Les structures hétérocycliques pipérazines et azépines se retrouvent chez une grande variété de classes de médicaments. Avec leur capacité à mimer des structures secondaires de protéines, ces hétérocycles représentent des prototypes moléculaires de choix pour le développement d’inhibiteurs d’interactions protéine-protéine d’intérêt thérapeutique. Comme ces interactions jouent un rôle important dans un grand nombre de processus biologiques, elles représentent des cibles stratégiques pour le développement d’agents thérapeutiques innovateurs. L’objectif du projet consistait à développer une nouvelle méthode de synthèse rapide et efficace pour des hétérocycles peptidomimétiques pipérazinones et azépinones. La stratégie de synthèse était d’utiliser une réaction multicomposante de type Ugi sur support solide via une approche bifonctionnelle. Cette méthode permet de générer rapidement en une seule étape des molécules peptidomimétiques hétérocycliques à 6 et 7 membres et de générer des chimiothèques à haute diversité moléculaire. De cette manière, la diversité conformationnelle, en plus de la diversité fonctionnelle, peut être explorée, augmentant significativement la diversité moléculaire et la chance de trouver un inhibiteur sélectif. Les résultats obtenus démontrent que le support solide isonitrile peut être produit rapidement et en grande quantité. Les précurseurs bifonctionnels sont aussi synthétisés efficacement et permettent d’ajouter facilement une grande variété de groupements fonctionnels. De plus, nous avons démontré que la réaction de Ugi sur support solide avec des précurseurs bifonctionnels céto-acides commerciaux permet de générer différents hétérocycles. / Cetopiperazines and diazepines are very important privileged structures in medicinal chemistry and are found in a wide variety of bioactive compounds and drugs. With their ability to mimic different protein secondary structures, they constitute an excellent source of peptidomimetic scaffolds for the discovery and development of protein-protein interaction modulators. Since protein-protein interactions play an important role in many biological processes, they represent very attracting targets for the development of new therapeutic agents. The main objective of the project was to develop a new straightforward and efficient method for the synthesis of piperazinones and azepinones peptidomimetic heterocycles. The strategy was to use the Ugi multicomponent reaction on solid support via a bifunctional approach. This method allows in a single step the generation of peptidomimetic heterocycles of 6 and 7 members and the preparation of libraries with a high degree of molecular diversity. By this approach, conformational diversity in addition to the functional diversity can be explored, significantly increasing the molecular diversity ant the probability to find a selective inhibitor. The obtained results show that the isonitrile solid support can be rapidly produced in large quantities. We have also demonstrated that bifunctional compounds can be efficiently synthesized and that the Ugi reaction on solid support with commercial bifonctional keto-acid compounds can generate different heterocycles.

Malgré les progrès réalisés dans les différentes stratégies thérapeutiques, l’efficacité des principales approches antitumorales a atteint un plateau critique dans le traitement de plusieurs cancers. Il y a donc un besoin urgent de découvrir de nouveaux composés anticancéreux innovateurs et efficaces. Surexprimée dans la plupart des cancers et indétectable dans la majorité des tissus normaux, la Survivine est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire et de l’apoptose. Malgré son immense potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers, le portfolio de la Survivine est très mince. Dans le but de développer des inhibiteurs sélectifs de la Survivine deux approches différentes ont été utilisées dans ce projet : 1) une approche par design rationnel à partir d’un ligand et 2) une approche combinatoire. Un point critique dans les fonctions de la Survivine dans les cancers est son association avec la protéine du choc thermique 90kDa (Hsp90). La Shepherdine est un peptide inhibiteur de l’interaction entre la Survivine et la Hsp90. Malheureusement, elle est dégradée rapidement et possède une perméabilité cellulaire très faible. Pour contourner ce problème, la Shepherdine a été utilisée comme référence dans une approche de design rationnel pour réaliser des études de relation structure-activité et ultimement développer des analogues synthétiques possédant des propriétés pharmacologiques améliorées. L’approche combinatoire «one-bead-one-compound» (OBOC) possède un grand potentiel pour découvrir de nouveaux ligands de la Survivine, car elle permet d’exploiter de manière optimale la diversité moléculaire accessible avec les peptides cycliques. Par contre, leur utilisation dans cette approche est limitée par les problèmes associés avec la détermination de la séquence peptidique des composés après le criblage. Pour contourner ce problème, une nouvelle approche par réouverture de cycle a été mise au point pour la synthèse et le décodage de chimiothèques OBOC de peptides cycliques. Cette nouvelle méthode servira pour la préparation d’une chimiothèque OBOC de peptides cycliques qui seront criblés pour découvrir des ligands de la Survivine et de potentiels inhibiteurs.

