirmed by the method of enzyme activity assay dinitrosalicylic 3.5-alkaline (DNS) was increased 7.2 times when compared with the crude extract. The ?-amylase assays presented a maximum activity at a pH 5.0 and pH 5.6 and an optimal activity temperature of 50 ? C. The maximum activity of ?-amylase A. diaperinus was achieved in the presence of 0.02 mM CaCl2, and inhibited by increasing this reaction concentration. The enzymatic activity of A. diaperinus ?-amylase was significantly inhibited by amylase inhibitor ?-AIs (lectin-like inhibitor) of Phaseolus vulgaris, suggesting that this inhibitors can be used as an important tool in biological control and development of these pests by reducing the digestion reducing amylase activity which plays an important role in the starch digestion / CRUZ, Wellington Oliveira. Caracteriza??o de ?-amilase de Alphitobius diaperinus (Coleoptera, Tenebrionidae): Efeito de Diferentes Ra??es de Aves e dos Inibidores de Phaseolus Vulgaris. 2011. 50 p Disserta??o (Mestrado em Qu?mica, ?rea de Concentra??o Bioqu?mica). Instituto de Ci?ncias Exatas, Departamento de Qu?mica, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Serop?dica, RJ, 2011. Alphitobius diaperinus, conhecido como cascudinho de cama avi?ria, ? uma das principais pragas av?colas. Ele utiliza o substrato das aves rico em prote?nas e carboidratos como fonte de alimento, colonizando toda a ?rea de produ??o, encontrando um ambiente favor?vel para sua prolifera??o. Este inseto causa problemas sanit?rios e econ?micos, afetando a sa?de e o crescimento das aves e atuando tamb?m como transmissor de microrganismos tais como baact?rias, protozo?rios e v?rus. Neste trabalho foi identificada a presen?a de uma ?-amilase no extrato bruto de larvas e adultos de Alphitobius diaperinus. Esta enzima digestiva ? respons?vel pela degrada??o de amido utilizado como combust?vel na obten??o de energia, sendo extremamente importante para sobreviv?ncia de muitos insetos. A ?-amilase foi parcialmente purificada por precipita??o em sulfato de am?nio (25-75 %) em coluna cromatogr?fica Sephadex G (50-80), revelando em gel de poliacrilamida uma ?nica banda com peso molecular de aproximadamente 30 KDa. Sua pureza enzim?tica foi confirmada atrav?s de ensaio de atividade pelo m?todo 3,5-dinitrosalic?lico alcalino (DNS), observando-se um aumento de 7.2 vezes em rela??o ao extrato bruto. A ?-amilase ensaiada apresentou uma atividade m?xima em pH 5.0 e pH 5.6 e uma temperatura de atividade ?tima de 50?C. A atividade m?xima da ?-amilase de A. diaperinus foi alcan?ada na presen?a de 0.02 mM de CaCl2, e inibida com o aumento da concentra??o deste reagente. A atividade enzim?tica da ?-amilase de A. diaperinus, foi significativamente inibida pelo inibidor ?-AIs, (inibidores tipo lectina) de Phaseolus vulgaris, sugerindo que estes podem ser utilizados como importantes ferramentas biol?gicas no controle e desenvolvimento de A. diaperinus atrav?s da redu??o da atividade digestiva destas pragas devido a atua??o desses inibidores sobre a a??o catalisadora de amilases, enzimas fundamentais para a digest?o de amido

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:36:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_Diss_Luiz_Neri_Berte.pdf: 2155538 bytes, checksum: d732fa38ae96b3be68ba89a5652e4659 (MD5) Previous issue date: 2013-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Due to the expansion of the cultivation of Jatropha curcas, in Brazil studies are needed covering agronomic management, especially in weed management, due to the susceptibility of Jatropha curcas the competition and lack of information. Thus, the objective was to quantify the effects of increasing doses of clomazone in the initial development of the Jatropha curcas to identify selective herbicide doses for culture. To this end, two experiments were conducted in the randomized factorial 2 x 5 in randomized blocks with 4 replications. The first factor representing the combination of two formulations of the herbicide clomazone being used CS (suspension of encapsulated) formulations and EC (emulsifiable concentrate) the commercial product GAMIT and 360 CS ® 500 EC ® and five dosages 0; 250; 500; 1000 and 2000 g ha-1. In the first experiment we studied the application of clomazone reemergence and second applying post-emergence. To identify the effects of clomazone on culture biometric, physiological and biochemical parameters were investigated. In trials of pre and post emergence, application of clomazone herbicide symptoms caused the higher dosages used, as evidenced by symptoms of leaf chlorosis. In both trials and for all doses and formulations used, plant height and stem diameter showed a linear increase during the trial period. In pre emergence, application of clomazone hindered the development of biometric parameters, however, the post emergence test the changes