Establishment and maintenance of a successful pregnancy requires signaling from the embryo to the mare, a process known as maternal recognition. Six days after fertilization, the trophectoderm (TE), a placenta precursor is formed. Signals emanating from the TE to the uterine environment are critical to maternal recognition of pregnancy. The identity of factors necessary for this process remain unknown. A novel equine induced trophoblast cell line (iTr) that closely mimics the genotype and phenotype of native equine TE was created. Transcriptome analysis of iTr revealed increased expression of growth factor (GF) receptors for Epidermal GF (EGF), Hepatocyte GF (HGF), Fibroblast GF-2 (FGF-2) and Insulin GF (IGF-1), suggesting these GF may be important targets during TE development in the early embryo. We hypothesized that treatment of iTr cells with these GF would induce changes in cell proliferation and expression of genes likely involved in maternal recognition. The objectives of this experiment were to evaluate the effect of these GFs on iTr mitotic response and regulation of genes involved in steroidogenesis. Equine iTr cells (n = 3) were cultured with 10 ng/mL EGF, HGF, FGF-2 or IGF-1 for 24 hr, with 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) supplementation during the final 2 hr. Subsequently, cells were fixed and EdU positive and total nuclei were enumerated. A parallel plate of iTr cells was treated in a similar manner and lysed for total RNA isolation. Quantitative PCR using gene-specific primers for CYP11A1, PTGS2, PTGES2, and PTGES3 was performed. Data were analyzed by ANOVA with Tukey's post hoc adjustment using the GLM procedure of SAS. Treatment with EGF, FGF-2, HGF, and IGF-1 increased (P < 0.05) iTr proliferation from control levels of 25.33 ± 1.03% to 38.58 ± 1.61%, 45.50 ± 2.94%, and 38.23 ± 2.01% respectively. The 2-&#916;&#916;CT method was used to calculate the fold change (FC) using GAPDH as the reference gene for normalization. Expression of CYP11A2, PTGES2, and PTGES3 was not affected by GF, as measured by qPCR. By contrast, PTGS2 transcript abundance increased (P < 0.05) following FGF-2 (FC = 3.327 ± 0.8291) and HGF (FC = 11.88 ± 4.572) treatment. These results indicate that FGF-2 and HGF may simultaneously induce proliferation and prostaglandin production by TE cells. The combined results of these experiments will improve our understanding of TE morphogenesis and its response to uterine-derived growth factors. / Master of Science / Establishment and maintenance of a pregnancy requires that the mare uterus recognize the presence of the embryo, a process known as maternal recognition of pregnancy. The trophectoderm (TE) are cells on the outer layer of the embryo formed six days after fertilization, which later give origin to the placenta. The TE sends signals from the embryo to the uterus, that are very important for the mare’s recognition of the embryo’s presence. The specific nature of these signals are still unknown in the horse. A cell line (iTr) very similar in aspect and genes to the horse’s native TE has been created in our laboratory. A set of comparative assays have showed that, during the developmental stage of maternal recognition, both the horse TE and the iTr cells share significant identity, and have receptors for the same set of growth factors (GF), suggesting these GF are important for early embryo development and potentially involved in the signaling process of maternal recognition. We proposed that treatment with these GF would induce iTr cells to proliferate and express signals likely involved in maternal recognition in horses. The objectives of this experiments were to evaluate the effect of EGF, HGF, FGF-2 and IGF-1 on iTr cells by measuring proliferation and cellular mechanisms of maternal recognition already established in in other species. Equine iTr cells were cultured with different GF and right before analysis a fluorescent dye that stain dividing cells was added in order to measure the proliferation. Equivalent cell cultures were used to evaluate if the treatment affected the production of hormones involved in signaling maternal recognition. Treatment with all GF induced higher cell proliferation, but HGF also increased the production of one enzyme that participates in producing a very important hormone (prostaglandin E2). The combined results of these experiments add to our understanding of maternal recognition in horses.

