Avec environ 49 000 nouvelles femmes touchées chaque année, le cancer du sein est le plus répandu des cancers féminins. Le dépistage du cancer du sein, ainsi que l'amélioration des traitements ont fait diminuer la mortalité mais il reste encore le plus meurtrier des cancers féminins en France. Le cancer du sein étant une maladie hétérogène, individualiser les traitements des patientes est désormais l'un des objectifs premiers des praticiens. C'est autour de cet objectif commun que se sont articulés les 2 projets de ce travail de thèse. D'une part, pour l'étude clinique, j'ai établi une base de données sur la stratégie néoadjuvante des cancers du sein opérables, regroupant 318 patientes traitées à l'institut Jean Godinot. Cette base nous permet de comparer nos résultats à ceux de la littérature, de mettre en avant l'intérêt de la chimiothérapie néoadjuvante pour déterminer de nouveaux facteurs pronostics, et de valider l'évaluation des résidus tumoraux dans le sein et les ganglions par l'index RDBN. D'autre part, l'étude expérimentale nous a permis d'améliorer nos connaissances sur les mécanismes moléculaires d'échappement tumoral. Nous avons ainsi démontré le rôle pro-tumoral de l'IL-17A mais aussi de l'IL-17E, ces deux cytokines pouvant être présentes dans le microenvironnement tumoral, et mis en évidence leur implication dans la dérégulation du cycle cellulaire à travers la génération des LMW-E et l'acquisition d'un mécanisme de chimiorésistance. / With around 49 000 new affected women each year, breast cancer is the most common of feminine cancers. Breast cancer screening, and treatments improvements make mortality decreased but it stays the most murderous of feminine cancers in France.Breast cancer being a heterogeneous disease, individualizing patients' treatments is now one of first goals of practitioner. It is around of this common aim that my 2 thesis projects are turned on.On the one side, for clinical study, I designed a database on the neoadjuvant strategy of operable breast cancers, assembling 318 patients treated at Jean Godinot institute. This database allow us to compare our results with literature ones, to highlight the interest of neoadjuvant chemotherapy to determine new prognostic factors, and to validate evaluation of residual disease in breast and nodes by RDBN index.On the other side experimental study allowed us to improve our knowledge on molecular mechanisms of tumor escape. We demonstrated pro-tumoral role of IL-17A but also of IL-17E, these two cytokines can be presents in tumoral microenvironment, and evidenced their implication in cell cycle dysregulation through generation of LMW-E and acquisition of chemoristance mechanisms.

L'interleukine-17A (IL-17A) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) sont des cytokines pro-inflammatoires impliquées dans la pathogénèse de plusieurs maladies articulaires. Au cours de la polyarthrite rhumatoïde (PR), une augmentation de la destruction osseuse ainsi qu'un defaut de réparation sont responsables des dommages articulaires. Cependant au cours de la spondylarthrite ankylosante (AS), une importante ossification ectopique est observée, conduisant à la formation de syndesmophytes, associé à une perte de la masse osseuse systémique. Récemment, l'étude de ces cytokines a conduit à la publication de résultats contradictoires. Notre objectif a donc été d'étudier l'effet de ces deux cytokines sur la différenciation ostéogénique de cellules souches mésenchymateuses humaines isolées (hMSCs) et de fibroblastes de la membrane synoviale (FLS). Tous les modèles de cellules utilisés, ont démontré que l'IL-17A et le TNF-α augmentent de manière synergique l'ostéogénèse. Ceci semble se rapprocher du modèle de l'AS où une formation d'os ectopique est observée dans laquelle l'IL-17A et le TNF-α jouent un rôle majeur. En parallèle, ces deux cytokines stimulent localement les ostéoclastes, entraînant une perte de masse osseuse observée à la fois dans la PR et dans l'ostéoporose. Cibler simultanément l'IL-17A et le TNF-α pourrait conduire à une diminution de l'infiltration de cellules et de la destruction articulaire observée dans la PR et pourrait ainsi réduire les effets des FLS