近年来肠病毒71亚型（EV71）的大规模流行已成为全世界特别是亚太地区的一个严重的公共卫生问题。EV71感染可以引起腹泻，皮疹，手足口病等等一些自愈性疾病。然而在部分儿童患者中，EV71可能导致严重的神经性疾病。目前，关于EV71感染后宿主细胞的反应机制的报导比较少。在本次研究中，我们运用蛋白组学方法对EV71感染后的人横纹肌瘤细胞的蛋白表达情况进行了分析，最终发现了42个差异表达的蛋白（>2倍的变化，P <0.05），其中21个下调， 21个上调。进一步分析表明，这些蛋白主要参与了细胞内代谢，生物学调控，细胞构建，信息传递和细胞死亡的调控。 接下来我们选择了其中一个变化比较大的蛋白：HSP27，对其功能进行了深入分析。我们的研究结果显示：EV71感染的早期阶段，HSP27在转录和翻译水平上都有明显上调。降低HSP27表达可以减少EV71的复制，过表达HSP27则可以提高病毒复制。通过使用特异的磷酸化蛋白抗体，我们发现HSP27第15位以及78位的丝氨酸有明显的磷酸化修饰，而82位的丝氨酸则没有发生改变。使用p38激酶抑制剂预先处理细胞可以降低HSP27的磷酸化修饰，从而抑制EV71的复制。进一步分析表明，HSP27可以帮助EV71蛋白酶2A对真核翻译起始因子eIF4G的剪切，从而加强病毒自身蛋白的翻译，最终促进了病毒的感染。这项研究结果阐明了宿主细胞EV71的反应机制，有利于我们对病毒致病机制的研究，并为EV71的抗病毒研究提供了一个新的药物靶标。 / The outbreaks of enterovirus 71 (EV71) infections have become a major public health issue worldwide, especially in the Asia-Pacific region. EV71 infection can be asymptomatic or cause diarrhea, rashes, and hand, foot, and mouth disease (HFMD). However, EV71 can also cause severe neurological disease even death. To date, little is known about the molecular mechanisms of the host response to EV71 infection. In this study, the expression patterns of host genes in EV71 infected human rhabdomyosarcoma cells were analyzed by using two-dimensional proteomics assays. In total, 42 protein spots were found to be differentially expressed (>2 fold changes, p<0.05) in three pairs of gels, of which 21 proteins were found to be down-regulated while 21 were up-regulated. Data analysis suggested that proteins associated with metabolic process, biological regulation, cellular component organization, cell communication and death were most modified. HSP27, one of the most altered proteins during EV71 infection, was selected to determine its fundamental roles upon EV71 infection. We show that HSP27 is rapidly up-regulated both at the transcriptional and the translational levels at the early stage of EV71 infection. Depleting cellular HSP27 expression reduced EV71 replication, while over-expression of HSP27 greatly enhanced viral infection. By using the phosphorylated specific antibodies, serine residues 15, 78, but not the 82 were found to be phosphorylated during EV71 infection. The phosphorylation depended on the activation of the mitogen-activated protein kinase p38 signaling pathway. After treating with p38 kinase inhibitors, EV71 replication was coordinately decreased. Further analysis showed that HSP27 affected the protease 2A mediated eIF4G cleavage and assisted the IRES driven translation, thus facilitated the EV71 replication. The findings in this work not only provided a global view of the host responses to EV71 infection, but demonstrated HSP27 to be a valid target for anti-EV71 drug development. / Detailed summary in vernacular field only. / Yi, Lina. / "September 2012." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2013. / Includes bibliographical references (leaves 94-103). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstracts also in Chinese. / Abstract --- p.i / 摘要 --- p.iii / Acknowledgement --- p.iv / Publications --- p.v / Table of Contents --- p.vii / List of Tables and Figures --- p.x / List of Abbreviation --- p.xii / Chapter Chapter 1 --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Enterovirus 71 --- p.2 / Chapter 1.1.1 --- Clinical features --- p.2 / Chapter 1.1.2 --- Molecular epidemiology of EV71 --- p.5 / Chapter 1.1.3 --- The virology of EV71 --- p.8 / Chapter 1.1.4 --- Pathogenesis --- p.18 / Chapter 1.1.5 --- Treatment of EV71 infection --- p.20 / Chapter 1.2 --- The heat shock protein 27 --- p.23 / Chapter 1.2.1 --- Properties of HSP27 --- p.23 / Chapter 1.2.2 --- Functions of Hsp27 --- p.26 / Chapter 1.2.5 --- Phosphorylation of Hsp27 --- p.28 / Chapter 1.2.6 --- Hsp27 and Viral infection --- p.31 / Chapter 1.3 --- Thesis hypothesis and objective --- p.33 / Chapter Chapter 2 --- Materials and Methods --- p.34 / Chapter 2.1 --- Cells and Virus propagation --- p.35 / Chapter 2.2 --- Viral infection --- p.35 / Chapter 2.3 --- 