Interferon (IFN)τ is the luteotrophic signal in ruminants and is secreted by bovine blastocysts both in vivo and in vitro. IFNτ secretion is highly variable and its control is only partly understood. Most studies on the effects of environmental factors on IFNτ production have evaluated IFNτ production during the time of embryo elongation and attachment. There is less knowledge of how IFNτ production at the blastocyst stage is modulated. Therefore, the hypothesis of this thesis was that the amounts of IFNτ expressed and/or secreted by bovine blastocysts produced in vitro were modulated by environmental factors. In the first set of experiments, bovine embryos were incubated with a cytokine (granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF). GM-CSF had been shown previously to promote embryo viability in a range of species and to modulate IFNτ secretion by ovine blastocysts and thus was classified as a beneficial environmental factor. Three experiments were conducted to test whether GM-CSF stimulated bovine blastocyst development and IFNτ secretion. Embryos were incubated with a range of different concentrations of GM-CSF (2, 5, 10 and 50 ng mL-1) and at different stages of development (1 to 3 and 1 to 9 days post-insemination). Bovine embryos were unresponsive to GM-CSF in terms of IFNτ secretion, pyruvate oxidation, rate of development, blastocyst yield, morphological quality and apoptotic index, irrespective of timing of exposure and/or concentration of GM-CSF. In the second part of the thesis, bovine blastocysts were exposed to a mild heat treatment (42°C for four h) to determine whether heat stress affected IFNτ expression by bovine blastocysts. A novel multiplex reverse-transcription polymerase chain reaction methodology was validated to detect IFNτ and heat shock protein (HSP)70 mRNA in individual bovine embryos relative to an endogenous gene (YWHAZ) and an exogenous mRNA (α-globin) and results were expressed both in absolute terms and in relation to the endogenous control. Heat treatment upregulated IFNτ mRNA expression, suggesting that detrimental environmental factors may influence IFNτ expression. Heat treatment also caused an increase in HSP70 mRNA expression but did not affect blastocyst morphology, suggesting that the level of stress caused by the heat treatment was great enough to activate the cellular stress response, but mild enough not to cause a change in morphology. In addition, the positive correlation between HSP70 and IFNτ transcript levels and the higher IFNτ expression by embryos which showed signs of degeneration and collapse compared to those which progressed in development suggested that IFNτ expression may be indicative of stress. The relationship between IFNτ expression and secretion in vitro with morphology, pyruvate metabolism, apoptotic index and cell number was inconsistent, suggesting that IFNτ production did not correlate with ‘quality’ (defined as an index of viability). Blastocyst yield, day of blastulation and change in morphology index did account for at least part of the variation in IFNτ production, suggesting that some intrinsic factors may regulate IFNτ secretion. These intrinsic factors, however, did not explain all the variation in IFNτ secretion between blastocysts. Therefore, the amount of IFNτ secreted by bovine blastocysts is modulated by both intrinsic and environmental factors. A model was proposed where different levels of stress affect survivability to different extents, and the ability to respond to mild levels of stress may be indicative of improved survivability.

Um dos objetivos deste trabalho foi avaliar e comparar a taxa de prenhez de receptoras bovinas nulíparas, após transferência de embriões fecundados in vitro ou in vivo, associados ou não a um embrião partenogenético. Um total de 239 novilhas foram utilizadas, e as médias das taxas de prenhez aos 30 (TP30d) e 60 dias (TP 60d), foram comparadas em arranjo fatorial 8x2 entre G1 e G2 (fecundados in vitro), e em análise fatorial 3x2, entre G3 e G4 (fecundados in vivo). O delineamento utilizado foi: G1) transferência de 1 embrião fecundado in vitro (n=86); G2) transferência de 1 embrião partenogenético associado a 1 embrião fecundado in vitro (n=81); G3) transferência de 1 embrião fecundado in vivo (n=36) e G4) transferência de 1 embrião partenogenético associado a 1 embrião fecundado in vivo (n=36). A taxa de prenhez aos 30 dias para o G1 foi de 31,3% (27/86) e do G2 de 37,0% (30/81); P= 0,28. Para o G3, de 55,5% (20/36) e G4, de 75,0% (27/36); P=0,09. Não houve diferença (P=0,92) para taxa de prenhez aos 60 dias para o G1 em relação ao G2, com taxas de 