Es realitza una breu introducció a la Química Supramolecular, la qual estudia les estructures i funcions de les associacions que resulten de la unió d'espècies moleculars a través d'enllaços intermoleculars, no covalents. El reconeixement molecular, reactivitat i transport són les funcions bàsiques de les espècies supramoleculars.El present treball tracta de la química supramolecular d'anions i del potential efecte catalític de complexos de Zinc amb lligands hexaazamacrocilics en reaccions de hidròlisis d'esters de fosfat.Els lligands descrits en aquest treball són lligands macrocíclics hexadentats formats per amines secundàries o terciàries enllaçades a cadenes alquíliques de dos o tres àtoms de carbonis formant dos braços, que estan unides per un espaiador, El conjunt de lligands que s'estudien permeten estudiar els diferents factors, geomètrics, electrònics i estèrics que controlen els fenòmens de reconeixement molecular. El treball descriu en detall els procediments de síntesi i la caracterització d'aquest conjunt de lligands.S'ha realitzat un estudi sistemàtic dels diferents factors que afecten als fenòmens de reconeixement molecular entre lligands macrocíclics (L), descrits anteriorment i substrats aniònics (S): fosfats, polifosfats i dicarboxilats. Els estudis s'han realitzat tant en dissolució aquosa, a partir de mesures potenciomètriques, com en estat sòlid per difracció de Raig-X a partir de la obtenció de les estructures cristal·lines dels complexos. La força de l'enllaç en els complexos ternaris H:L:S es racionalitza en termes d'enllaç per pont d'hidrogen, interaccions electrostàtiques i interaccions per -Stacking. Així mateix es racionalitza la importància de les dimensions i forma de la cavitat en el grau d'interacció.Actualment hi ha un gran interès en l'estudi del paper que juguen els ions metàl·lics en el centre actiu dels metal·loenzims hidrolítics tal com la carboxipeptidasa, que catalitza la hidròlisi d'aminoàcids C-terminals de substrats polipeptídics, l'anhidrasa carbònica, que catalitza la reacció d'hidratació del CO2 per donar hidrogencarbonat, la fosfatasa alcalina, que actua catalitzant la hidròlisi no específica de monoesters de fosfats a pH alcalí.El Zn(II) és un metall que es troba sovint formant part dels centres actius dels metal·loenzims i és el segon element de transició més abundant en els organismes vius. Per aquest motiu són útils els models sintètics que puguin actuar com a mimetitzadors de reaccions bioinorgàniques en les que els metal·loenzims juguen un paper com a catalitzadors. Els models sintètics són complexos de metalls de transició formats per un lligand o lligands en el seu entorn de coordinació més immediat que tinguin efectes electrònics i estèrics els més similar possible als que es produeixen en el centre actiu dels enzims.Donat la importància dels complexos de Zn(II) com a models biomimètics de metal·loenzims hidrolítics, s'han sintetitzat i caracteritzat complexos dinuclears de Zn(II) amb lligands hexaazamacrocíclics descrits anteriorment.S'ha realitzat un estudi de la seva activitat catalítica en la hidròlisi d'un ester activat, l'acetat de p-nitrofenil, un substrat característic que s'utilitza per analitzar l'activitat catalítica dels models biomimètics. / The dissertation starts with a brief introduction to Supramolecular Chemistry which studies the structures and functions of the associations that result from the binding of several molecular entities through intermolecular, non covalent bonds. Molecular recognition , reactivity and transport consitute the basic functions of supramolecular species.The dissertation focuses on the supramolecular chemistry of anions and on the studies of the catalytic effects of Zinc complexes on hydrolysis reactions.The ligands described in this work, having secondary or tertiary amines bonded to alkyl chains of two or three carbons, form a cyclic hexadentate structure thanks to the bonding to several bridges. The group of ligands studied allow to have a control on the effect that several properties such as geometry, electronic distribution and esterical effects have on molecular recognition fenomena. The dissertation describes in detail the synthesis and charcterization of this group of ligands.This work is a systematic study of the conditions that influence molecular recognition fenomena between the afore mentioned ligands (L) and anionic substrates such as phosphates, polyphosphates and dicarboxylates. This studies have been made both in solution, through potentiometric titrations, and in solid state by X-Ray diffraction studies.The bond strength in species of the type H:L:S is rationalised in terms of hydrogen bonding, electrostatic interactions and -Stacking fenomena. The importance of the shape and size of the cavity of the ligand is also discussed in deep.There has been a great interest in the role that the metallic ions play within the active center of hydrolityc metal-enzymes such as carboxypeptidase or carbonic anhydrase. In this work dinuclear zinc complexes using hexaazamacrocyclic ligands have been synthesised and it's catalytic effect in the hydrolisis of p-nitrophenyl acetate has been studied. Those are potential synthetic models that mimic the funtion of metal-enzymes.

En esta tesis se tratan diversos aspectos de la química de Cu(I), Ag(I) y Au(I). En primer lugar se estudia sistemáticamente la capacidad de los funcionales de la densidad B3LYP, PBE0 y PBE1 para tratar las interacciones d10···d10 y otros tipos de interacciones intermoleculares, tales como enlace de hidrógeno fuerte, débil y moderado e interacciones de Van der Waals. Se estudia el problema del número de coordinación en compuestos de Cu(I), Ag(I) y Au(I): mientras que Cu(I) y Ag(I) forman preferentemente compuestos tri y tetracoordinados, Au(I) forma sobretodo compuestos dicoordinados. Se ha visto que dicho comportamiento se debe a la mayor energía que requiere el oro para deformar su esfera de coordinación. También se ha explicado por qué existen estructuras de estos compuestos para las cuales es difícil asignar un número de coordinación. Por otra parte, se ha estudiado la formación de dímeros de complejos de Cu(I) dicoordinado, poniendo de manifiesto que la formación de dímeros mediante interacciones ligando···ligando o metal···ligando, cuando son posibles, es más estabilizante que la dimerización mediante interacciones metal···metal aisladas. Se ha estudiado la naturaleza de las interacciones Cu(I)···Cu(I), concluyendo que viene esencialmente determinada por la suma de las componentes elecrostática y dispersiva. Se ha propuesto que dichas interacciones, cuando tienen lugar entre fragmentos o cargados de diferente signo, pueden llamarse "interacciones Cu(I)···Cu(I)", si bien teniendo en cuenta la importante contribución de los ligandos a la interacción. Por otra parte, cuando tienen lugar entre fragmentos cargados del mismo signo, deberían llamarse "interacciones Cu(I)···Cu(I) mediadas por el contraión", ya que por sí solas no llevan a la formación de especies estables. Finalmente se ha explicado la existencia de interacciones Ag(d10)···Ag(d10) entre compuestos aniónicos en disolución, poniendo de manifiesto que el disolvente (o los contraiones presentes en la disolución) estabiliza los agregados aniónicos, con distancias cortas metal···metal. También se ha estudiado a nivel TD-DFT el espectro de absorción de dichos agregados, obteniéndose resultados coherentes con los experimentos, lo cual confirma el efecto estabilizador del disolvente.