2-DE and image analysis --- p.36 / Chapter 2.4 --- MALDI-TOF-MS --- p.37 / Chapter 2.5 --- Database analysis --- p.38 / Chapter 2.6 --- Bioinformatic analysis --- p.38 / Chapter 2.7 --- Plasmids --- p.39 / Chapter 2.8 --- siRNA synthesis --- p.41 / Chapter 2.9 --- Transfection and cell treatment --- p.41 / Chapter 2.10 --- RNA extraction and cDNA synthesis --- p.41 / Chapter 2.11 --- Real-Time Quantitative PCR --- p.42 / Chapter 2.12 --- Western Blotting analysis --- p.44 / Chapter 2.13 --- Luciferase assays --- p.44 / Chapter 2.14 --- Statistical Analysis --- p.45 / Chapter Chapter 3 --- Proteomic analysis of cellular protein alterations in response to EV71 infection --- p.46 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.47 / Chapter 3.2 --- Results --- p.48 / Chapter 3.2.1 --- EV71 infection of the RD cells --- p.48 / Chapter 3.2.2 --- 2-DE profiling of EV71 infected and non-infected RD cells --- p.49 / Chapter 3.2.3 --- Identification of differentially expressed proteins --- p.50 / Chapter 3.2.4 --- Functional classification --- p.52 / Chapter 3.2.5 --- GO enrichment analysis --- p.54 / Chapter 3.2.6 --- Protein validation by Western blot --- p.56 / Chapter 3.3 --- Discussion --- p.57 / Chapter Chapter 4 --- HSP27 effects on EV71 infection --- p.62 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.63 / Chapter 4.2 --- Results --- p.64 / Chapter 4.2.1 --- Increased Hsp27 expression in EV71 infected cells --- p.64 / Chapter 4.2.2 --- Suppression of Hsp27 inhibits EV71 replication --- p.65 / Chapter 4.2.3 --- Over-expression of Hsp27 increases EV71 replication --- p.66 / Chapter 4.2.4 --- Hsp27 is rapidly phosphorylated during EV71 infection --- p.67 / Chapter 4.2.5 --- Pathways involved in Hsp27 phosphorylation --- p.68 / Chapter 4.2.6 --- Role of Hsp27 phosphorylation during EV71 infection --- p.68 / Chapter 4.3 --- Discussion --- p.70 / Chapter Chapter 5 --- HSP27 facilitate EV71 IRES driven translation --- p.75 / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.76 / Chapter 5.2 --- Results --- p.79 / Chapter 5.2.1 --- Hsp27 increase viral IRES activity --- p.79 / Chapter 5.2.2 --- Hsp27 affects EV71 2A mediated eIF4G cleavage --- p.80 / Chapter 5.3 --- Discussion --- p.82 / Chapter Chapter 6 --- Summary and Perspectives --- p.87 / Chapter 6.1 --- Summary --- p.88 / Chapter 6.2 --- Perspectives --- p.89 / Reference --- p.93

O objetivo central desta dissertação de mestrado foi analisar se, pela sua resposta ao interferon-g (IFNg), as células não leucocitárias contribuem ao controle dos protozoários Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS e Plasmodium berghei ANKA. O IFNg é uma citocina que promove a ativação de diversos tipos de leucócitos, a sua ação sobre as células mononucleares fagóciticas merece um destaque especial. Apesar de conhecermos os pormenores do papel desta citocina na ativação dos leucócitos, desconhecemos se o IFNg exerce ação ativadora sobre as células estruturais (não leucocitárias), ou seja, sobre as células não profissionais da resposta imune. A nossa hipótese de trabalho é que, no caso dos parasitas intracelulares, o IFNg poderia reforçar a ação sinalizadora e efetora das células estruturais infectadas. Por outro lado, em ambas as situações de parasitas intracelulares e extracelulares, o IFNg, ao agir sobre diversas células estruturais, poderia induzir a produção de mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas, etc) que contribuiriam direta ou indiretamente à remoção/controle do parasita. A nossa abordagem tem sido o estudo da infecção por estes protozoários em quimeras de medula óssea B6/IFNgRKO, nas quais as células não leucocitárias são deficientes em receptores para IFNg e as células leucocitárias são normais. A análise por imunofluorescência de cortes histológicos mostrou uma alta expressão de IFNgR pelas células estruturais do coração dos animais B6 e quimeras controle B6/B6, mas nenhuma expressão deste