24,6% (22/86) e 28,2% (23/81); respectivamente. Também não houve diferença (P=0,08) aos 60 dias para o grupo G3 em relação ao G4, com taxas de 44,4 % (16/36) e 61,1% (22/36), respectivamente. As perdas embrionárias no período foram de 14,81% para o G1, 33,34% para o G2, 25,00% para o G3 e 18,52% para o G4. As médias de peso ao nascimento dos animais pertencentes ao G1 e G2, foram de 26,3 Kg (±1,2; n=6) e 28,8 Kg (±2,1; n=7) respectivamente. As médias dos dias de gestação das receptoras dos grupos G1e G2 foram de 290 dias (±2,1) e 292,8 dias (±1,1) respectivamente. Para avaliar o embrião partenogenético em relação aos embriões fecundados in vitro após 9 dias de cultivo embrionário, foi determinado os resultados para as seguintes variáveis dependentes: taxa de clivagem, taxa de blastocisto, taxa de blastocisto eclodido, número de núcleos e freqüência do RNAm do IFN-&tau; em 6 sessões de produção embrionária. Os resultados foram analisados em fatorial 6x2. Foi observada diferença (P<0.05) nas taxas de clivagem, blastocisto e eclosão entre os tratamentos, houve diferença entre número de núcleos, 231 para os fecundados e 156 para os partenogenéticos (P=0.001), e para a expressão do gene do IFN-&tau;, os embriões partenogenéticos expressaram mais o gene do IFN em relação aos fecundados (P=0.001). Finalmente, Western blots foram realizados para identificar a proteína do IFN-&tau; bovino em embriões fecundados e partenogenéticos após 12 dias de cultivo. Bandas correspondente ao IFN-&tau; foram encontradas nos meios de cultivo onde permaneceram os embriões fecundados e partenogenéticos com peso molecular médio de 24 kDa. Não se detectou uma banda específica ao IFN-&tau; nos extratos embrionários. Tendo em vista o apresentado, conclui-se que apesar dos embriões partenogenéticos expressarem o gene e secretarem a proteína do IFN-&tau;, a transferência de um embrião partenogenético, associado a embriões fecundados in vitro ou in vivo, não favoreceu (P<0.05) ao aumento da taxa de prenhez, mas não prejudicou o desenvolvimento da gestação a termo em bovinos. / The aim of this work was to evaluate the bovine pregnancies rate of in vitro and in vivo produced embryos associated or not to a parthenogenetic embryo in heifers. Two hundred thirty nine recipients were used. The average of pregnancies rate were compared between G1 and G2 (in vitro) and between G3 and G4. (in vivo). The groups were: G1) 1 in vitro fertilized embryo (n=86); G2) 1 parthenogenetic embryo associated with 1 in vitro fertilized embryo (n=81); G3) 1 in vivo fertilized embryo (n=36) and G4) 1 parthenogenetic embryo associated with 1 in vivo fertilized embryo (n=36). Pregnancy rate at day 30 for G1 was 31.3% (27/86) similar to G2 37.0% (30/81); P=0.28. Group 3 rate was 55.5% (20/36) and also similar to G4, 75.0% (27/36); P=0.09. There was no difference (P=0.92) to pregnancy rate at day 60 for G1 compared with G2. The G1 and G2 rates were 26.74% (23/86) and G2 24.69% (20/81) respectively. Also, there were no difference (P=0.08) between G3 and G4. The G3 and G4 rates were 44.4 % (16/36) and 61.1% (22/36) respectively. The embryonic loss in this period was 14.81% for G1, 33.34% for G2, 25.00% for G3 and 18.52% for G4. The calf average weight of these animals from G1 and G2 were respectively 26.3Kg (±1.2; n=6) and 28.8 Kg (±2.1; n=7). The average pregnancy length of the recipients from G1 and G2 were respectively 290 days (±2.1) and 292.8 days (±1.1). To evaluate the parthenogenetic embryo quality, the cleavage rate, blastocyts rate, hatching rate, the number of nuclei, immunocitochemistry for IFN-, and the mRNA frequency of IFN-&tau; was determined in 9 days harvesting parthenogenetic and in vitro fertilized embryos. Difference (P<0.05) was observed in cleaveage, blastocysts and hatching rates, nuclei counting between fertilized embryo (n=231) compared to the parthenogenetic embryo (n=156) and the mRNA relative quantification of the IFN-&tau; gene showed that fertilized embryos have lower expression compared to parthenogenetic embryo (P<0.01). Finally, the western blots analysis for IFN-&tau; protein was performed in 12 days harvested embryos. Bands for IFN-&tau; were found in culture medium from fertilized and parthenogenetic embryos with average molecular weight of 24 kDa. The IFN-&tau; specific protein was not found in the embryonic extracts. In view of the presented results we conclude that despite the production and secretion of IFN-&tau; the association of the parthenogenetic embryo with the fertilized embryo do not favored the pregnancy establishment, however do not interfered in the development of bovine pregnancy to term.