PR sur l'activation de l'ostéoclastogénèse / Interleukin-17A (IL-17A) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) are pro-inflammatory cytokines involved in the pathogenesis of several arthritic diseases. In rheumatoid arthritis (RA), joint damage is a result of an increase in bone destruction and a decrease in bone repair. In contrast, in ankylosing spondylitis (AS), a bone mass loss accompanied by a significant ectopic ossification is observed leading to the formation of syndesmophytes. Recent studies led to contradictory findings regarding the role of IL-17A and TNF-α in arthritic disease. Therefore, our objective was to study the effect of these two cytokines on the osteogenic differentiation of isolated human mesenchymal stem cells (hMSCs) and fibroblasts of the synovial membrane (FLS). In all the cell models used, we demonstrated that Il-17A and TNF α synergistically increase osteogenesis. This seems to approach the model of AS where ectopic bone formation is observed and in which IL-17A and TNF-α both are involved. These cytokines stimulate osteoclasts locally resulting in loss of bone mass observed in both RA and osteoporosis. Thus, targeting IL-17A and TNF-α could lead to a decrease in cell infiltration and joint destruction which is observed in RA and may reduce the effects of RA FLS on the activation of osteoclastogenesis

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L'interleukine-6 (IL-6) exerce des propriétés biologiques multiples telles que l'activation des cellules immunocompétentes, l'activation de la réponse inflammatoire et l'hématopoïèse. Produite également par les cellules tumorales, l'IL-6 impacte la prolifération, la différenciation et la survie de ces dernières. L'IL-6 représente donc depuis plusieurs années une cible thérapeutique pertinente. Dans la première partie de ce travail, nous avons exploré une nouvelle piste potentielle pour bloquer l'activité biologique de l'IL-6, en utilisant un antagoniste naturel que notre équipe a identifié dans plusieurs lignées d'adénocarcinomes du rein, à savoir la molécule tronquée tIL-6. Suite à l'évaluation comparée de deux systèmes d'expression (E. coli versus CHO), nous avons retenu les cellules CHO comme source de production de fractions enrichies en tIL-6 par chromatographie de gel d'exclusion. Disposant d'un panel d'adénocarcinomes de rein (ACHN, Caki1, CLB CHA, CLB VER) et d'une lignée érythroleucémique (TF1), l'activité fonctionnelle de tIL-6 in vitro a été étudiée sur (1) la signalisation IL-6 induite, (2) la prolifération cellulaire IL-6 induite, la survie cellulaire et (4) la modulation de l'expression de protéines relevantes de l'apoptose. La molécule tIL-6 bloque la phosphorylation de la tyrosine Tyr705 de STAT3, qui est un des éléments clés de la voie de signalisation de l'IL-6. Nous rapportons également une autre observation nouvelle indiquant que tIL-6 exerce un effet pro-apoptotique sur certaines lignées RCC. Dans la seconde partie de notre étude, l'impact d'un Ac Mo anti IL-6 dans la réversion de la résistance aux cytotoxiques ou à la radiothérapie a été étudié. Nos résultats démontrent que la voie IL-6 ne constituerait pas un mécanisme majeur de résistance / Interleukin-6 (IL-6) plays numerous physiological roles including haematopoiesis, immune response and inflammation, but also plays a role in modulating cell growth, differentiation and survival of tumors cells. The first goal of the present study was to investigate on the potential role of the truncated protein IL-6 (tIL-6) encoded by the spliced IL-6 mRNA discovered in renal carcinoma cells (RCC). The R&D program was designed based on an industrial approach, aiming at reaching the decision stage to enter or not into preclinical development. Firstly two different expression systems were investigated (E. coli versus CHO cell line). The mammalian expression system was selected as the protein source since a recombinant glycosylated tIL-6 with a molecular weight similar to the predicted natural molecule was obtained from enriched fractions following size exclusion chromatography. Secondly by using a cell line panel including renal carcinoma cells (ACHN, Caki-1, CLB CHA, CLB-VER ) and an