Les interactions protéine-protéine (PPI) sont à la base du fonctionnement cellulaire de tous les organismes. Regroupées en deux catégories, les méthodes pour étudier les PPI permettent soit d’identifier les protéines composant le complexe, soit de déterminer les relations entre les protéines. Il existe peu de méthodes hybrides permettant d’obtenir ces deux informations et ces méthodes comportent plusieurs limitations. Le but de ce projet était de développer une nouvelle méthode hybride en modifiant la complémentation de fragments protéiques (DHFR PCA) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le principe de la DHFR PCA repose sur l’association de deux fragments rapporteurs complémentaires en présence d’une interaction protéine-protéine. Les fragments rapporteurs sont fusionnés aux protéines via un connecteur peptidique. La longueur du connecteur limite la distance maximale à laquelle il est possible de détecter une interaction entre deux protéines. Notre hypothèse était qu’en augmentant la longueur du connecteur, nous serions en mesure de détecter des interactions plus éloignées. Nous avons d’abord vérifié que l’augmentation de la longueur du connecteur permettait de modifier notre capacité à détecter des interactions sans toutefois perdre la spécificité de la méthode. De nouvelles interactions ont été détectées à l’intérieur d’un même complexe protéique et entre deux complexes. Nous avons ensuite validé notre capacité à mieux disséquer l’architecture des complexes protéiques en approfondissant le cas de cinq complexes protéiques à l’aide de plusieurs combinaisons de longueurs de connecteurs. Enfin, nous avons confirmé que la méthode permettait effectivement de détecter des interactions entre protéines plus distantes en comparant les résultats obtenus aux distances calculées à partir des structures du protéasome disponibles. La variation apportée à la DHFR PCA permet de moduler la résolution de l’étude des PPI et ainsi de mieux définir l’architecture des complexes protéiques. / Protein-protein interactions (PPI) are central to all cellular processes in all organisms. Grouped in two categories, methods to study PPI allow either to identify proteins composing protein complexes or to determine relationships between proteins. Only a few hybrid methods can be used to obtain both of those informations and these methods present many limitations. The goal of this project was to develop a new hybrid method by modifying the Protein-fragment complementation assay (DHFR PCA) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. DHFR PCA is based on the association of two complementary reporter fragments in presence of an interaction. Both fragments are fused to proteins with a peptide linker. Linker length limits the maximal distance at which it is possible to detect an interaction between two proteins. Our hypothesis was that increased linker length would allow the detection of more distant interactions. We first verified if the augmentation of linker length modified our capacity to detect interactions without losing specificity. New interactions were detected inside and between complexes. Then, we validated our capacity to better dissect protein complexes architecture by studying five protein complexes with different linker length combinations. Finally, we confirmed that the method allowed the detection of interactions that were further in space by comparing our results with distances calculated with available proteasome structures. This variation of DHFR PCA allows to modulate the resolution of PPI study and thus better define protein complexes architecture.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les phospholipides sont à la base de l’architecture de la membrane plasmique bactérienne. La composition de celle-ci est en permanence contrôlée par les conditions extérieures afin d’adapter sa fluidité et maintenir l’homéostasie. Les différentes étapes de la voie de biosynthèse des phospholipides dans la membrane interne de E. coli sont bien connues. En revanche, on connaît peu l’organisation supramoléculaire et la régulation génétique des enzymes, ce qui correspond aux deux grands axes de recherche développés dans cette thèse.Des études par double hybride bactérien ont mis en évidence un réseau d’interactions protéine-protéine,suggérant l’existence d’un complexe formé par les enzymes de la synthèse des phospholipides dans la membrane. Pour tester cette hypothèse, j’ai voulu étudier ces interactions en conditions natives, en utilisant des techniques comme le FRET, le BRET ou la purification TAP. Pour cela, j’ai développé de nouvelles cassettes permettant la construction systématique de souches de E.coli produisant des protéines étiquetées avec des rapporteurs fluorescents ou des tags d’affinité, en condition d’expression physiologique. Ceci m’a permis d’étudier la localisation et la stoechiométrie des enzymes de synthèse des phospholipides dans la membrane.J’ai également étudié la régulation en réponse au stress du gène plsB, qui code pour la première enzyme de la voie de biosynthèse des phospholipides, et de dgkA, qui code pour une diacylglycerolkinase permettant le recyclage des phospholipides. Ces deux gènes, divergents sur le chromosome,sont régulés de façon antagoniste en réponse à trois types de stress : le facteur de réponse au stress extracytoplasmique σE active plsB et inhibe dgkA; le système à deux composants BasRS active dgkAet inhibe plsB ; la réponse stringente active dgkA et inhibe plsB. Ces résultats montrent que le locusplsB-dgkA est finement régulé par toute