Um dos objetivos deste trabalho foi avaliar e comparar a taxa de prenhez de receptoras bovinas nulíparas, após transferência de embriões fecundados in vitro ou in vivo, associados ou não a um embrião partenogenético. Um total de 239 novilhas foram utilizadas, e as médias das taxas de prenhez aos 30 (TP30d) e 60 dias (TP 60d), foram comparadas em arranjo fatorial 8x2 entre G1 e G2 (fecundados in vitro), e em análise fatorial 3x2, entre G3 e G4 (fecundados in vivo). O delineamento utilizado foi: G1) transferência de 1 embrião fecundado in vitro (n=86); G2) transferência de 1 embrião partenogenético associado a 1 embrião fecundado in vitro (n=81); G3) transferência de 1 embrião fecundado in vivo (n=36) e G4) transferência de 1 embrião partenogenético associado a 1 embrião fecundado in vivo (n=36). A taxa de prenhez aos 30 dias para o G1 foi de 31,3% (27/86) e do G2 de 37,0% (30/81); P= 0,28. Para o G3, de 55,5% (20/36) e G4, de 75,0% (27/36); P=0,09. Não houve diferença (P=0,92) para taxa de prenhez aos 60 dias para o G1 em relação ao G2, com taxas de 24,6% (22/86) e 28,2% (23/81); respectivamente. Também não houve diferença (P=0,08) aos 60 dias para o grupo G3 em relação ao G4, com taxas de 44,4 % (16/36) e 61,1% (22/36), respectivamente. As perdas embrionárias no período foram de 14,81% para o G1, 33,34% para o G2, 25,00% para o G3 e 18,52% para o G4. As médias de peso ao nascimento dos animais pertencentes ao G1 e G2, foram de 26,3 Kg (±1,2; n=6) e 28,8 Kg (±2,1; n=7) respectivamente. As médias dos dias de gestação das receptoras dos grupos G1e G2 foram de 290 dias (±2,1) e 292,8 dias (±1,1) respectivamente. Para avaliar o embrião partenogenético em relação aos embriões fecundados in vitro após 9 dias de cultivo embrionário, foi determinado os resultados para as seguintes variáveis dependentes: taxa de clivagem, taxa de blastocisto, taxa de blastocisto eclodido, número de núcleos e freqüência do RNAm do IFN-&tau; em 6 sessões de produção embrionária. Os resultados foram analisados em fatorial 6x2. Foi observada diferença (P<0.05) nas taxas de clivagem, blastocisto e eclosão entre os tratamentos, houve diferença entre número de núcleos, 231 para os fecundados e 156 para os partenogenéticos (P=0.001), e para a expressão do gene do IFN-&tau;, os embriões partenogenéticos expressaram mais o gene do IFN em relação aos fecundados (P=0.001). Finalmente, Western blots foram realizados para identificar a proteína do IFN-&tau; bovino em embriões fecundados e partenogenéticos após 12 dias de cultivo. Bandas correspondente ao IFN-&tau; foram encontradas nos meios de cultivo onde permaneceram os embriões fecundados e partenogenéticos com peso molecular médio de 24 kDa. Não se detectou uma banda específica ao IFN-&tau; nos extratos embrionários. Tendo em vista o apresentado, conclui-se que apesar dos embriões partenogenéticos expressarem o gene e secretarem a proteína do IFN-&tau;, a transferência de um embrião partenogenético, associado a embriões fecundados in vitro ou in vivo, não favoreceu (P<0.05) ao aumento da taxa de prenhez, mas não prejudicou o desenvolvimento da gestação a termo em bovinos. / The aim of this work was to evaluate the bovine pregnancies rate of in vitro and in vivo produced embryos associated or not to a parthenogenetic embryo in heifers. Two hundred thirty nine recipients were used. The average of pregnancies rate were compared between G1 and G2 (in vitro) and between G3 and G4. (in vivo). The groups were: G1) 1 in vitro fertilized embryo (n=86); G2) 1 parthenogenetic embryo associated with 1 in vitro fertilized embryo (n=81); G3) 1 in vivo fertilized embryo (n=36) and G4) 1 parthenogenetic embryo associated with 1 in vivo fertilized embryo (n=36). Pregnancy rate at day 30 for G1 was 31.3% (27/86) similar to G2 37.0% (30/81); P=0.28. Group 3 rate was 55.5% (20/36) and also similar to G4, 75.0% (27/36); P=0.09. There was no difference (P=0.92) to pregnancy rate at day 60 for G1 compared with G2. The G1 and G2 rates were 26.74% (23/86) and G2 24.69% (20/81) respectively. Also, there were no difference (P=0.08) between G3 and G4. The G3 and G4 rates were 44.4 % (16/36) and 61.1% (22/36) respectively. The embryonic loss in this period was 14.81% for G1, 33.34% for G2, 