erythroleucemic cell line (TF1), in vitro tIL-6 functional activity were analyzed on (1) IL-6 induced signaling, (2) IL-6 induced cell proliferation, (3) on cell survival and also (4) on expression of specific set of proteins involved in apoptosis pathways. The truncated IL-6 was found inhibit IL-6 induced STAT3 Tyr705 and to induce apoptosis in some RCC cell lines which could be depending on IL-6 expression. Understanding more precisely the role of natural truncated IL-6 and its impact in cell tumour growth control will be a major issue in the development of innovative approach to antagonize directly or not IL6. The second goal of the present study was to investigate on reversing resistance of cancer cell lines to cytotoxics or ionizing radiations through the use of a monoclonal antibody directed against IL-6. Our data support the fact that IL-6 is not the preponderant actor of cell resistance to cytotoxics and ionizing radiations, which seems to be regulated by a complex network of proteins

La fonction et la différenciation des cellules de Leydig sont connues pour être régulées par différents stimuli incluant 1' hormone lutéinisante (LB) et autres facteurs paracrines et autocrines comme les cytokines dont 1 ' IL-1. NUR 77 est un facteur de transcription présent au niveau des cellules de Leydig et impliqué dans la régulation de la stéroïdogenèse. Malgré que Nur77 soit connu pour être régulé par les cytokines dans différents types cellulaires, cette régulation n 'est pas encore bien caractérisée au niveau des cellules de Leydig. Afin de mieux comprendre la régulation de Nur77 par les cytokines, j ' ai décidé d'étudier l' effet de deux facteurs de transcription, C/EBP~ et NF -KB, connus pour être impliqués dans les voies de signalisation des cytokines, sur le promoteur Nur77. J'ai trouvé que les facteurs de transcription C/EBP~ et NF -KB coopèrent ensemble dans l'activation du promoteur Nur77. Cette coopération nécessite la présènce d'au moins un des deux éléments nouvellement identifiés dans cette étude : C/EBP~ (à -110 pb en fonction du site d'initiation de la transcription) ou p50 (KB à -18 pb). L'activation du promoteur Nur77 par ces facteurs de transcription appuie mon hypothèse selon laquelle NUR 77 peut être un effecteur dans la voie de signalisation des cytokines comme 1 'IL-l.

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+.<p>Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique.<p><p>Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV.<p>L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La barrière hémo-encéphalique (BHE) est formée des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales reliées entre elles par des jonctions serrées. Grâce à sa perméabilité restreinte et sélective, la BHE entrave le passage des molécules et cellules du sang vers le système nerveux central (SNC). Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), une maladie inflammatoire du SNC, la rupture de la BHE permet aux cellules immunes actives d'infiltrer le tissu cérébral. Il s'ensuit une réaction inflammatoire excessive au cours de laquelle d'autres leucocytes sont recrutés dans le cerveau et qui culmine par la formation des plaques de démyélinisation caractéristiques de la SEP. On dénote au niveau de ces lésions une présence importante de lymphocytes T CD4⁺ activés et de cytokines pro-inflammatoires propres à une réponse de type TH1, tels l’IFN-γ et l’IL-1. Curieusement cependant, l’inhibition de la voie TH1 n’empêche pas l’apparition de la maladie dans le modèle murin de la SEP et en aggrave même les symptômes. On attribue maintenant aux lymphocytes TH17, nommées en raison de leur capacité à produire de l’IL-17, un rôle clé dans le développement de la maladie. L’objectif de ce travail de thèse visait à caractériser les lymphocytes TH17 chez l’humain et définir leur contribution exacte dans la fragilisation de la BHE, une étape décisive dans la formation des lésions de SEP. Pour ce faire, nous avons mis au point une méthode expérimentale permettant l’expansion in vitro de populations de lymphocytes TH17 à partir de cellules mononuclées du sang de donneurs sains. Nos travaux démontrent que l’IL-23 induit la production