In the present thesis we have explored different factors that impede accurate quantitative description of non-covalent protein-protein and protein-ligand interactions and design of new potent and specific binders from the scratch. Firstly, we addressed the role of solvent in the mechanism of non-covalent interactions. Secondly, we tackled the question about the intrinsic conformational flexibility of the protein molecules and the part it plays in weak interactions between proteins. In the first part of the thesis we studied the interactions of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein with five cyclic peptides in solution and gas phase. The results showed that affinities of five ligands to VEGF in solution and gas phase are ranked in inversed order. That is, the that has the highest affinity in solution (as shown by chemical shift perturbation NMR and isothermal titration calorimetry) forms the weakest complex with VEGF in gas phase, and vice versa. We compared gas-phase and solution binding affinities of of five peptides and made qualitative conclusions about the role of the solvent in protein-ligand interactions. In order to obtain more quantitative information about the gas-phase behavior of non-covalent complexes we have developed a combined experimental/theoretical approach to study the energetics of collisional activation of the ion prior to dissociation. We applied developed strategy to model CID in traveling wave ion guide (TWIG) collision cell. We validated the model on the CID of leu-enkephalin peptide and then applied developed strategy to five non-covalent protein-peptide complexes and found activation energies of their dissociation reactions. Next we applied ESI native MS to study the allosteric interactions between the molecular chaperonin GroEL and ATP. The obtained data allowed to construct a scheme of conformational transition of GroEL upon binding of ATP and distinguish between two different cooperativity models, providing strong arguments in favor of Monod-Wyman-Changeux (MWC) model. Finally, be studied the backbone dynamics of VEGF with a combination of NMR relaxation and all-atom force-field based normal mode analysis (NMA). We showed that combination of experimental and computational approach allows to identify flexible zones with higher level of confidence. We also found out that residues, that are involved VEGF-receptor interactions, reside in or close to the flexible zones, suggesting the critical role conformational plasticity plays in the non-covalent protein-protein interactions. / Las biomoléculas de los organismos vivos realizan sus funciones principalmente a través de interacciones débiles reversibles entre ellas. La transducción de señal, la replicación de ADN/ARN, otros procesos enzimáticos y, virtualmente, cualquier otro proceso involucrado en las funciones vitales de cualquier organismo vivo (de las simples amebas, al complejo ser humano), requiere que las moléculas “hablen” entre ellas. Dicho lenguaje se basa en interacciones no covalentes. La flexibilidad conformacional es una propiedad esencial de las grandes biomoléculas, y muchas de las funciones desempeñadas por proteínas se basan en su capacidad para cambiar de conformación en respuesta a un factor externo. Geométricamente hablando, la presencia de flexibilidad en una proteína obstaculiza el diseño racional de medicamentos porque posibilita la existencia de un número muy elevado de conformaciones de dicha proteína. Por este motivo, cualquier información sobre la flexibilidad de una proteína es sumamente valiosa para la comprensión de PPI y PLI y para el diseño racional de medicamentos. Los capítulos 1-3 de la presente tesis versan sobre la solvatación, mientras que la flexibilidad se estudiara en el capitulo 4.

La Ciclosporina A (CsA) es un fármaco inmunosupresor que ha supuesto una revolución en el trasplante de órganos. A pesar de sus propiedades anti-inflamatorias, su uso se ha visto limitado por los efectos tóxicos que causa en algunos pacientes. La CsA inhibe la trascripción de genes involucrados en el sistema inmune. Se cree que esta inhibición es la causante de los efectos tóxicos producidos por el fármaco. El modo de acción de CsA está mediado por la unión de sus principales receptores intracelulares, las ciclofilinas (Cyps). Las ciclofilinas son proteínas que están conservadas en todas las especies y su principal función está involucrada en el plegamiento correcto de otras proteínas. Se ha descrito que los efectos tóxicos producidos por CsA podían estar mediados directamente por sus receptores las ciclofilinas. A pesar de que se descrito que las ciclofilinas están involucradas en diferentes funciones, no se les atribuye una función específica. En nuestro laboratorio hemos estado interesados en las posibles vías que involucran a las Cyps y si éstas tienen relación con lo efectos causados por CsA. En esta tesis se ha intentado identificar proteínas que interaccionan con CypA, CypB y FKBP12 y su implicación en los efectos tóxicos producidos por CsA. Hemos identificado una serie de interacciones y hemos estudiado más a fondo dos de ellas. Estas interacciones son las ocurridas entre la ciclofilina B y la subunidad beta de la bomba sodio/potasio, la ciclofilina A y la subunidad beta de la bomba sodio/potasio y por último la ciclofilina B y la subunidad b1 de la ATP sintetasa mitocondrial. Una vez identificadas estas interacciones hemos realizado ensayos funcionales con cada una de ellas. Por un lado hemos estudiado si la actividad de la bomba sodio/potasio estaba afectada en células renales humanas tratadas con CsA y células que habían sido silenciadas para la ciclofilina B y ciclofilina A. Por otro lado hemos realizado un estudio de la actividad y expresión