25.00% for G3 and 18.52% for G4. The calf average weight of these animals from G1 and G2 were respectively 26.3Kg (±1.2; n=6) and 28.8 Kg (±2.1; n=7). The average pregnancy length of the recipients from G1 and G2 were respectively 290 days (±2.1) and 292.8 days (±1.1). To evaluate the parthenogenetic embryo quality, the cleavage rate, blastocyts rate, hatching rate, the number of nuclei, immunocitochemistry for IFN-, and the mRNA frequency of IFN-&tau; was determined in 9 days harvesting parthenogenetic and in vitro fertilized embryos. Difference (P<0.05) was observed in cleaveage, blastocysts and hatching rates, nuclei counting between fertilized embryo (n=231) compared to the parthenogenetic embryo (n=156) and the mRNA relative quantification of the IFN-&tau; gene showed that fertilized embryos have lower expression compared to parthenogenetic embryo (P<0.01). Finally, the western blots analysis for IFN-&tau; protein was performed in 12 days harvested embryos. Bands for IFN-&tau; were found in culture medium from fertilized and parthenogenetic embryos with average molecular weight of 24 kDa. The IFN-&tau; specific protein was not found in the embryonic extracts. In view of the presented results we conclude that despite the production and secretion of IFN-&tau; the association of the parthenogenetic embryo with the fertilized embryo do not favored the pregnancy establishment, however do not interfered in the development of bovine pregnancy to term.

O embrião equino apresenta um desenvolvimento dinâmico por um longo período entre a fertilização, sua entrada no útero, fixação e posterior invasão trofoblástica após o 36º dia da gestação. Durante todo este período o concepto é sustentado pelo histotrofo endometrial. Estas características dos equídeos favorecem o seu uso com modelo experimental in vivo para estudos nos desenvolvimentos e interações fetal e maternal. Os estudos em endométrio equino tiveram foco em eventos fisiológicos nas diferentes fases do ciclo estral, enquanto os estudos aos primeiros momentos da gestação são escassos. O entendimento do processo de remodelação e morfofisiologia do endométrio após a entrada do embrião no útero não é completamente entendido. O objetivo deste trabalho foi estudar a morfofisiologia endometrial da gestação na égua envolvendo os períodos pós-fixação e peri-implantação, por histologia e microscopia eletrônica de varredura. A característica mais marcante da transformação ou adaptação endometrial à gestação foi o quase total desaparecimento das células ciliadas na superfície epitelial em ambos cornos uterinos. A capacidade de secreção das células microvilosas também passou por mudanças com o avanço gestacional. Muitas células secretórias ingurgitadas e protusas formam a maioria da população do epitélio, onde o histotrofo se acumula, e apresentaram erosões em sua superfície, provavelmente pela secreção apócrina de vesículas. A superfície epitelial apresentou pleomorfismo celular e pseudoestratificação, promovida por intensa hiperplasia celular, acompanhada de adensamento das glândulas endometriais, desde o 21º dia da gestação diminuído após o 36º dia. Linfócitos, provavelmente uNK, foram encontrados no epitélio luminal do endométrio já aos 21 dias de gestação em ambos cornos, gravídico e não gravídico. Foi evidenciado o septamento no epitélio luminal, com sulcos formados aos 35 e 36 dias, tornando-se mais profundos aos 42 dias de gestação. Toda esta evolução e adaptação contínua aconteceram principalmente no corno gravídico acompanhados em menor intensidade pelo corno não gravídico. / The equine embryo plays a dynamic development for a long period between fertilization, its entry into the uterus, fixes and subsequent trophoblastic invasion after day 36 of gestation. Throughout this period, the conceptus is supported by endometrial histotrophe. These equids characteristics favor their use as an in vivo experimental model for studying the changes and interactions in fetal and maternal development. Studies in equine endometrium were focused on physiological events in the different phases of the estrous cycle, while studies in early moments of pregnancy are scant. The process of endometrial remodeling and morphophysiology after the maternal recognition