d’IL-17, d’IL-22 et de granzyme B par les lymphocytes T CD4⁺CD45RO⁺ mémoires humains et qu’une proportion des cellules exprime de manière concomitante de l’IL-17 et de l’IFN-γ. La fréquence des lymphocytes T CD4⁺ IL17⁺, IL-22⁺ et des doubles positifs IL-17⁺IFN-γ⁺ est significativement plus élevée dans les lignées de lymphocytes TH17 provenant de patientes en poussée que dans celles de contrôles. Nos analyses démontrent que les cellules endothéliales de la BHE expriment de faibles niveaux des récepteurs de l’IL-17 et de l’IL-22 à l’état basal mais que leur présence est accrue dans le cerveau de patients atteints de SEP. L’activation du récepteur de l’IL-17 entraîne une augmentation de la perméabilité de la BHE et une perturbation de l’organisation des protéines de jonction occludine et ZO-1. Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes TH17 à travers la BHE est régie en grande partie par la molécule d’adhérence ICAM-1 et que les lymphocytes qui co-expriment l’IL-17 et l’IFN-γ sont plus aptes à franchir la BHE que ceux qui produisent uniquement l’une ou l’autre de ces cytokines. Nous retrouvons d’ailleurs des cellules qui expriment simultanément les facteurs de transcription T-bet et RORC, associés respectivement aux lymphocytes TH1 et aux TH17, au sein des infiltrats péri-vasculaires des lésions actives de SEP. Les travaux présentés dans cette thèse auront permis d’affiner nos connaissances sur les mécanismes d’entrée des lymphocytes TH17 dans le SNC et les propriétés délétères des cytokines qu’ils sécrètent, notamment dans l’activation et la déstabilisation de l’endothélium cérébral. / The blood-brain barrier (BBB) plays a crucial role in protecting the central nervous system (CNS) by restricting entry of cells and molecules into the brain. In the CNS disorder multiple sclerosis (MS), breakdown of the BBB allows activated leukocytes to infiltrate the brain parenchyma, leading to the formation of the characteristic demyelinated lesions. For decades, MS was viewed as a TH1-mediated disease, a notion that was largely supported by studies in its animal model and by the abundance of prototypical TH1-associated cytokines within active MS lesions. However, over the years, accumulating evidence has highlighted the involvement of another subset of CD4⁺ T cells that express IL-17, therefore named TH17 lymphocytes, in the pathology of the disease. The goal of the work presented herein was to characterize the human TH17 lymphocyte population and define their contribution to the disruption of the BBB and leukocyte infiltration into the CNS, both important early events in the formation of MS lesions. To do so, we developed and optimized a method to successfully generate human TH17 lines in vitro from peripheral blood mononuclear cells of healthy donors. We demonstrate that in response to IL-23, human memory CD4⁺CD45RO⁺ but not naïve CD4⁺CD45RA⁺ T lymphocytes produce IL-17, IL-22, and granzyme B, with a subset of cells simultaneously expressing IL-17 and IFN-γ. Interestingly, we measure a significant increase in the percentage of T CD4⁺ IL17⁺, of IL-22⁺, and of IL-17⁺IFN-γ⁺ dual producers in TH17 cell lines expanded from the peripheral blood of acutely relapsing MS women as compared to those generated from healthy controls and remitting MS patients. We show that both IL-17 and IL-22 receptors are upregulated on BBB endothelial cells in situ during inflammation and that IL-17 enhances BBB permeability by disrupting the integrity of tight junction proteins occludin and ZO-1. Finally, we provide evidence that TH17 lymphocytes transmigrate efficiently across human brain endothelial cells via the adhesion molecule ICAM-1 and show that IL-17⁺IFN-γ⁺ double producers have an increased propensity to do so. Accordingly, we detect lymphocytes that display immunoreactivity against both the TH1- and TH17-associated transcription factors T-bet and RORC within perivascular infiltrates of active MS lesions. The work presented in this thesis has refined our understanding of the mechanisms that drive TH17 lymphocyte recruitment into the CNS and shed light on the deleterious effect of TH17-secreted cytokines, specifically in the activation and breakdown of the BBB.