receptor nos cortes histológicos correspondentes de animais IFNgRKO e quimeras experimentais B6/IFNgRKO, apesar de grande parte dos leucócitos dos animais deste último grupo ter se tornado IFNgR+. Após infecção pelo T. cruzi, o coração e músculo esquelético dos animais quiméricos B6/IFNgRKO mostraram maior carga parasitária e menor intensidade dos infiltrados 8 inflamatórios do que aqueles dos animais quiméricos B6/B6, resultados que sugerem o envolvimento das células estruturais no controle do parasita e promoção do recrutamento leucocitário. Na infecção pelo Plasmodium chabaudi AS a análise comparativa dos grupos IFNgRKO e quimera B6/IFNgRKO mostrou que no início da infecção as curvas de parasitemia destes grupos são idênticas sugerindo que nesta fase da infecção a presença do IFNgR nos leucócitos em pouco contribui na evolução da parasitemia. Por outro lado, a análise comparativa dos grupos quimera B6/IFNgRKO e quimera B6/B6 mostrou níveis mais elevados de parasitemia e maior índice de mortalidade nos animais B6/IFNgRKO, sugerindo que as células estruturais participam no controle do parasita através da sua resposta ao IFNg. Entretanto, em uma experiência preliminar de infecção pelo Plasmodium berghei ANKA não observamos grandes diferenças entre os animais dos grupos B6/IFNgRKO e B6/B6, não somente no que se refere à curva de parasitemias, como também na indução de morte precoce decorrente de malária cerebral. / The main purpose of our work was to analyze if by their response to Interferon-g (IFN-g), the non-leucocyte cells are able to control Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS and Plasmodium berghei ANKA protozoans. IFNg was described as a cytokine that promote activation on different types of leucocytes, its action on mononuclear phagocytic cells is important. Despite the fact that this cytokine activate leucocytes, it is unknown whether IFNg activates the structural cells (non-leucocytes), that is, the non-professional cells of the immune response. Our hypotheses suggest that in the case of intracellular parasites, IFNg could help the infected structural cells by increasing their signaling and effect actions. In addition, during the response against intracellular and extracellular parasites, IFNg could induce the production of inflammatory mediators by these cells guaranteeing direct or indirectly the parasite clearance. In the present study, we analyzed the infection of diferente protozoans on bone marrow B6/IFNgRKO chimeras, in which the non-leukocyte cells are deficient in IFNg receptor and the leukocyte cells are normal. Immunofluorescence analyses of histological sections revealed a high expression of IFNgR on the structural cells from the heart of B6 and control chimeras B6/B6 animals, but non-expression of this receptor on histological sections from IFNgRKO and experimental chimeras B6/IFNgRKO, despite the fact that a great part of leucocytes from the last group of animals express the receptor. After T. cruzi infection, the cardiac and skeletal muscle from B6/IFNgRKO chimera animals showed a huge amount of parasite and less infiltration inflammatory than B6/B6 animals, suggesting that the structural cells are involved in the parasite control and leukocyte recruitment. During Plasmodium chabaudi AS infection, comparative analyses from IFNgRKO and 10 B6/IFNgRKO groups showed that parasitemia curves at the early phase are similar, suggesting that during this phase IFNgR expression on leukocytes are not important. On the other hand, parasitemia and mortality levels on B6/IFNgRKO and B6/B6 groups were higher than those on B6/IFNgRKO animals, determining that structural cells participate during the course of infection through their response to IFNg. However, when B6/IFNgRKO and B6/B6 animals were infected with Plasmodium berghei ANKA no significantly difference was observed between these groups related to the course of parasitemia and cerebral malaria.