de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en células renales tratadas con CsA y células renales que habían sido silenciadas para los genes CypA y CypB. A parte de las interacciones encontradas, hemos visto que la actividad de la bomba Na/K está disminuida por el fármaco y que en esta disminución estaría involucrada la ciclofilina B, también hemos visto que los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial estarían afectados en células tratadas con CsA y en células interferidas tanto para CypB como para CypA. Como conclusión podríamos sugerir que las ciclofilinas estarían involucradas en los efectos nefrotóxicos que produce la CsA. Estos efectos nefrotóxicos causados por el tratamiento con CsA podrían estar mediados por vias alternativas a la clásicamente descrita, como es la inhibición de la calcineurina. Dichas vías estarían integradas por nuevos efectores tales como Na/K-ATPasa, ATP sintetasa, así como otras putativas dianas que en el futuro serán estudiadas en nuestro laboratorio. / Cyclosporine A is an immunosuppressive drug that has revolutionized organ transplantation. Even though it has anti-inflammatory property, its used has been reduced due to the renal toxic effects caused in some patients. CsA inhibits transcription of genes involved in the immune system. The CsA mode of action involves the binding of its main receptors, the cyclophilins (Cyps). Cyps are proteins conserved in all species and their main function is the correct folding of immature proteins. It has been describes that the main toxic effects caused by CsA could be mediated directly by its receptors, the cyclophilins. Although Cyps are involved in many processes, there is not a specific function for them. In our lab, we have identified a number of proteins that interact with Cyclophilin A (CypA), Cyclophilin B (CypB) and FK-Binding Protein 12 (FKBP12) by yeast two hybrid assays. Some of those novel interactions were confirmed by pull-down and co-immunoprecipitation assays. Finally, we have also carried out functional assays in some of those interactions. As a conclusion, we could suggest that cyclophilins would be involved in the nephrotoxic effects caused by cyclosporine A. Those effects are mediated by alternative pathways. Those pathways would be integrated by novel effectors such as the sodium/potassium ATPase, mitochondrial ATP synthase and also other proteins that will be studied in our lab.

Cuando, realizado un análisis de la varianza, el efecto de un factor resulta significativo, para poder tener información sobre las causas de esta significación, se hace necesario conocer la forma en que se diferencian los niveles del factor. Algo parecido podría decirse respecto a las interacciones, con efecto significativo, entre dos o más factores del diseño.El problema, desde un punto de vista general, podría formularse así: dado un diseño multivariante de experimentos, y obtenido un sistema de funciones paramétricas estimables, si son significativamente distintas, ¿cómo se diferencian entre sí?Un primer camino para diferenciar los efectos de un factor (o unas interacciones, o un sistema de funciones paramétricas estimables en general), podría consistir en realizar análisis parciales de la varianza, tomando algunos niveles y prescindiendo de los demás. Esta solución, que exigiría un análisis para cada uno de las posibles combinaciones, es muy engorroso y prácticamente inviable. La utilización de contrastes ortogonales, T-contrastes ó S-contrastes en el caso más general (SCHEFFE, 1959) permite comparar combinaciones lineales de los niveles. Son muy útiles, pero tienen el inconveniente de que exigen la elección de los coeficientes, que puede ser complicado si los tamaños de las muestras de cada una de las celdas del diseño son distintos. Además, su aplicación se limita, en la práctica, a comparar los efectos de un factor principal. Las dificultades y limitaciones de las soluciones anteriores y, en cambio, la sencillez de interpretación que proporciona el análisis canónico de RAO (1952) para representar y diferenciar poblaciones, sugieren la conveniencia de generalizarlo a diseños más complicados, para poder hacer lo mismo con un sistema de funciones paramétricas estimables. En este sentido, el principal objetivo de la presente memoria es la generalización del análisis canónico de poblaciones a un sistema de funciones de funciones paramétricas estimables. Sin embargo, no abordaremos el problema sin antes revisar algunos conceptos del análisis multivariante. Para empezar, y siguiendo a DEMPSTER (1969) emplearemos una notación actualizada que aproveche los recursos del álgebra lineal moderna. Esto nos permitirá, entre otras cosas, exponer de forma algebraica la teoría y estimación de funciones paramétricas, independientemente de cualquier parametrización. Por otra parte, en esta memoria debemos analizar en detalle las relaciones entre la versión algebraica y la versión paramétrica de una función estimable, estableciendo la forma de pasar de una a otra. Además, deseamos obtener, en función de un muestreo, la expresión que optimice la estimación de una función estimable y relacionarla con la estimación que proporciona el teorema de GAUSS-MARKOV. La representación canónica de un sistema de funciones estimables deberá tener las mismas propiedades métricas que el análisis discriminante de RAO (1952).Otro objetivo importante de esta memoria será el obtener una región confidencial exacta (fijando un coeficiente de confianza) para cada función estimable. Finalmente nos proponemos estudiar la representación canónica en el caso de que existan variables concomitantes que influyan en las funciones estimables, y la conexión entre el análisis canónico generalizado y el análisis de coordenadas principales de GOWER (1966).