une série de régulateurs qui intègrent des signaux de stress multiples afin de contrôler l’activité de la voie de biosynthèse des phospholipides / Phospholipids are the building blocks of the bacterial plasmic membrane. The composition of the membrane is continuously controlled by environment conditions, in order to adapt its fluidity and maintain the homeostasis. The enzymatic steps of the phospholipid synthesis pathway in the intermembrane of E. coli are well known. However, little is known about the supramolecular organizationand the genetic regulation of the enzymes catalyzing these reactions, these questions constituting the two main axes developed in this thesis.Two-hybrid studies have evidenced a network of protein-protein interactions, suggesting the existence of a membrane protein complex formed by phospholipid synthesis enzymes. To test this hypothesis, I wanted to assay these interactions in native conditions, by using techniques such as FRET, BRET or Tandem Affinity Purification. Toward this goal, I have developed novel cassettes permitting tosystematically construct E. coli strains that produce proteins tagged with fluorescent or affinity tags,under physiological expression. This allowed me to study the localization and stoechiometry of phospholipid synthesis enzymes in the membrane. Furthermore, I have studied the regulation in response to stress of the plsB gene that codes for the firstenzyme of the phospholipid synthesis pathway, and of dgkA that codes for a diacylglycerol kinase that recycles phospholipids. These two neighboring and divergent genes are inversely regulated in response to three stress responses: the extracellular stress σE factor activates plsB and inhibits dgkA; the two componentsystem BasRS activates dgkA and inhibits plsB; stringent response activates dgkA andinhibits plsB. These results show that the plsB-dgkA locus is regulated by a series of regulators that integrate multiple stress signals, in order to control the activity of the phospholipids synthesis pathway

Les interactions protéine–protéine (IPP) jouent un rôle primordial dans les processus physiologiques. L’inhibition de ces interactions ouvre la voie à la conception de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Les structures secondaires en hélice α sont fréquemment impliquées dans les interactions entre protéines auxquelles elles peuvent contribuer de manière significative. La conception de molécules, mimant ce motif de reconnaissance et pouvant interagir avec la protéine cible tout en inhibant la reconnaissance avec le partenaire naturel, représente une voie innovante pour trouver de nouveaux candidats médicaments. Les oligomères d’urée aliphatique, une classe de foldamères qui adoptent une structure secondaire en hélice bien définie et proche de l’hélice α, ont été proposés comme mimes d’hélice α pour inhiber les IPP. Au cours de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à la conception de foldamères d’oligourée et de chimères oligoamide/oligourée pour cibler des surfaces de protéine. Nous avons sélectionné le récepteur nucléaire de la vitamine D (VDR) comme modèle d’étude en raison de son intérêt thérapeutique, et des connaissances structurales disponibles. Les protéines partenaires de VDR (coactivateurs) interagissant via une courte région structurée en hélice α, nos recherches ont portés sur des mimes d’hélices inspirés des séquences de coactivateurs. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à la génération et à l’étude de dimères covalents de foldamères, qui pourraient être utilisés pour couvrir des surfaces d’interaction plus larges. En effet, les interactions protéine-protéine montrent souvent un mode d’interaction plus complexe qu’une simple hélice, faisant intervenir des structures tertiaires et quaternaires de type coiled coils, qui peuvent aussi servir de point de départ pour la conception de nouvelles classes d’inhibiteurs. / Protein-protein interactions (PPI) have a key role in physiological processes. The inhibition of these PPI may lead to new therapeutic strategies. Secondary structures in α-helix are frequently involved in protein interactions where they may contribute significantly to binding. Designing molecules which mimic the helical motif for protein surface recognition and inhibition of the natural partner represents an innovative path to discover new drug candidates. Aliphatic urea oligomers, a class of foldamers that adopt a well-defined H-bonded helical secondary structure with good similarity to the α-helix have been proposed as possible α-helix mimics to inhibit protein-protein interactions. The first part of this PhD project was dedicated to the design and synthesis of oligoureas and oligourea/α-peptide chimeras for specific protein surface recognition. We have selected the vitamin D receptor as a potential target, mainly because (i) it is therapeutically relevant; (ii) its protein partner (coactivators) interact through a short region which adopts an α-helical structure upon binding and (iii) structures at atomic resolution were available to enable the design of effective mimetics. In the second part, we investigated methods to generate foldamer covalent dimers that could potentially be used to cover larger interaction surfaces. The rationale is that the binding interface is often more complex than a single helix and may involve tertiary and quaternary structures such as coiled coils which in turns may also serve as a basis for the design of new classes of inhibitors.

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.