Os IFN-&alpha;2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-&alpha;2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa. / IFN-&alpha;2 is currently utilized in hepatitis B and C, leukemia, multiple myeloma, hairy cell leukemia, melanoma, Kaposi\'s sarcoma, follicular lymphoma, and renal cell carcinoma therapy, with or without other drugs. In this work, a process for E. coli periplasmic interferon-&alpha;2a production and purification utilizing a lambda PL promoter based on constitutive expression was proposed. As a tool for production monitoring, reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis directly from periplasmic extract was validated. Thus, initially it was described a RP-HPLC methodology for qualitative and quantitative analysis of recombinant human interferon-&alpha;2a and interferon-&alpha;2b. The method has been set up and validated for accuracy, precision, linearity, sensitivity and specificity. A recovery test indicated a bias of less than 1% and intra-day and inter-day quantitative determinations presented relative standard deviations always < 4 %, while experimental sensitivity was 0.3 &mu;g (RSD = 5 %). Regarding to linearity, the coefficient of determination was 0.998 (p<0.0001), for a range of analyzed interferon mass from 0,62 to 10 &mu;g. This rapid methodology allows the application of the RP-HPLC as a powerful tool to monitor the production yield and quality of periplasmic Interferon &alpha;2 right after, or even during the fermentation. The optimum expression temperature was evaluated in flask cultures from 30 to 42 °C. It was observed that the volumetric and specific production were higher for culture temperatures equal or above 35 °C. Thus, considering the potential recombinant protein degradation induced by temperature, 35 °C was well-marked as the optimum temperature for interferon expression. The higher values for specific and volumetric production in culture flasks were 1.04 &mu;g/mL/A600 and 3.45 mg/L respectively. As purification method, it was utilized ionic chromatography followed by size-exclusion chromatography. The final purity and mass recovery was, respectively, 95.3 % and 66 %. The final product was also characterized utilizing SDS-PAGE, western blotting, reversed-phase HPLC, size-exclusion HPLC and mass spectrometry analysis.

Vinte e seis pacientes portadores de Hepatite C crônica e co-infectados pelo HIV, sem outras causas para hepatopatia e virgens para a terapia do VHC, foram tratados com Interferon Peguilado Alfa 2a de 40 KDa associado a Ribavirina por 48 semanas. Coletamos 20 amostras - horas 0, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, dias 3, 4,7, 8, 15, 22, 29, 43, 57 e semana 12 - para quantificação do HCV (TaqMan®) e do HIV após o início da terapia. Os dados basais evidenciavam que o Genótipo 1 correspondia a 15 pacientes, enquanto o Genótipo 3 a 11. A mediana do VHC foi de 1.285.000 UI/ml, CD4 médio 573/mm3 e a média da carga viral do HIV 1109 cp/ml. Em uma análise por intenção de tratamento, o percentual obtido de resposta virológica sustentada (RVS) foi 26,9%. A única correlação estatisticamente significativa entre as variáveis analisadas e parâmetros cinéticos calculados, e a obtenção de RVS ocorreu entre RVS e Genótipo 3 (p < 0,04). Houve ajuste para os parâmetros cinéticos calculados para 18 pacientes. Pacientes com RVS apresentaram maiores taxas de eficiência do Interferon, eliminação de células infectadas e eliminação de vírions livres, assim como as Fases 1 e 2 foram mais rápidas entre eles. A ausência de redução do VHC de um log10 em 24 ou 48 horas, obteve um VPN de 100% para RVS. Ausência de queda de dois log10 nos dias oito e 29 obteve VPN de 92,31% e 100%, havendo associação entre a presença dessa resposta virológica precoce (RVP) e a obtenção de RVS (p=0,003 e p=0,01). A cinética viral mostra-se uma ferramenta útil no manejo clínico e predição muito precoce da ausência de RVS, o que é muito importante, particularmente para os co-infectados com o HIV, ante o complexo manuseio clínico dessa situação. / Twenty six co-infected patients were treated with PegIFN A2A and Ribavirin for 48 weeks. Twenty samples were drew at hours 0, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, days 3, 4, 7, 8, 22, 29, 43, 57 and week 12 to HIV and HCV (TaqMan®) quantification after began medication. Basal data showed Genotype 1 in 15 patients, 3 in 11. Median HCV were 1.285.000 UI/ml, mean CD4 573/mm3 and mean HIV 1109 cp/ml. SVR was associated only with Genotype 3 (p<0,04). Overal SVR (ITT) were 26,9%. We obtained fitted viral kinetics parameters for 18 patients. Patients with SVR showed higher Interferon efficacy, infected cells clearance, free virion clearance and faster phase 1 and 2. Reduction on HCV load of less than one log10 at 24 or 48 hs had a NPV of 100% for SVR. Less than two log decay at days 8 and 29 had 92,31 and 100% of NPV and the presence of those reduction were associated with SVR p=0,003 and p=0,01). Viral kinetics are an important tool regarding clinic management and very early prediction of absence of SVR, wich is very important for the HIV co-infected patients for whom the clicical management is very complex.