Las combinaciones de fármacos antirretovirales (ARV) pueden provocar interacciones farmacológicas (IF) mediadas por el complejo enzimático del citocromo P450. Algunos ARV actúan como sustratos, inductores e inhibidores de este complejo. Así, se ha establecido que hasta un 96 % de los pacientes tratados con la terapia antirretroviral de gran actividad, presentan como mínimo una situación clínica no deseada o un efecto adverso generado por una interacción farmacológica (IF). El objetivo del presente trabajo ha sido detectar y determinar el grado de probabilidad, evidencia y relevancia clínica de las IF mediadas por el citocromo P-450 en una población de pacientes VIH positivos a los que se les ha realizado monitorización terapéutica de las concentraciones plasmáticas de los inhibidores de la proteasa (IP) e inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (NN) en un Hospital de Nivel III. También se puso a punto una metódica analítica específica y validada para la cuantificación de estos ARV. El estudio ha sido observacional y transversal en el que para cada paciente con sospecha de IF, se han determinado: los parámetros farmacocinéticos de los ARV (Cmin, AUC) mediante cromatografía líquida de alta resolución- ultravioleta la discusión clínica del caso, el análisis de la evidencia de la IF, la probabilidad, mediante la escala de probabilidad de IF de Horn (EPIF) y la relevancia clínica de la IF detectada. Los resultados mostraron que 6 pacientes presentaron 9 IF bien diferenciadas, que plantearon un cambio en las pautas o esquema farmacoterapéutico de la infección por el VIH o del tratamiento farmacológico de otras patologías concomitantes. Las distintas IF evidenciaron efectos inhibidores e inductores de los isoenzimas del citocromo P450, destacando:1. El caso I evidenció una IF entre atazanavir (ATV), ritonavir (RTV), saquinavir (SQV) y un preparado fitoterapéutico que contiene la especie vegetal Uncaria Tomentosa Wild (FP), que se clasificó como probable y nivel I de relevancia clínica2. El caso II evidenció tres IF : a. SQV, RTV y Carbamazepina (CBZ), clasificada como probable y nivel II de relevancia clínicab. CBZ y SQV, RTV, clasificada como probable y nivel II de relevancia clínicac. Oxcarbazepina y ATV, clasificada como dudosa y de riesgo no determinado3. El caso III evidenció dos IF:a. Voriconazol y efavirenz (EFV), clasificada como probable y nivel II de relevancia clínicab. EFV y Voriconazol, clasificada como probable y nivel II de relevancia clínica4. El caso IV evidenció una IF entre SQV, RTV y tipranavir (TPV) clasificada como probable y nivel II de relevancia clínica.5. El caso V, un paciente pediátrico, que evidenció una IF entre EFV y rifampicina clasificada como probable y nivel II de relevancia clínica.6. El caso VI evidenció una IF entre voriconazol y RTV clasificada como probable y nivel II de relevancia clínica.Así mismo, se estableció una nueva metódica para el análisis simultáneo de 9 ARV por HPLC-UV, de forma selectiva, específica y exacta con una linealidad entre 0,1 μg/mL y 10 μg/mL. Como conclusión destaca:1º Es necesario considerar las terapias alternativas (fitoterapia) como causantes de IF con ARV.2º La administración conjunta de IP, NN y otros fármacos inductores o inhibidores potentes del citocromo P450 (antiepilépticos, antifúngicos, antituberculosos), genera frecuentemente IF complejas, siendo recomendable también la MT, tanto de los ARV como de estos fármacos. 3º Las recomendaciones de ajuste de dosis del EFV en el adulto son difícilmente extrapolables a la población pediátrica.4º La EPIF de horn es una herramienta útil para determinar la probabilidad de las IF, pero son necesarias modificaciones en su contenido para ajustar sus resultados a la práctica clínica. / Introduction: It has been established that up to 96% of patients with HIV/AIDS treated with highly active antiretroviral therapy, have at least an unwanted clinical situation or an adverse effect, generated by a drug interaction. Objective: The aim of this study was to detect and thus determine, the degree of probability, the avalilable evidence and the clinical relevance of drug interactions mediated by cytochrome P-450, in a HIV positive population who have undergone emerging drug monitoring of plasma concentrations of protease inhibitors (PI) and non-nucleoside reverse transcriptor inhibitors (NNTI), in a tertiary Hospital. Moreover, the specific and validated analytical method for the quantification of these drugs was also considered.Methods: It was an observational and cross-sectional study. Patients with extreme IP or/and NNTI plasma concentrations, suspected of developping a drug interaction were identified and followed up. Pharmacokinetic parameters Cmin and AUC were calculated and prospectively followed up. PI and NNTI plasma concentrations were determined by high-perfomance liquid chromatography. Resoults: Six patients were identified, showing nine drug interactions, with different inhibitory or inducer effects on cytochrome P450. One interaction was observed in a patient involving a medicinal herb and PI. Drug Interactions between ritonavir, saquinavir and carbamazepine, voriconazol and tipranavir were detected. Efavirenz showed a drug interaction with rifampycin and voriconazole. Conclusions: It is necessary to consider the suitability of phytotherapy in patients with HIV/AIDS treated with highly active antiretroviral therapy; similarly, the administration of drugs potent inducers or inhibitors of cytochrome P450 (antiepileptics, antifungals, tuberculostatis), together with IP and/or NNTI, often generates complex drug interactions. Thus, accurate drug monitoring should be considered to prevent drug interactions, in these drugs.