Les lymphocytes B jouent un rôle central dans l’immunité humorale par leur capacité à présenter des antigènes aux lymphocytes T, à sécréter des cytokines et à se différencier en plasmocytes produisant des anticorps. Ces fonctions peuvent être induites par leur stimulation in vitro. Par leur aptitude à présenter des antigènes indépendamment de la spécificité du récepteur des lymphocytes B (BCR), les lymphocytes B peuvent être utilisés comme cellules présentatrices d’antigènes (antigen-presenting cells, APC) afin d’induire la réponse cellulaire des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques spécifiques. L’immunité cellulaire est cruciale pour prévenir les infections contre certains virus et en immunothérapie du cancer. L’objectif général de ces travaux est d’étudier la biologie des lymphocytes B. Plus particulièrement, nous souhaitons comprendre et améliorer leur fonction de présentation d’antigène afin d’utiliser les lymphocytes B comme source alternative d’APC. Dans la première partie de ces travaux, notre attention s’est portée sur la compréhension du mécanisme de présentation croisée par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) par lequel un épitope de la protéine gp100 du mélanome, inséré dans une nanoparticule pseudo-virale (VLP) composée de la protéine de surface du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV), est présenté par les lymphocytes B. Cette VLP est une plateforme vaccinale capable de stimuler le système immunitaire sans l’aide d’adjuvant et facilite la présentation croisée de l’épitope inséré, de façon indépendante de l’activité du protéasome. Les résultats obtenus démontrent que l’apprêtement de l’épitope inséré dans la nanoparticule s’effectue selon une voie de présentation croisée vacuolaire qui dépend de l’activité de la cathepsine S, de l’acidification des lysosomes et requiert l’induction de l’autophagie. Ainsi, nous avons défini plus précisément le mécanisme de présentation croisée par lequel les lymphocytes B apprêtent et présentent un épitope inséré dans la VLP de PapMV. Par la suite, nous avons cherché à améliorer le protocole d’activation in vitro permettant d’amplifier et d’induire les fonctions de présentation d’antigènes des lymphocytes B, dans le but d’utiliser ces cellules pour activer les réponses cellulaires des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Les stimulations in vitro des lymphocytes B par le CD40 ligand (CD40L) et l’interleukine (IL)-21 ou la combinaison de l’IL-4 et l’IL-21 au lieu de l’activation standard avec le CD40L et l’IL-4 ont été évaluées. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de la biologie des lymphocytes B. Nous avons démontré que la stimulation des lymphocytes B avec le CD40L et l’IL-21 augmente leur prolifération, mais mène à leur différenciation en plasmocytes sécrétant des anticorps. Au contraire, la stimulation avec le CD40L et l’IL-4 induit efficacement leur fonction de présentation d’antigènes. La stimulation des lymphocytes B avec le CD40L et la combinaison de l’IL-4 et de l’IL-21 augmente leur prolifération, mène seulement faiblement à leur différenciation en cellules sécrétrices d’anticorps, mais induit efficacement leur fonction de présentation d’antigènes. Nous avons démontré pour la première fois que cette méthode permet de générer des APC puissantes capables d’induire la réponse des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques in vitro. Nos résultats nous permettent de postuler que ces cellules pourraient être capables de mener à une réponse cellulaire in vivo. En tant qu’APC efficaces, les lymphocytes B pourraient être utilisés dans une stratégie vaccinale ou être employés comme APC afin d’améliorer les traitements d’immunothérapie du cancer par transfert adoptif de lymphocytes T. Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse ont porté tant sur la compréhension des mécanismes de présentation croisée d’un épitope inséré dans la VLP de PapMV par les lymphocytes B, que sur l’amélioration de la méthode permettant d’induire leur fonction de présentation d’antigènes pour activer les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Ces travaux de recherche fondamentale ont permis de contribuer à des avancées sur les connaissances de la biologie des lymphocytes B. Ils offrent de nouvelles pistes de réflexion quant aux utilisations biotechnologiques des lymphocytes B comme source alternative d’APC pour des applications de recherche fondamentale et clinique telles que la vaccination et les traitements d’immunothérapie du cancer. / B lymphocytes are central to humoral immunity due to their ability to present antigens to T cells, secrete cytokines and to differentiate into antibody-producing plasma cells. These functions can be induced by their in vitro stimulation. Being able to present antigens independently of the specificity of their B cell receptor (BCR), B cells can be used as antigen-presenting cells (APC) to induce specific cytotoxic CD8+ T cell cellular responses. Cellular immunity is crucial to prevent infections against viruses and in cancer immunotherapy. The main aim of this thesis is to study B cell biology. Specifically, we aim to deepen our understanding of their antigen presentation function and improve this function to use B cells as an alternative source of APC. First, we focused on deciphering the class I major histocompatibility complex (MHC-I) cross-presentation mechanism by which an epitope from gp100 melanoma protein, inserted in a virus-like particle (VLP) made of the coat protein of the papaya mosaic virus (PapMV), is presented by B cells. This VLP is a vaccine platform able to stimulate the immune system with no adjuvant and mediate a proteasome independent cross-presentation of the inserted epitope. Our results show that the inserted epitope is processed through a vacuolar pathway dependent on cathepsin S activity, lysosome acidification and requires the induction of autophagy. Thus, we provide a more detailed characterization of the mechanism used by B cells to process and cross-present an epitope inserted in PapMV VLP. Secondly, we aimed to improve the in vitro activation protocol used to expand B cells and induce their antigen presentation functions to use these cells to trigger cytotoxic CD8+ T cell cellular responses. We evaluated the in vitro stimulation of B cells with CD40 ligand (CD40L) and interleukin (IL)-21 or the combination of IL-4 and IL-21 instead of the standard activation method based on CD40L and IL-4. Our results deepen our knowledge of B cell biology. We showed that stimulating B cells with CD40L and IL-21 increases their proliferation but leads to their differentiation in antibody-producing plasma cells. In comparison, the stimulation with CD40L and IL-4 efficiently induces their antigen presentation function. The stimulation of B lymphocytes with CD40L and the combination of IL-4 and IL-21 increases their proliferation, weakly leads to their differentiation in antibody-secreting cells but is very efficient in inducing their antigen presentation function. We show for the first time that this method can generate potent APC able to induce cytotoxic CD8+ T cell responses in vitro. Our results allow us to hypothesize that these cells could be capable of triggering cellular immunity in vivo. As efficient APC, B cells could be used in a vaccination strategy or be employed as APC to improve cancer immunotherapy treatments such as adoptive cell transfer of T lymphocytes. Thus, the work presented in this thesis provides a deeper understanding of the antigen cross-presentation pathway by which B cells process and present an epitope inserted in PapMV VLP. It also reports an improved method to induce antigen presentation function of B cells to stimulate cytotoxic CD8+ T cells. This research work constitutes a leap forward in fundamental B cell research by increasing our knowledge of B cell biology. It also brings new opportunities regarding biotechnological uses of B cells as an alternative source of APC for fundamental and clinical applications such as vaccination and cancer immunotherapy treatments.

Dans les cas de lymphopénie, les lymphocytes T résiduels prolifèrent exagérément dans un phénomène appelé «expansion homéostatique périphérique» (HPE), qui est efficace pour la régénération des T CD8+, mais inefficace pour les T CD4+. L’interleukine-7 (IL7) est une cytokine homéostatique utilisée afin d’augmenter les comptes lymphocytaires T des patients lymphopéniques. Toutefois, la raison de l’expansion préférentielle des lymphocytes T CD8+ par l’IL7 demeure toujours inconnue. Nous montrons que cette expansion est due au fait que l’IL7 induit une prolifération efficace des T CD8+ périphériques (CD8+PERI) ainsi que des émigrants thymiques CD8+ (CD8+RTEs). Par contre, l’effet prolifératif de l’IL7 est restreint presqu’uniquement aux CD4+RTEs même si les CD4+PERI survivent