of pregnancy is not completely understood. The objective of this work was to study the endometrial morphophysiology in the mare comprising post-fixation and peri-implantation periods, by histology and scanning electron microscopy. The most striking feature of endometrial transformation or adaptation to pregnancy was the almost total ciliated cells disappearance of the epithelial surface in both uterine horns. In addition, the secretory capacity of microvillus cells underwent changes with gestational age. Many engorged and protruded secretory cells were the majority epithelium population where histotroph accumulates, and showed erosions on its surface, probably by apocrine vesicle secretion. The epithelial surface also showed cellular pleomorphic and pseudostratified epithelium as a result of intense cell hyperplasia. It was accompanied by thickening of the endometrial glands from day 21 of gestation, then decreasing after the 36th day. Lymphocytes, probably uNK, were found in the luminal epithelium of the endometrium since 21st day of gestation in both pregnant and not pregnant horns. Septation was evidenced in the luminal epithelium, with sulci formed at 35 days, becoming deeper at 42 days of pregnancy. All this continued evolution and adaptation occurred mainly in the gravid horn accompanied in less intensity by non-gravid horn.

O embrião equino apresenta um desenvolvimento dinâmico por um longo período entre a fertilização, sua entrada no útero, fixação e posterior invasão trofoblástica após o 36º dia da gestação. Durante todo este período o concepto é sustentado pelo histotrofo endometrial. Estas características dos equídeos favorecem o seu uso com modelo experimental in vivo para estudos nos desenvolvimentos e interações fetal e maternal. Os estudos em endométrio equino tiveram foco em eventos fisiológicos nas diferentes fases do ciclo estral, enquanto os estudos aos primeiros momentos da gestação são escassos. O entendimento do processo de remodelação e morfofisiologia do endométrio após a entrada do embrião no útero não é completamente entendido. O objetivo deste trabalho foi estudar a morfofisiologia endometrial da gestação na égua envolvendo os períodos pós-fixação e peri-implantação, por histologia e microscopia eletrônica de varredura. A característica mais marcante da transformação ou adaptação endometrial à gestação foi o quase total desaparecimento das células ciliadas na superfície epitelial em ambos cornos uterinos. A capacidade de secreção das células microvilosas também passou por mudanças com o avanço gestacional. Muitas células secretórias ingurgitadas e protusas formam a maioria da população do epitélio, onde o histotrofo se acumula, e apresentaram erosões em sua superfície, provavelmente pela secreção apócrina de vesículas. A superfície epitelial apresentou pleomorfismo celular e pseudoestratificação, promovida por intensa hiperplasia celular, acompanhada de adensamento das glândulas endometriais, desde o 21º dia da gestação diminuído após o 36º dia. Linfócitos, provavelmente uNK, foram encontrados no epitélio luminal do endométrio já aos 21 dias de gestação em ambos cornos, gravídico e não gravídico. Foi evidenciado o septamento no epitélio luminal, com sulcos formados aos 35 e 36 dias, tornando-se mais profundos aos 42 dias de gestação. Toda esta evolução e adaptação contínua aconteceram principalmente no corno gravídico acompanhados em menor intensidade pelo corno não gravídico. / The equine embryo plays a dynamic development for a long period between fertilization, its entry into the uterus, fixes and subsequent trophoblastic invasion after day 36 of gestation. Throughout this period, the conceptus is supported by endometrial histotrophe. These equids characteristics favor their use as an in vivo experimental model for studying the changes and interactions in fetal and maternal development. Studies in equine endometrium were focused on physiological events in the different phases of the estrous cycle, while studies in early moments of pregnancy are scant. The process of endometrial remodeling and morphophysiology after the maternal recognition of pregnancy is not completely understood. The objective of this work was to study the endometrial morphophysiology