Les interaccions no lineals de segon ordre són, probablement, uns dels processos de l'òptica no lineal més utilitzats i rellevants en quant a les seves aplicacions. Aquestes interaccions només són eficients en materials que presenten una simetria d'inversió i que permeten aconseguir-hi un mecanisme de phase matching. Això succeeix, en general, quan s'utilitzen materials amb un alt grau d'anisotropia, fet que imposa limitacions importants en les seves aplicacions. Des de fa temps s'utilitzen una gran varietat de cristalls inorgànics, com el LN o el KTP, en dispositius òptics comercials. Tanmateix aquests materials inorgànics tenen alguns inconvenients o limitacions com ara el cost, dificultats en el processat i poca flexibilitat per modificar-los i incorpora'ls-hi d'altres propietats. En aquest sentit les molècules orgàniques poden aportar solucions, però la dificultat d'assolir cristalls orgànics no centrosimètrics prou grans com per assolir eficiències semblants pel que fa als processos no lineals, n'ha limitat la seva aplicabilitat. Donada l'elevada no linealitat que s'obté amb algunes molècules orgàniques, les interaccions no lineals de superfície, són una de les possibilitats per aquest tipus de materials. Si bé l'eficiència d'un procés de superfície no és elevada, quan un és capaç de sumar coherentment els efectes d'un gran nombre de processos superficials, la interacció resultant pot ser eficient.Els cristalls fotònics són materials nanoestructurats amb la capacitat d'exercir un control ampli sobre la generació i propagació de la llum. Aprofitant els efectes en la propagació de la llum que es donen al llindar de les bandes prohibides, és possible exercir aquest control sobre les interaccions no lineals.Això, juntament amb el fet de que en un cristall fotònic hi ha un gran nombre de interfícies on dur a terme les interaccions no lineals, fa que sigui de gran interès realitzar un estudi exhaustiu de diferents interaccions paramètriques no lineals que s'hi poden considerar.En aquesta tesi es presenten estudis experimentals i teòrics sobre diferents interaccions no lineals considerades en el si de cristalls fotònics col·loïdals i d'òpals. En el cas dels cristalls col·loïdals, el treball es centra, majoritàriament, en l'estudi de les interaccions no lineals de segon ordre. Es demostra, que aquests processos que es poden aconseguir en el si d'una estructura centrosimètrica, són de superfície. Pel que fa als òpals, l'interès està centrat en conèixer com els efectes que aquests materials tenen sobre la velocitat de grup, poden aprofitar-se per incrementar l'eficiència de les interaccions no lineals.Fent ús de tècniques de síntesi en fase sòlida, s'ha pogut enllaçar un gran nombre de molècules no lineals a la superfície de nanoesferes de poliestirè. Aquestes esferes de làtex tenen la capacitat d'autoordenar-se en una xarxa cristal·lina centrosimètrica. Es demostra experimentalment que, gràcies a poder dur a terme una interacció no lineal de superfície en un material amb propietats de cristall fotònic, es poden assolir unes eficiències, 6 ordres de magnitud superiors a les assolides fins ara.Aquest treball comença amb una introducció, dels aspectes més rellevants dels cristalls fotònics i de l'òptica no lineal de segon ordre. Al capítol II es presenten les interaccions no lineals de segon ordre en cristalls col·loïdals. S'explica com es fabriquen aquestes estructures no lineals i es demostra experimentalment que la generació de segon harmònic en un cristall col·loïdal és un procés de superfície.Al capítol III de la tesi s'estudien la suma de freqüències contrapropagants i la generació de tercer harmònic en cristalls col·loïdals. Al capítol IV s'estudia, experimentalment, com es poden aprofitar les anomalies que apareixen en la velocitat de grup, quan la llum s'acobla a les bandes altes d'un òpal, per tal d'incrementar la generació de segon harmònic en aquestes estructures. Finalment, es presenten les conclusions del treball. / Second order nonlinear interactions are, among, the most relevant nonlinear interactions between light and matter when one considers their applications. Such interactions are only efficient in noncentrosymmetric materials and materials or material structures that provide a phase matching mechanism. This is the case, for instance, in highly anisotropic crystals. However such anisotropy sets important limitations to the application scope of these materials.In the last decades, a large variety of inorganic crystals, such as, for instance, LN or KTP, have been used in optics devices. However, these inorganic materials have several drawbacks like their cost, processing difficulties and limitations to their flexibility and capability to hold new properties. Organic molecules may provide some alternatives, but the difficulties in getting a noncentrosymmetric organic crystal, large enough to hold an efficient nonlinear interaction, has restricted their applicability. Because the high nonlinearity of some organic molecules, one may consider surface nonlinear interaction as a good nonlinear mechanism for these molecules.Although the efficiency of surface interaction is low, when many of this surfaces interactions are coherently added, the whole process can be efficient. Photonic crystals have the capability of controlling the propagation and generation of light. Such control is larger in the neighbourhood of a forbidden band. In fact, at the edge of the band it is possible to control the nonlinear interactions. The high number of interfaces present in the photonic crystal structure, where a quadratic nonlinear interaction may occur, and the band edge effects, make it interesting to focus our study into some of such second order nonlinear interaction.In this thesis, we present experimental and theoretical results related to different second order nonlinear interactions in the framework of nonlinear colloidal photonic crystals, and nonlinear opals. For the colloidal crystals we mostly consider second order nonlinear processes, and the surface origin of these interactions is demonstrated. In the case of opals we focus our work on the effects that the group velocity anomalies present in the high bands of the photonic crystals, and show how we can take advantage of them for a nonlinear interaction enhancement.Using solid face methods, we have been able to covalently link a large amount of nonlinear organic molecules to the surfaces of polystyrene nanospheres. These latex spheres have the capability to self organise in a centrosymmetric lattice. We experimentally demonstrate that, given the photonic crystal properties of this material and the possibility of holding surface nonlinear interactions in the interfaces of the nanospheres, efficiencies up to 6 orders of magnitude larger than the ones obtained in the past, can be achieved.An introduction to relevant aspects of photonic crystals and nonlinear optics can be found in chapter I. In chapter II second order nonlinear interactions in photonic crystals are described.We explain how to fabricate these colloidal nonlinear crystals, and then experimentally demonstrate that second harmonic generation in the framework of colloidal photonic crystals is a surface phenomenon. In chapter III, counter-propagating sum frequency generation and third harmonic generation are discussed. In chapter IV, we experimentally demonstrate that, using an opal made of nonlinear polystyrene spheres, the enhancement of second harmonic generation is possible if one takes advantage of the group velocity anomalies presents on the edges of flat bands that are opened at higher frequencies. The main conclusions of the work are summarized in the last chapter.