Um dos objetivos deste trabalho foi avaliar e comparar a taxa de prenhez de receptoras bovinas nulíparas, após transferência de embriões fecundados in vitro ou in vivo, associados ou não a um embrião partenogenético. Um total de 239 novilhas foram utilizadas, e as médias das taxas de prenhez aos 30 (TP30d) e 60 dias (TP 60d), foram comparadas em arranjo fatorial 8x2 entre G1 e G2 (fecundados in vitro), e em análise fatorial 3x2, entre G3 e G4 (fecundados in vivo). O delineamento utilizado foi: G1) transferência de 1 embrião fecundado in vitro (n=86); G2) transferência de 1 embrião partenogenético associado a 1 embrião fecundado in vitro (n=81); G3) transferência de 1 embrião fecundado in vivo (n=36) e G4) transferência de 1 embrião partenogenético associado a 1 embrião fecundado in vivo (n=36). A taxa de prenhez aos 30 dias para o G1 foi de 31,3% (27/86) e do G2 de 37,0% (30/81); P= 0,28. Para o G3, de 55,5% (20/36) e G4, de 75,0% (27/36); P=0,09. Não houve diferença (P=0,92) para taxa de prenhez aos 60 dias para o G1 em relação ao G2, com taxas de 24,6% (22/86) e 28,2% (23/81); respectivamente. Também não houve diferença (P=0,08) aos 60 dias para o grupo G3 em relação ao G4, com taxas de 44,4 % (16/36) e 61,1% (22/36), respectivamente. As perdas embrionárias no período foram de 14,81% para o G1, 33,34% para o G2, 25,00% para o G3 e 18,52% para o G4. As médias de peso ao nascimento dos animais pertencentes ao G1 e G2, foram de 26,3 Kg (±1,2; n=6) e 28,8 Kg (±2,1; n=7) respectivamente. As médias dos dias de gestação das receptoras dos grupos G1e G2 foram de 290 dias (±2,1) e 292,8 dias (±1,1) respectivamente. Para avaliar o embrião partenogenético em relação aos embriões fecundados in vitro após 9 dias de cultivo embrionário, foi determinado os resultados para as seguintes variáveis dependentes: taxa de clivagem, taxa de blastocisto, taxa de blastocisto eclodido, número de núcleos e freqüência do RNAm do IFN-&tau; em 6 sessões de produção embrionária. Os resultados foram analisados em fatorial 6x2. Foi observada diferença (P<0.05) nas taxas de clivagem, blastocisto e eclosão entre os tratamentos, houve diferença entre número de núcleos, 231 para os fecundados e 156 para os partenogenéticos (P=0.001), e para a expressão do gene do IFN-&tau;, os embriões partenogenéticos expressaram mais o gene do IFN em relação aos fecundados (P=0.001). Finalmente, Western blots foram realizados para identificar a proteína do IFN-&tau; bovino em embriões fecundados e partenogenéticos após 12 dias de cultivo. Bandas correspondente ao IFN-&tau; foram encontradas nos meios de cultivo onde permaneceram os embriões fecundados e partenogenéticos com peso molecular médio de 24 kDa. Não se detectou uma banda específica ao IFN-&tau; nos extratos embrionários. Tendo em vista o apresentado, conclui-se que apesar dos embriões partenogenéticos expressarem o gene e secretarem a proteína do IFN-&tau;, a transferência de um embrião partenogenético, associado a embriões fecundados in vitro ou in vivo, não favoreceu (P<0.05) ao aumento da taxa de prenhez, mas não prejudicou o desenvolvimento da gestação a termo em bovinos. / The aim of this work was to evaluate the bovine pregnancies rate of in vitro and in vivo produced embryos associated or not to a parthenogenetic embryo in heifers. Two hundred thirty nine recipients were used. The average of pregnancies rate were compared between G1 and G2 (in vitro) and between G3 and G4. (in vivo). The groups were: G1) 1 in vitro fertilized embryo (n=86); G2) 1 parthenogenetic embryo associated with 1 in vitro fertilized embryo (n=81); G3) 1 in vivo fertilized embryo (n=36) and G4) 1 parthenogenetic embryo associated with 1 in vivo fertilized embryo (n=36). Pregnancy rate at day 30 for G1 was 31.3% (27/86) similar to G2 37.0% (30/81); P=0.28. Group 3 rate was 55.5% (20/36) and also similar to G4, 75.0% (27/36); P=0.09. There was no difference (P=0.92) to pregnancy rate at day 60 for G1 compared with G2. The G1 and G2 rates were 26.74% (23/86) and G2 