in the mare comprising post-fixation and peri-implantation periods, by histology and scanning electron microscopy. The most striking feature of endometrial transformation or adaptation to pregnancy was the almost total ciliated cells disappearance of the epithelial surface in both uterine horns. In addition, the secretory capacity of microvillus cells underwent changes with gestational age. Many engorged and protruded secretory cells were the majority epithelium population where histotroph accumulates, and showed erosions on its surface, probably by apocrine vesicle secretion. The epithelial surface also showed cellular pleomorphic and pseudostratified epithelium as a result of intense cell hyperplasia. It was accompanied by thickening of the endometrial glands from day 21 of gestation, then decreasing after the 36th day. Lymphocytes, probably uNK, were found in the luminal epithelium of the endometrium since 21st day of gestation in both pregnant and not pregnant horns. Septation was evidenced in the luminal epithelium, with sulci formed at 35 days, becoming deeper at 42 days of pregnancy. All this continued evolution and adaptation occurred mainly in the gravid horn accompanied in less intensity by non-gravid horn.

O embrião equino apresenta um desenvolvimento dinâmico por um longo período entre a fertilização, sua entrada no útero, fixação e posterior invasão trofoblástica após o 36º dia da gestação. Durante todo este período o concepto é sustentado pelo histotrofo endometrial. Estas características dos equídeos favorecem o seu uso com modelo experimental in vivo para estudos nos desenvolvimentos e interações fetal e maternal. Os estudos em endométrio equino tiveram foco em eventos fisiológicos nas diferentes fases do ciclo estral, enquanto os estudos aos primeiros momentos da gestação são escassos. O entendimento do processo de remodelação e morfofisiologia do endométrio após a entrada do embrião no útero não é completamente entendido. O objetivo deste trabalho foi estudar a morfofisiologia endometrial da gestação na égua envolvendo os períodos pós-fixação e peri-implantação, por histologia e microscopia eletrônica de varredura. A característica mais marcante da transformação ou adaptação endometrial à gestação foi o quase total desaparecimento das células ciliadas na superfície epitelial em ambos cornos uterinos. A capacidade de secreção das células microvilosas também passou por mudanças com o avanço gestacional. Muitas células secretórias ingurgitadas e protusas formam a maioria da população do epitélio, onde o histotrofo se acumula, e apresentaram erosões em sua superfície, provavelmente pela secreção apócrina de vesículas. A superfície epitelial apresentou pleomorfismo celular e pseudoestratificação, promovida por intensa hiperplasia celular, acompanhada de adensamento das glândulas endometriais, desde o 21º dia da gestação diminuído após o 36º dia. Linfócitos, provavelmente uNK, foram encontrados no epitélio luminal do endométrio já aos 21 dias de gestação em ambos cornos, gravídico e não gravídico. Foi evidenciado o septamento no epitélio luminal, com sulcos formados aos 35 e 36 dias, tornando-se mais profundos aos 42 dias de gestação. Toda esta evolução e adaptação contínua aconteceram principalmente no corno gravídico acompanhados em menor intensidade pelo corno não gravídico. / The equine embryo plays a dynamic development for a long period between fertilization, its entry into the uterus, fixes and subsequent trophoblastic invasion after day 36 of gestation. Throughout this period, the conceptus is supported by endometrial histotrophe. These equids characteristics favor their use as an in vivo experimental model for studying the changes and interactions in fetal and maternal development. Studies in equine endometrium were focused on physiological events in the different phases of the estrous cycle, while studies in early moments of pregnancy are scant. The process of endometrial remodeling and morphophysiology after the maternal recognition of pregnancy is not completely understood. The objective of this work was to study the endometrial morphophysiology in the mare comprising post-fixation and peri-implantation periods, by histology and scanning electron