Dentro de la Química Supramolecular, una parte importante de sistemas están formados mediante la unión de una fase sólida que actúa como anfitrión (host) y unas moléculas huésped (guest) que se alojan en las cavidades del anfitrión. Este tipo de sistemas se denominan compuestos de inclusión. Dentro de las características de este tipo de sistemas puede resaltarse que las interacciones presentes entre el anfitrión y el huésped son débiles (interacciones de Van der Waals, enlaces de hidrógeno o enlaces por transferencia de carga), y que el proceso de inclusión es reversible. En esta tesis se ha desarrollado un estudio de las interacciones débiles en compuestos de inclusión inorgánicos mediante cálculos mecanocuánticos.En primer lugar se ha establecido una metodología para el estudio de las interacciones débiles en estado sólido mediante el empleo de cálculos de bandas. Tradicionalmente, las representaciones utilizadas en estado sólido, como densidades de estados y diagramas de dispersión, no se muestran especialmente útiles para este tipo de estudios, debido a que las modificaciones en la estructura electrónica por la presencia de interacciones débiles en este tipo de representaciones no aparece suficientemente reflejada. Para subsanar este problema se ha propuesto el uso de un nuevo tipo de representación, las curvas COD (Crystal Orbital Displacement), que se definen como la diferencia entre la densidad de estados para una proyección en el sistema completo y la misma proyección en una subred del sistema. Se ha sistematizado los posibles tipos de curvas COD, que pueden resultar de las variaciones en las bandas, de modo que únicamente analizando la forma de las curvas COD se pueden deducir unívocamente las modificaciones producidas en las bandas. Se han utilizado este tipo de curvas para el análisis de los enlaces existentes en sistemas como NaCl, SrSb2, NaP y metal-cerámica (Al2O3-Cr). No se ha limitado el empleo de las curvas COD al estudio del enlace en el estado sólido, analizándose también distorsiones de Peierls (poliacetileno) y efectos de la hibridación (CuP2).En el segundo capítulo se ha estudiado la estructura electrónica de una familia importante de compuestos de inclusión inorgánicos como son los clatratos de Hofmann. Se trata de compuestos en los que tenemos un red de tipo inorgánico (Ni(CN)4 Ni (NH3)2) en cuyas cavidades se sitúan moléculas aromáticas. Se han estudiado mediante cálculos EHTB (extended Hückel tight binding) los clatratos de benceno, pirrol, anilina y etilendiamina con benceno. Los resultados obtenidos indican que el método EHTB proporciona una buena descripción cualitativa del enlace anfitrión-huésped, prediciendo correctamente las orientaciones, variaciones de distancias y frecuencias de vibración experimentales presentes en los clatratos. Las dos interacciones que se revelan como más importantes entre el anfitrión y el huésped, son las existentes entre el sistema "pi" del anillo aromático y la molécula de amoníaco de la red, y entre los grupos CN de la red y el sistema "sigma" del anillo aromático (tratándose en ambos casos de enlaces de hidrógeno, de tipo pi-H-N y CN--H-C respectivamente). El otro tipo de interacción importante presente es la que se produce entre los anillos aromáticos (interacciones huésped-huésped).En el tercer capítulo se ha procedido a un análisis cuantitativo de las interacciones presentes en los clatratos de Hofmann previamente estudiados. Debido a la imposibilidad de obtener resultados cuantitativos con un modelo de cálculo periódico, se ha simplificado el sistema empleando modelos bimoleculares, en los cuales se han realizado cálculos de tipo Hartree-Fock (HF) y Moller-Plesset (MP2). Los valores de las energías de interacción obtenidos indican que las tres interacciones anteriormente indicadas (NH3-C6H6, CN-C6H6 y C6H6-C6H6) son las responsables de la estabilidad de los clatratos. Posteriormente se ha analizado el efecto de los substituyentes del anillo aromático en la estabilidad del clatrato. Los resultados indican que substituyentes dadores que aumentan la densidad electrónica del sistema "pi" estabilizan los clatratos. El estudio del efecto del substituyente en las interacciones entre anillos aromáticos indica que la situación más favorable corresponde a situar un substituyente dador "pi" en un anillo y substituyentes sigma-aceptores en otro anillo situado perpendicularmente.En el cuarto capítulo se ha estudiado otra serie de compuestos de inclusión, como son los clatratos de Cd(CN)2. Dentro de las cavidades de estos compuestos se sitúan moléculas tetraódricas como el neopentano y el tetracloruro de carbono. La resolución de la estructura cristalina de estos clatratos muestra un comportamiento diferenciado en ambos casos; mientras el neopentano presenta una estructura fija, el tetracloruro de carbono muestra desorden dentro de las cavidades. En primer lugar se han efectuado cálculos de tipo EHTB para ambos clatratos, para el estudio cualititativo de las interacciones anfitrión-huésped. Los resultados indican un comportamiento opuesto, mientras en el neopentano la transferencia de densidad electrónica se produce de la red sobre la molécula, en el caso del tetracloruro de carbono es en sentido opuesto. Un análisis cuantitativo de las interacciones mediante cálculos MP2 con modelos bimoleculares indica una mayor interacción del neopentano con la red que en el caso del tetracloruro. Además, los valores de las energías de interacción huésped-huésped son muy similares en ambos casos. Estos resultados concuerdan con el diferente comportamiento experimental antes indicado.El último capítulo se centra en el estudio de otra familia de compuestos inorgánicos de inclusión, como son los compuestos de intercalación tipo CsF-Br2. Una característica que hace interesante su estudio es la formación de un compuesto de intercalación a partir de una estructura tridimensional iónica como es el CsF. El análisis cualitativo de las interacciones muestra dos transferencias de densidad electrónica importantes: una, de los niveles de F' sobre el orbital "sigma" del Br2 y la otra, de los orbitales "pi" del Br2 sobre los orbitales 6s del Cs. El análisis cuantitativo de las interacciones se ha realizado en este caso mediante cálculos MP2 con modelos cluster y con cálculos HF periódicos. Los resultados indican que el modelo de cluster reproduce mejor los valores experimentales de las distancias y frecuencias de vibración, mientras que el modelo periódico describe mejor las variaciones que se producen con la intercalación. Los valores calculados de las energías de interacción del Br2 con la red de CsF indican que estas interacciones son suficientes como para estabilizar el compuesto de intercalación a pesar de la energía necesaria para exfoliar el sólido tridimensional. Posteriormente se ha efectuado un análisis de las energías de interacción para las seis moléculas XY (X,Y: Cl, Br y I), obteniéndose estabilidades crecientes en el orden Cl2<Br2<BrCl<l2<lBr<ICl para los compuestos de inclusión CsF-XY Asimismo, se ha realizado un estudio de la estabilidad de los compuestos de intercalación con diferentes metales alcalinos, encontrándose la situación más favorable en el caso del Cs. / The initial goal of this Thesis was to test the ability of the orbital model to interpret structural trends and binding characteristics in host-guest compounds. The systems initially chosen were the Hofmann clathrates, because of the large amount of experimental data available and the clear orientation preferente of the guest molecules. For the orbital analysis of the host-guest interactions we plamed to use EHTB calculations, but soon we found that such weak interactions involve oniy a few orbitals from tlie large amount of electronic band levels present in the DOS, and we had to develop the simple, systematic approach of the Crystal Orbital Displacement functions (COD), which is presented in the first chapter of the Thesis.With this new tool, the study of the host-guest interactions in the Hofmann clathrates could be carried out and the structural and spectral implications thereupon could be interpreted in terms of vveak hydrogen bonds between the aromatic guest molecules and the host sub-lattice, of the types CH-NH3 and CH'--CN- (Chapter 2).In order to have a semi-quantitative theoretical estimate of the energetics of the host-guest interactions, and to check the results of the extended Hückel calculations, we performed ab initio (MP2) calculations on bimolecular systems torn apart from the lattice of the clathrate (Chapter 3).The next part of the ivork consisted in analyzing the analogous clathrates fonned by the tetrahedral Cd(CN)2 host lattice, which hold guest molecules quite different from those in the Hofmann clathrates: n-pentane and carbon tetrachloride. We also combine in this chapter EHTB studies of the COD maps in the full solid with ab initio calculations on model systems (Chapter 4).The final chapter presents a study of the host-guest interactions in a different family of compounds, i.e., those with the structure of CsF-Br2, which can be considered as formed by intercalation of bromine molecules into a CsF structure. Inthis case, ab initio band calculations were also performed (using the CRYSTAL program).