24.69% (20/81) respectively. Also, there were no difference (P=0.08) between G3 and G4. The G3 and G4 rates were 44.4 % (16/36) and 61.1% (22/36) respectively. The embryonic loss in this period was 14.81% for G1, 33.34% for G2, 25.00% for G3 and 18.52% for G4. The calf average weight of these animals from G1 and G2 were respectively 26.3Kg (±1.2; n=6) and 28.8 Kg (±2.1; n=7). The average pregnancy length of the recipients from G1 and G2 were respectively 290 days (±2.1) and 292.8 days (±1.1). To evaluate the parthenogenetic embryo quality, the cleavage rate, blastocyts rate, hatching rate, the number of nuclei, immunocitochemistry for IFN-, and the mRNA frequency of IFN-&tau; was determined in 9 days harvesting parthenogenetic and in vitro fertilized embryos. Difference (P<0.05) was observed in cleaveage, blastocysts and hatching rates, nuclei counting between fertilized embryo (n=231) compared to the parthenogenetic embryo (n=156) and the mRNA relative quantification of the IFN-&tau; gene showed that fertilized embryos have lower expression compared to parthenogenetic embryo (P<0.01). Finally, the western blots analysis for IFN-&tau; protein was performed in 12 days harvested embryos. Bands for IFN-&tau; were found in culture medium from fertilized and parthenogenetic embryos with average molecular weight of 24 kDa. The IFN-&tau; specific protein was not found in the embryonic extracts. In view of the presented results we conclude that despite the production and secretion of IFN-&tau; the association of the parthenogenetic embryo with the fertilized embryo do not favored the pregnancy establishment, however do not interfered in the development of bovine pregnancy to term.

Os IFN-&alpha;2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-&alpha;2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa. / IFN-&alpha;2 is currently utilized in hepatitis B and C, leukemia, multiple myeloma, hairy cell leukemia, melanoma, Kaposi\'s sarcoma, follicular lymphoma, and renal cell carcinoma therapy, with or without other drugs. In this work, a process for E. coli periplasmic interferon-&alpha;2a production and purification utilizing a lambda PL promoter based on constitutive expression was proposed. As a tool for production monitoring, reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis directly from periplasmic extract was validated. Thus, initially it was described a RP-HPLC methodology for qualitative and quantitative analysis of recombinant human interferon-&alpha;2a and interferon-&alpha;2b. The method has been set up and validated for accuracy, precision, linearity, sensitivity and specificity. A recovery test indicated a bias of less than 1% and intra-day and inter-day quantitative determinations presented relative standard deviations always < 4 %, while experimental sensitivity was 0.3 &mu;g (RSD = 5 %). Regarding to linearity, the coefficient of determination was 0.998 (p<0.0001), for a range of analyzed interferon mass from 0,62 to 10 &mu;g. This rapid methodology allows the application of the RP-HPLC as a powerful tool to monitor the production yield and quality of periplasmic Interferon &alpha;2 right after, or even during the fermentation. The optimum expression temperature was evaluated in flask cultures from 30 to 42 °C. It was observed that the volumetric and specific production were higher for culture temperatures equal or above 35 °C. Thus, considering the potential recombinant protein degradation induced by temperature, 35 °C was well-marked as the optimum temperature for interferon expression. The higher values for specific and volumetric production in culture flasks were 1.04 &mu;g/mL/A600 and 3.45 mg/L respectively. As purification method, it was utilized ionic chromatography followed by size-exclusion chromatography. The final purity and mass recovery was, respectively, 95.3 % and 66 %. The final product was also characterized utilizing SDS-PAGE, western blotting, reversed-phase HPLC, size-exclusion HPLC and mass spectrometry analysis.