microscopy. The most striking feature of endometrial transformation or adaptation to pregnancy was the almost total ciliated cells disappearance of the epithelial surface in both uterine horns. In addition, the secretory capacity of microvillus cells underwent changes with gestational age. Many engorged and protruded secretory cells were the majority epithelium population where histotroph accumulates, and showed erosions on its surface, probably by apocrine vesicle secretion. The epithelial surface also showed cellular pleomorphic and pseudostratified epithelium as a result of intense cell hyperplasia. It was accompanied by thickening of the endometrial glands from day 21 of gestation, then decreasing after the 36th day. Lymphocytes, probably uNK, were found in the luminal epithelium of the endometrium since 21st day of gestation in both pregnant and not pregnant horns. Septation was evidenced in the luminal epithelium, with sulci formed at 35 days, becoming deeper at 42 days of pregnancy. All this continued evolution and adaptation occurred mainly in the gravid horn accompanied in less intensity by non-gravid horn.

Orientador: Cezinande de Meira / Resumo: O presente estudo teve como objetivo descrever o perfil proteico do embrião equino e do fluido uterino durante a fase inicial do reconhecimento materno da gestação. Foram utilizadas 10 éguas, sem anormalidades uterinas, de 5 a 8 anos de idade. O acompanhamento folicular diário foi realizado até a detecção de um folículo (35 mm) para indução da ovulação, o dia seguinte realizava a inseminação artificial e posteriormente o D0 sendo o dia da ovulação da égua. O líquido uterino foi colhido, usando tampão vaginal comercial de humanos nos dias 7 (D7), 10 (D10) e 12 (D12) de gestação. Nos mesmos períodos, após a retirada do tampão vaginal, os embriões foram colhidos por fluxo retrógrado utilizando-se tampão fosfato-salina pH 7,2. O processamento do líquido uterino foi de centrifugação e dos embriões foram sonicação e centrifugação para proteômica. A concentração de proteína total foi determinada e uma alíquota (50 µg) foi digerida “in solution” com tripsina, seguida da análise por espectrometria de massas. Após a análise estatística multivariada, foram identificadas 171 proteínas, sendo 29 no embrião e 142 no líquido uterino. Foram encontradas 15 proteínas mais abundantes nos embriões, sendo 10 no D10 e 5 no D12. Já no líquido uterino, 6 proteínas foram mais abundantes no D7, 3 no D10 e 6 no D12. As principais funções moleculares foram atividade catalítica e de ligação e os processos biológicos mais significativos foram o processo celular e metabólico. Este estudo descreveu proteína... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to describe the protein profile of the equine embryo and uterine fluid, during the maternal recognition of pregnancy. Ten mares from 5 to 8 years of age, without uterine abnormalities were used. Daily follicular monitoring was performed until the detection of the preovulatory follicle (35 mm) to induce ovulation, the next day performed artificial insemination and then D0 was the mare's ovulation day. The uterine fluid was collected using commercial human vaginal tampon at 7 (D7), 10 (D10) and 12 (D12) of the gestation. In the same moments, after withdraw vaginal tampon, the embryos were collected by retrograde flushing using phosphate-saline buffer pH 7.2. The processing of the uterine fluid was centrifugation and the embryos were sonicated and centrifuged for proteomics. The total protein concentration was determined and an aliquot (50 µg) was digested “in solution” with trypsin, followed by analysis by mass spectrometry. After data analysis by multivariate statistical, 171 proteins were identified, 29 in the embryo and 142 in the uterine fluid. Fifteen abudant proteins were found in the embryos, 10 proteins in the D10 and 5 in the D12. In the uterine fluid, 6 proteins were more abundant in the D7, 3 in the D10 and 6 in the D12. The main molecular functions were catalytic and binding activity and the most significant biological processes were the cellular and metabolic processes. This study described proteins that were abundants in the uterine fluid... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.