A fast and direct surface plasmon resonance (SPR) method for the kinetic analysis of the interactions between peptide antigens and immobilised monoclonal antibodies (mAb) has been established. Protocols have been developed to overcome the problems posed by the small size of the analytes (< 1600 Da). The interactions were well described by a simple 1:1 bimolecular interaction and the rate constants were self-consistent and reproducible. The key features for the accuracy of the kinetic constants measured were high buffer flow rates, medium antibody surface densities and high peptide concentrations. The method was applied to an extensive analysis of over 40 peptide analogues towards two distinct anti-FMDV antibodies, providing data in total agreement with previous competition ELISA experiments.Eleven linear 15-residue synthetic peptides, reproducing all possible combinations of the four replacements found in foot-and-mouth disease virus (FMDV) field isolate C-S30, were evaluated. The direct kinetic SPR analysis of the interactions between these peptides and three anti-site A mAbs suggested additivity in all combinations of the four relevant mutations, which was confirmed by parallel ELISA analysis. The four-point mutant peptide (A15S30) reproducing site A from the C-S30 strain was the least antigenic of the set, in disagreement with previously reported studies with the virus isolate. Increasing peptide size from 15 to 21 residues did not significantly improve antigenicity. Overnight incubation of A15S30 with mAb 4C4 in solution showed a marked increase in peptide antigenicity not observed for other peptide analogues, suggesting that conformational rearrangement could lead to a stable peptide-antibody complex. In fact, peptide cyclization clearly improved antigenicity, confirming an antigenic reversion in a multiply substituted peptide. Solution NMR studies of both linear and cyclic versions of the antigenic loop of FMDV C-S30 showed that structural features previously correlated with antigenicity were more pronounced in the cyclic peptide.Twenty-six synthetic peptides, corresponding to all possible combinations of five single-point antigenicity-enhancing replacements in the GH loop of FMDV C-S8c1, were also studied. SPR kinetic screening of these peptides was not possible due to problems mainly related to the high mAb affinities displayed by these synthetic antigens. Solution affinity SPR analysis was employed and affinities displayed were generally comparable to or even higher than those corresponding to the C-S8c1 reference peptide A15. The NMR characterisation of one of these multiple mutants in solution showed that it had a conformational behaviour quite similar to that of the native sequence A15 and the X-ray diffraction crystallographic analysis of the peptide - mAb 4C4 complex showed paratope - epitope interactions identical to all FMDV peptide - mAb complexes studied so far. Key residues for these interactions are those directly involved in epitope - paratope contacts (141Arg, 143Asp, 146His) as well as residues able to stabilise a particular peptide global folding. A quasi-cyclic conformation is held up by a hydrophobic cavity defined by residues 138, 144 and 147 and by other key intrapeptide hydrogen bonds, delineating an open turn at positions 141, 142 and 143 (corresponding to the Arg-Gly-Asp motif). / Se diseñó un método rápido y sencillo para el análisis cinético por resonancia de plasmón superficial (RPS) de las interacciones entre antígenos peptídicos de bajo peso molecular (< 1600 Da) y anticuerpos monoclonales (AM) inmovilizados en la superficie de un chip sensor. Dichas interacciones se ajustaron a un modelo de interacción bimolecular 1:1 y las constantes cinéticas obtenidas resultaron fiables y reproducibles. Los parámetros clave para la calidad de las constantes cinéticas medidas fueron un flujo de tampón elevado, una densidad superficial de AM intermedia y una elevada concentración de péptido. El método se extendió a más de 40 análogos peptídicos frente a dos AM contra el virus de la fiebre aftosa (VFA), obteniéndose total correlación con datos anteriores de ELISA competitivo.Se sintetizaron once pentadecapéptidos con todas las combinaciones posibles de las cuatro mutaciones que caracterizan el bucle GH del aislado C-S30 del VFA respecto a la secuencia de referencia C-S8c1. Los resultados del análisis cinético directo, por RPS, de la antigenicidad de estos péptidos frente a tres AM sugirieron que dichas combinaciones eran aditivas, observación que fué confirmada por ELISA competitivo. Así, el tetramutante (A15S30) que mimetiza el bucle GH de C-S30 resultó ser el peor antígeno de la serie, en contraste con resultados anteriores con este aislado. Aumentando el tamaño del tetramutante de 15 a 21 aminoácidos no afectó significativamente su antigenicidad. En cambio, una incubación prolongada con el AM llevó a un aumento de reactividad no observado para otros análogos. Posiblemente una reordenación conformacional del péptido pudo conllevar a la formación de un complejo estable con el anticuerpo. Experimentos de RPS con un análogo cíclico del péptido A15S30 confirmaron una reversión en la antigenicidad del tetramutante inducible a través de restricciones conformacionales. Estudios de ambos péptidos, lineal y cíclico, por resonancia magnética nuclear (RMN) mostraron que características estructurales anteriormente correlacionadas con la antigenicidad eran más pronunciadas en el análogo cíclico.Se prepararon veintiseis péptidos con todas las posibles combinaciones de cinco sustituciones específicas en el bucle GH del VFA C-S8c1. Dichas sustituciones individuales habían sido objeto de estudios anteriores, obteniéndose una elevada antigenicidad para los correspondientes péptidos mutantes frente a AM anti-VFA. No se pudo sistematizar el análisis cinético por RPS de los nuevos mutantes multiples, debido a problemas tanto en la determinación de las constantes cinéticas de disociación, como en la regeneración de las superficies de AM. Se utilizó así la RPS para la determinación de la afinidad péptido - AM en solución, obteniéndose antigenicidades comparables o incluso superiores a las del péptido nativo A15 (VFA C-S8c1). Se estudió uno de los mutantes multiples (A15FPS) por RMN, observándose una conformación identica a la del péptido nativo. El estudio del complejo cristalino entre el péptido A15FPS y el AM 4C4 por difracción de RX mostró que las interacciones parátopo - epítopo eran similares a las observadas con el péptido nativo. Se concluyió que los residuos clave para el reconocimiento son tanto aquellos involucrados en contactos directos (141Arg, 143Asp, 146His) como aquellos que estabilizan el plegamiento adecuado del péptido. Así, una conformación casi cíclica es soportada por una cavidad hidrofóbica definida por los residuos 138, 144 y 147 y por puentes de hidrógeno intra-peptídicos clave, diseñándose un bucle abierto centrado en las posiciones 141, 142 and 143 (triplete Arg-Gly-Asp).