were less dramatic. The biochemical and physiological parameters were affected by the application of clomazone in pre and post emergence. The application of clomazone in pre and post-emergence in the culture of Jatropha, the suspension formulations of encapsulated (GAMIT 360 CS ®) and emulsifiable concentrate (EC GAMIT 500 ®) to a dose of 2000 g ha-1 produced an intermediate symptoms phytointoxication and negatively affect early development and dry matter accumulation by plants. The recovery of plants after 51 days when applied before emergence, and 42 days in the post application emergency suggest the existence of clomazone selectivity for this crop in both formulations until the dose of 500 g ha-1. However, further studies needed for longer duration and are contemplating the crop to verify the negative effects of the herbicide in the production of jatropha aspects / Devido à expansão do cultivo de pinhão-manso no Brasil são necessários estudos abrangendo o manejo agronômico, especialmente no manejo de plantas daninhas, devido à susceptibilidade do pinhão-manso a competição e à escassez de informações. Assim, objetivou-se quantificar os efeitos de doses crescentes de clomazone no desenvolvimento inicial do pinhão-manso visando identificar doses seletivas do herbicida para a cultura. Para tal foram conduzidos dois ensaios sob o delineamento em esquema fatorial 2 x 5, em blocos casualizados com 4 repetições. O primeiro fator representou a combinação de duas formulações do herbicida clomazone, sendo utilizadas as formulações CS (suspensão de encapsulado) e CE (concentrado emulsionável) do produto comercial GAMIT 360 CS® e GAMIT 500 CE®, respectivamente, e cinco dosagens: 0; 250; 500; 1000 e 2000 g ha-1. No primeiro ensaio estudou-se a aplicação do clomazone em pré emergência e no segundo a aplicação em pós-emergência. Para a identificação dos efeitos do clomazone sobre a cultura foram investigados parâmetros biométricos, bioquímicos e fisiológicos. Nos ensaios de pré e pós emergência, a aplicação do clomazone ocasionou sintomas de fitointoxicação nas maiores dosagens utilizadas, evidenciados por sintomas de clorose foliar. Em ambos os ensaios e para todas as doses e formulações utilizadas, a altura de plantas e diâmetro do caule apresentaram incremento linear no decorrer do período de avaliações. Em pré emergência, a aplicação do clomazone prejudicou o desenvolvimento dos parâmetros biométricos, porém, no ensaio de pós emergência as alterações foram menos expressivas. Os parâmetros bioquímicos e fisiológicos foram afetados pela aplicação do clomazone em pré e pós emergência. A aplicação de clomazone em pré e pós emergência na cultura do pinhão-manso, nas formulações de suspensão de encapsulado (GAMIT 360 CS®) e concentrado emulsionável (GAMIT 500 CE®) até a dosagem de 2000 g ha-1 promoveu sintomas intermediários de fitointoxicação e interferiu negativamente no desenvolvimento inicial e no acúmulo de massa seca pelas plantas. A recuperação das plantas após 51 dias quando da aplicação em pré emergência, e 42 dias na aplicação em pós emergência sugerem a existência de seletividade do clomazone para essa cultura em ambas formulações até a dose de 500 g ha-1. No entanto, são necessários novos estudos de maior duração e que contemplem a produtividade da cultura para verificar os efeitos negativos do herbicida nos aspectos produtivos do pinhão-manso

Nas últimas décadas, é intensa a procura de uma explicação genética sobre a origem, crescimento e progressão do melanoma cutâneo. A tentativa de encontrar uma ligação direta entre as mutações gênicas e a origem da doença tem sido o objetivo dos pesquisadores dedicados ao estudo dessa neoplasia. Diversos métodos são utilizados na busca de uma avaliação prognóstica para a progressão do melanoma, citando-se, entre eles, a pesquisa do linfonodo sentinela, a imunoistoquímica, as técnicas moleculares e a técnica de microarray. A necessidade de estabelecer um método, com excelente sensibilidade e especificidade, tem levado os pesquisadores a buscarem melhores evidências. É importante para esses estudos a obtenção de dados confiáveis sobre as técnicas, progressão e sobrevida livre de doença. Por meio da imunoistoquímica, técnica relativamente simples e de baixo custo, a expressão da proteína p16 pode ser analisada e correlacionada com o prognóstico da doença. No melanoma cutâneo, a expressão da proteína diminui, à medida que aumenta sua agressividade, ou seja, é forte nos nevos e melanomas in situ, e fraca ou ausente nos melanomas metastáticos. Em alguns estudos, a comparação com outros marcadores é analisada. A finalidade deste estudo é fazer uma revisão da literatura internacional sobre o uso da proteína p16 como fator prognóstico para o melanoma, bem como avaliar a importância das alterações do gene p16INK4a, co-responsáveis pela gênese e evolução do melanoma.