O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor &lambda;PL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon &alpha;2a (IFN-&alpha;2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-&alpha;2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH. / The expression system based on the PL or PR promoters of the lambda phage that is usually regulated by the term labile repressor (clts) is widely used to produce recombinant proteins in prokaryotic cells. However, the temperature increase required in this system to promote the repressor inactivation shows some limitations, like the increase of the HSP (Heat Shock Proteins) proteins expression, proteases e.g., that depending on the nature of the expressed protein can be harmful or not. Another limitation is the activation of SOS response, resulting on the stop of the DNA cell replication or depending on the strain can occur cell lysis. In this paper we describe the use of the &lambda;PL promoter for constitutive expression, without the repressor regulation. We optimized different cultivation conditions to increase the secretion in the periplasmic space of Escherichia coli of five proteins: the human growth hormone (hGH), that is being widely used in the treatment of children with disabilities and/or resistance to hGH, Turner syndrome, within another disorders; human prolactin (hPRL), a polypeptide hormone known for stimulating the lactation and for exercising regulatory action on growth and on the differentiation of the mammary gland; two hPRL antagonists, studied as potential medicine to the treatment of some kinds of cancers and finally the interferon &alpha;2a (IFN-&alpha;2a), that is a cytokine produced by the cells, in response to different actions, including viral nucleic acids, neoplastic cells, antigens of bacteria, protozoa and viruses. In the case of IFN-&alpha;2a, this high value added and important therapeutic application, was developed in our laboratory as a part of this paper, including the development and the validation of the analysis methodology by reversed-phase HPLC to determine the IFN present in the bacterial periplasmic fluid or in its pure form. The main strategies used to improve the expression were to start the induction with the maximum optical density of bacterial growth and optimize the induction temperature to control the expression of heterologous protein. This methodology can be used in cases where the product wont be toxic to the host cell or when the instability of the plasmid is not a problem. The possibility of cultivation in lower temperatures, since the heat-sensitive repressor is not present, contributed to the significant increase of the expression, even to proteins that are less sensitive to the cultivation temperature, like the hGH.

Lu, Jing. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 119-138). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor &lambda;PL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon &alpha;2a (IFN-&alpha;2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-&alpha;2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH. / The expression system based on the PL or PR promoters of the lambda phage that is usually regulated by the term labile repressor (clts) is widely used to produce recombinant proteins in prokaryotic cells. However, the temperature increase required in this system to promote the repressor inactivation shows some limitations, like the increase of the HSP (Heat Shock Proteins) proteins expression, proteases e.g., that depending on the nature of the expressed protein can be harmful or not. Another limitation is the activation of SOS response, resulting on the stop of the DNA cell replication or depending on the strain can occur cell lysis. In this paper we describe the use of the &lambda;PL promoter for constitutive expression, without the repressor regulation. We optimized different cultivation conditions to increase the secretion in the periplasmic space of Escherichia coli of five proteins: the human growth hormone (hGH), that is being widely used in the treatment of children with disabilities and/or resistance to hGH, Turner syndrome, within another disorders; human prolactin (hPRL), a polypeptide hormone known for stimulating the lactation and for exercising regulatory action on growth and on the differentiation of the mammary gland; two hPRL antagonists, studied as potential medicine to the treatment of some kinds of cancers and finally the interferon &alpha;2a (IFN-&alpha;2a), that is a cytokine produced by the cells, in response to different actions, including viral nucleic acids, neoplastic cells, antigens of bacteria, protozoa and viruses. In the case of IFN-&alpha;2a, this high value added and important therapeutic application, was developed in our laboratory as a part of this paper, including the development and the validation of the analysis methodology by reversed-phase HPLC to determine the IFN present in the bacterial periplasmic fluid or in its pure form. The main strategies used to improve the expression were to start the induction with the maximum optical density of bacterial growth and optimize the induction temperature to control the expression of heterologous protein. This methodology can be used in cases where the product wont be toxic to the host cell or when the instability of the plasmid is not a problem. The possibility of cultivation in lower temperatures, since the heat-sensitive repressor is not present, contributed to the significant increase of the expression, even to proteins that are less sensitive to the cultivation temperature, like the hGH.