Protein-protein interactions are essential in biological processes and thus, they have become very promising therapeutic targets. Nevertheless, the artificial modulation of protein complexes remains a challenge. Since most work to date has been focused on the inhibition of protein-protein interactions, there is little precedent on the design of molecules which can induce, stabilize or recover the oligomerization state of proteins. In this context, the system comprised of the tetramerization domain of protein p53 (p53TD) and its oncogenic mutants with defective oligomerization properties is an outstanding case of study for the design and evaluation of molecules which can recover the tetrameric structure. Through a collaboration with Prof. Javier de Mendoza, a family of para-guanidinomethyl-calix[4]arenes able to interact simultaneously with the four monomers of the p53 tetramerization domain was rationally designed; hence, the interaction with these compounds would stabilize the whole tetrameric assembly. In order to evaluate experimentally said calix[4]arenes, three natural oncogenic mutants of the p53TD with defective assembly abilities were biosynthesized. Namely, they are: G334V, R337H and L344P. Once synthesized and purified the calix[4]arenes compounds, their molecular recognition properties were tested through a battery of biophysical techniques, including nuclear magnetic resonances (on both the protein and the ligand), circular dichroism, differential scanning calorimetry, crystallography, mass spectrometry and chemical cross-linking. The results clearly show that these calix[4]arenes interact with the proteins as intended and, the most important, they can thermally and kinetically stabilize the tetrameric state. These results are the perfect evidence of the proof-of-concept initially sought: a little synthetic ligand can stabilize the oligomeric state of proteins which are structurally defective. In addition, the study of several ligands with different functionalizations provides further understanding about the basis of molecular recognition events. On the one hand, the guanidinium group has a vital role for high affinity interactions. On the other hand, structural flexibility, in both the protein and the ligand, enables the molecules to adopt the optimal conformation for the tightest interaction, thereby underscoring the ambiguous and unpredictable role of the entropy in interaction processes. / Las interacciones proteína-proteína son esenciales en muchos procesos biológicos y por ello resultan dianas terapéuticas muy prometedoras. Sin embargo, modular artificialmente complejos proteicos resulta todavía un gran reto. Hasta la fecha, los esfuerzos se han dirigido básicamente hacia la inhibición de interacciones proteína-proteína; pocos precedentes describen el diseño de moléculas que puedan inducir, estabilizar o recuperar el estado oligomérico de proteínas. En relación a lo último, el sistema formado por el dominio de tetramerización de la proteína p53 (p53TD) y sus mutantes oncogénicos con oligomerización defectuosa representa un excelente modelo para el diseño y la evaluación de moléculas que puedan recuperar el estado tetramérico nativo.En colaboración con el Prof. Javier de Mendoza, se diseñaron racionalmente compuestos para-guanidinometil-calix[4]arenos capaces de interaccionar con simultáneamente con las cuatros unidades que estructuran el dominio de tetramerización de p53, de tal modo que podrían estabilizar el estado oligomérico de la proteína. Para la evaluación experimental de dichos ligandos calix[4]arenos, se biosintetizaron tres mutantes naturales de p53TD con tetramerización defectuosa: G334V, encontrado en cánceres de pulmón; R337H, asociado al carcinoma adrenocortical infantil; y L344P, asociado al síndrome Li-Fraumeni.Tras la síntesis y purificación de los compuestos guanidinometil-calix[4]arenos, sus capacidades de interacción con las proteínas se estudiaron por técnicas biofísicas, que incluyen resonancia magnética nuclear (sobre la proteína y sobre el ligando), dicroismo circular, calorimetría diferencial de barrido, calorimetría isotérmica de titulación, cristalografía, espectrometría de masas y entrecruzamiento químico. Los resultados muestran claramente que los calix[4]arenos pueden interaccionar con las proteínas tal y como se habían diseñado; en consecuencia, estos ligandos son capaces de estabilizar térmica y cinéticamente las proteínas mutantes, recuperando así su estado tetramérico.Estos resultados son la perfecta prueba del concepto inicialmente planteado: un pequeño ligando sintético diseñado puede estabilizar el estado oligomérico de proteínas estructuralmente defectuosas. El estudio de varios ligandos con diferentes grupos funcionales también pone de manifiesto otros fenómenos de particular relevancia en el campo del reconocimiento de superficies proteicas. Por una parte, el grupo guanidinio tiene un papel clave para la afinidad de la interacción. Por otra parte, la flexibilidad estructural de ambos componentes: la proteína y el ligando, permite que se establezcan interacciones más estrechas y fuertes, lo que refleja el papel tan ambiguo e impredecible de la entropía en procesos de interacción.