A compreensão dos mecanismos que regulam o endométrio e suas implicações clínicas podem contribuir para melhorar as taxas de implantação do embrião humano. Apesar de muitas proteínas e moléculas influenciarem a receptividade endometrial, sua contribuição coordenada para o processo de implantação do embrião ainda é pouco compreendida. Dentre a complexa rede que guia este processo em direção à preparação de um endométrio receptivo se encontram as citocinas, das quais a interleucina-11 (IL-11) e o fator inibidor de leucemia (LIF) desempenham papel essencial. Estudos demonstram que a interrupção das vias de sinalização celular dessas citocinas prejudica ou mesmo impede a implantação, implicando diretamente na fertilidade feminina. Além disso, a hiperinsulinemia afeta negativamente a fertilidade da mulher. Dentro desse contexto, a metformina, fármaco antidiabético, pode exercer efeitos positivos sobre a expressão da IL-11 e LIF, revertendo o possível prejuízo do excesso de insulina sobre a secreção dessas citocinas. Para avaliar esse efeito, utilizou-se um modelo de cultura primária de células estromais de endométrio humano expostas aos hormônios sexuais femininos estrogênio e progesterona, divididas em grupos: controle, metformina, insulina, e associação insulina e metformina. Utilizando RT-qPCR e ensaio imunoenzimático de ELISA, foram avaliadas a expressão gênica e proteica, respectivamente, das duas citocinas. Não foram observadas diferenças entre os grupos. O ensaio de MTT para avaliar a proliferação celular permitiu a verificação da ação antiproliferativa da metformina sobre o grupo hiperinsulinêmico. Embora as hipóteses formuladas nesse estudo encontrem forte sustentação na literatura, no modelo proposto não foi possível encontrar diferenças na expressão da IL-11 e LIF. Dada a complexa regulação de todos os fatores considerados nessa pesquisa e suas múltiplas inter-relações, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos que orquestram essa complexa rede. / The understanding of the endometrium regulation and its clinical implications can help to improve implantation rates of the human embryo. Although many proteins and molecules influence the endometrial receptivity, their coordinated contribution to embryo implantation process is still poorly understood. Among the complex pathways involved in this process toward the preparation to a receptive endometrium are the cytokines, including interleukin -11 (IL- 11) and leukemia inhibitory factor (LIF) that play an essential role. It has been shown that disruption of cellular signaling pathways of these cytokines impairs or even prevents implantation, direct implications on fertility. Moreover, the hyperinsulinemia can negatively affected women's fertility. Within this context, metformin, an antidiabetic drug, may exert positive effects on the expression of IL-11 and LIF, reversing the possible effects insulin excess. To evaluate this effect, a model of primary culture of human endometrial stromal cells exposed to female sex hormones estrogen and progesterone was used. Cells were divided in groups: control, metformin, insulin, association insulin and metformin. From qRT-PCR and ELISA immunoenzymatic assay gene expression and protein, respectively, of the two cytokines were evaluated. No differences were observed between groups. Additionally, the assay to evaluate cell proliferation MTT found the important antiproliferative action of metformin on hyperinsulinemic group. In the proposed model could not find differences in the expression of IL-11 and LIF. Given the complex regulation of all factors considered in this study and their multiple interrelationships, more studies are required to unravel the mechanisms that orchestrate this complex network.