In der Veterinärmedizin verursachen Rotaviren als Jungtiererkrankung vor allem in der Nutztierpraxis hohe ökonomische Verluste. Über die Prävalenz von Rotavirusinfektionen bei Hunden und Katzen ist sehr wenig bekannt, obwohl von den in der Literatur als wechselseitig zwischen Mensch und Tier übertragbaren Viren ein nicht zu unterschätzendes Risiko ausgehen kann. Zunächst wurden retrospektiv Prävalenzdaten über den Nachweis von Rotaviren bei Hunden und Katzen mit Durchfall im Vergleich zu Coronaviren und Parvoviren erhoben. Dazu wurden Kotproben von 2055 Hunden und 1481 Katzen quantitativ auf das Vorhandensein von Rota-, Corona- und Parvovirus untersucht. Desweiteren wurden Aspekte der geographischen Verteilung, der Altersverteilung, mögliche Rasseprädispositionen und das Auftreten saisonaler Erkrankungsgipfel untersucht und ausgewertet. Für Rotavirusinfektionen beträgt die statistische Prävalenz 7% bei Hunden und 8% bei Katzen. Bei Hunden und Katzen konnten signifikant häufiger Dreifachinfektionen nachgewiesen werden. Bei einer Infektion mit Rota- und Coronavirus liegt beim Hund zu 100% auch eine Infektion mit Parvovirus vor. Zweifachinfektionen kamen weniger häufig vor als Monoinfektionen. Alle drei Virusinfektionen kamen bei Hunden statistisch signifikant häufiger in der Altersgruppe ≤ 1 Jahr vor. Ein statistisch signifikant häufiger Rotavirusnachweis konnte bei der Katzenrasse Siam nachgewiesen werden, während keine Hunderasse besonders hervortrat. Im Postleitzahlengebiet 3 konnten im Beobachtungszeitraum von 2000 bis 2006 statistisch signifikant häufiger Rotavirusinfektionen bei Hunden nachvollzogen werden. Es konnte sowohl für Hunde, als auch für Katzen der Trend belegt werden, dass bei steigenden Lufttemperaturen, die Anzahl der Rotavirusinfektionen sinkt. Es kann somit von einer bedingten Saisonalität ausgegangen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Empfänglichkeit von Rotaviren gegenüber kommerziell erhältlichem Typ I Interferon (rFeIFN-ω) in vitro getestet. Zunächst wurde zum Nachweis der Aktivität der Typ I Interferone (rFeIFN-ω, rBoIFN-α, rHuIFN-α) die Expression des Mx Proteins auf Zelllinien felinen, caninen, bovinen und humanen Ursprungs, sowie auf Affenzelllinien untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass rBoIFN-α ausschließlich auf Zellen bovinen Ursprungs eine konzentrationsabhängige Expression des Mx Proteins induziert. Das rFeIFN-ω induziert auf Zellen felinen und bei höheren Konzentrationen auch auf Zellen caninen Ursprungs die Expression des Mx Proteins. Das rHuIFN-α zeigt eine konzentrationsabhängige Induktion des Mx Proteins in Zellen humanen, caninen, felinen und bovinen Ursprunges, sowie in Affenzelllinien. Somit konnte in vitro eine Kreuz-Speziesspezifität für rekombinantes humanes Interferon nachgewiesen werden. Zum Nachweis einer immunmodulatorischen Wirkung wurde die Expression der MHC I Oberflächenrezeptoren nach Behandlung mit rFeIFN-ω und rHuIFN-α untersucht. Die Behandlung mit rFeIFN-ω führte ausschließlich in felinen Zellen zu einer konzentrationsabhängigen signifikanten Erhöhung der Rezeptordichte. Die Behandlung mit rHuIFN-α führte zu einer konzentrationsabhängigen signifikanten Erhöhung der Rezeptordichte auf felinen Zellen und in der Affenzelllinie MA104. Die Empfänglichkeit von Rotaviren gegenüber rFeIFN-ω wurde auf der embryonalen felinen Fibroblastenzelllinie (KE-R) und auf der embryonalen felinen Gehirnzelllinine (KG-R) unter steigender Interferonkonzentration (101-104 Einheiten/ml) untersucht. Beide Zelllinien zeigten eine deutliche Reduktion der infizierten Zellen bei steigender Interferonkonzentration. Die antivirale Wirkung war in KE-R Zellen deutlicher ausgeprägt. Dort konnten bereits bei einer Interferonkonzentration von 103 Einheiten/ml keine sichtbar infizierten Zellen mehr nachgewiesen werden, während KG-R Zellen erst bei einer Konzentration von 104 Einheiten/ml keine sichtbar infizierten Zellen mehr nachzuweisen waren. Abschließend wird deutlich, dass Infektionen mit Rotaviren ein vielmals vernachlässigtes Problem in der Veterinärmedizin darstellt, vor allem, wenn man von einer Vergesellschaftung mit den für Hund und Katze pathogenen Viren Corona- und Parvovirus ausgeht. Mit dem rFeIFN-ω steht in vitro eine wirksame antivirale Substanz gegen Rotavirusinfektionen zur Verfügung.