La simulation in silico des gènes codant pour des ARN de transfert et des protéines a connu un développement considérable ces dernières années car elle permet de déduire de modèles simples des comportements inattendus qui découlent de la structure des génotypes dans l'espace des séquences et de la correspondance génotype-phénotype. Le modèle d'évolution le plus élémentaire, la théorie dite "de l'évolution neutre" conçue et défendue par Kimura principalement, donne lieu à un phénomène à présent bien documenté: les génotypes robustes aux mutations et exprimant des protéines se repliant efficacement, sont surreprésentés en comparaison des génotypes "fragiles". De nombreuses questions restent en suspens notamment en ce qui concerne l'incidence que peut avoir une modélisation plus réaliste de la fonctionnalité d'une protéine sur le schéma tracé à partir de considérations purement structurales et cinétiques. Pour cela, nous avons développé un modèle incluant une contrainte sélective imposant une dimérisation spécifique minimale de deux protéines codées par deux gènes pour qu'un individu puisse survivre. Nous démontrons que les réseaux neutres construits d'après des critères structuraux sont grandement plastiques et peuvent s'adapter à une fonction vitale sans souffrir de baisse de stabilité. La surreprésentation des génotypes robustes est maintenue, elle est même amplifiée par l'interaction épistatique existant entre les deux gènes. On observe que cela s'accompagne d'une augmentation en moyenne de la fonctionnalité résultant de l'émergence d'un *superfunnel* fonctionnel dans l'espace des séquences. Cette propriété remarquable pourrait avoir d'importantes implications dans l'explication de l'émergence de nouvelles fonctions biologiques. Une autre question concerne les simplifications impliquées par le choix des modèles protéiques. Puisque les simulations évolutives supposent un coût de calcul important, les protéines sur réseau ont eu la préférence de nombreux modélisateurs. Dans ce mémoire, nous proposons un modèle de protéine hors réseau possédant des cartes de contacts plus complexes que les protéines sur réseau. Il confirme les conclusions tirées des simulations sur les protéines sur réseau.

Ilf3 et NF90, deux protéines de liaison aux ARN localement structurés en double-brin, sont générées par épissage mutuellement exclusif à partir du gène ILF3. Pour chacune d’entre-elles, un épissage alternatif permet la synthèse de deux isoformes, une longue et une courte, qui diffèrent par la présence ou non d’une séquence de 13 acides aminés localisée à leur extrémité N-terminale et qui correspond à un signal de localisation nucléolaire. La particularité de ces deux protéines est de présenter une forte hétérogénéité avec au moins 20 isoformes produites à partir du même gène, 12 pour Ilf3 et 8 pour NF90. Elle est générée par deux mécanismes complémentaires, l’épissage alternatif et les modifications post-traductionnelles dont deux ont été mises en évidence au laboratoire, la diméthylation asymétrique de l’arginine 609/622 présente dans une séquence consensus de type RGG et catalysée par PRMT1 (« protein arginine N-methyltransferase 1 ») ainsi qu’une phosphorylation sur la sérine 190/203. Ce polymorphisme pourrait être à l’origine des différences de localisation subcellulaire observées selon l’isoforme considérée et/ou aurait comme fonction de réguler soit leurs interactions avec leurs partenaires protéiques ou nucléiques, soit leur activité biologique. Par des expériences d’immunofluorescence et de « GST pull-down », il a été montré que ces deux modifications post-traductionnelles d’Ilf3 et de NF90 ne semblent impliquées ni dans leur localisation subcellulaire, ni dans la régulation de leurs interactions avec leurs partenaires protéiques. Du fait des nombreuses fonctions associées aux protéines Ilf3 et NF90 dans la littérature, les modifications identifiées pourraient être impliquées dans la régulation de leurs interactions avec leurs partenaires nucléiques, ADN ou ARN. / Ilf3 and NF90, two double stranded RNA-binding proteins, are generated by exclusive splicing from the ILF3 gene. For each one, a 5? alternative splicing leads to the synthesis of a long and a short isoforms that differ by the presence or not of 13 amino acid sequence at their N-terminus corresponding to a nucleolar localization signal. The characteristic of these two proteins is to exhibit a high degree of heterogeneity with at least 20 isoforms produced from the same gene, 12 for Ilf3 and 8 for NF90. It is generated by two complementary mechanisms, alternative splicing and posttranslational modifications which two have been identified in the laboratory, the arginine 609/622 asymmetric dimethylation present in a RGG consensus sequence and catalyzed by PRMT1 ("protein arginine N-methyltransferase 1") and the serine 190/203 phosphorylation. This polymorphism could explain the various cellular functions described for both proteins and could regulate their subcellular localization and the interaction with protein or nucleic partners. By immunofluorescence and GST pull-down experiments, it was shown that these two posttranslational modifications of Ilf3 and NF90 neither seem involved in their subcellular localization, nor in the regulation of interactions with their protein partners. Because of the many functions associated with Ilf3 and NF90 proteins in the literature, the identified modifications may be implicated in regulating the interactions with their nucleic partners, DNA or RNA.