mieux que les CD4+RTEs. De plus faibles doses d’IL7 sont nécessaires aux CD4+RTEs afin de phosphoryler STAT5 ou de proliférer comparativement aux CD4+PERI et nous démontrons que les contacts TCR/CMHII sont nécessaires à la prolifération induite par l’IL7 des CD4+RTEs en périphérie. De fait, augmenter au Flt3 ligand le nombre de cellules dendritiques périphériques d’une souris donneuse, avant de transférer ses TPERI dans des souris receveuses traitées à l’IL7 induit une prolifération significative des CD4+PERI. Nos résultats indiquent donc que l’abondance des contacts TCR/CMHII reçus dans le thymus semble contrôler la sensibilité à l’IL7 des CD4+RTEs. Finalement, l’observation que les CD8+PERI et CD8+RTEs prolifèrent pareillement pendant la thérapie à l’IL7, alors que la prolifération des T CD4+ est largement restreinte aux RTEs expliquerait pourquoi, dans les cas de lymphopénie, la régénération des T CD4+ est aussi dépendante de la thymopoïèse. / In lymphopenic settings, residual T lymphocytes typically undergo exaggerated proliferation via homeostatic peripheral expansion (HPE). While HPE efficiently regenerates CD8+ T cells, it is unable to normalize CD4+ T-cell counts. Interleukin-7 (IL7) is a homeostatic cytokine, currently used in trials in order to increase T-cell counts in lymphopenic humans. Nowadays, it is still not known why IL7 therapy is more effective toward the expansion of CD8+ T cells rather than CD4+ T cells. Here we show that CD8+ T cells preferential expansion is due to IL7-induced efficient proliferation of peripheral CD8+ T cells (CD8+PERI) and CD8+ recent thymic emigrants (CD8+RTEs). In contrast, the proliferative action of IL7 is largely restricted to CD4+RTEs although CD4+PERI survive better than CD4+RTEs. Interestingly, CD4+RTEs require lower concentrations of IL7 in order to phosphorylate STAT5 or proliferate when compared to CD4+PERI, and we demonstrate the requirement for TCR/MHCII contacts to support the IL7-induced HPE of CD4+RTEs in the periphery. Furthermore, augmenting the number of MHCII expressing cells in the periphery of donor mice by treating them with Flt3 ligand (Flt3L) prior transferring their TPERI cells in IL7 therapy-treated recipients, significantly enhances the IL7-induced proliferation of CD4+PERI. Our results indicate so far that the abundance of TCR triggering occurring inside the thymus drives IL7 responsiveness of CD4+RTEs. Moreover, the observation that CD8+PERI and CD8+RTE proliferate similarly during IL7 therapy, while proliferation of CD4+ T cells is largely restricted to RTEs, may explain why CD4+ T cells regeneration in lymphopenic settings is highly dependent on thymopoiesis.

La maladie coeliaque réfractaire de type II (MCRII) est une complication sévère de la maladie coeliaque caractérisée par l’émergence dans l’épithélium intestinal d’une population clonale de cellules innées lymphoïdes (IE-ILC) avec un phénotype inhabituel. Nos travaux montrent en effet que ces IE-ILC ont un phénotype mixte avec des caractéristiques à la fois de lymphocytes T (LT) et de cellules NK, puisqu’elles expriment des récepteurs NK et contiennent les chaines du complexe CD3 en intracellulaire et des réarrangements du récepteur T. En outre, des travaux précédents du laboratoire ont montré que l’interleukine 15 (IL-15), produite en excès par les entérocytes des patients MCRII, joue un rôle central en permettant la survie de ces lymphocytes anormaux et de ce fait leur accumulation progressive dans l’intestin. Le premier objectif de ma thèse a été de comprendre l’ontogénie des IE-ILC chez l’homme. Nous avons démontré qu’une population «polyclonale» d’IE-ILC, possédant des caractéristiques similaires à ceux des lymphocytes clonaux de MCRII, est présente dans l’épithélium intestinal des sujets sains. En outre, ces cellules prédominent dans l’épithélium intestinal des très jeunes enfants (<1ans) et des patients allo-greffés après une chimiothérapie. Nous avons montré que la différenciation des IE-ILC peut–être récapitulée in vitro à partir de cellules souches hématopoïétiques (CSH), en combinant un signal NOTCH et IL-15; le signal NOTCH initie un programme T qui est interrompu par l’IL-15, conduisant à la reprogrammation des cellules vers une différenciation NK. Nous avons aussi montré que l’effet de l’IL-15 résulte de l’induction de la sérine protéase Granzyme B, qui clive la protéine NOTCH en fragments dépourvus d’activité transcriptionnelle. Le deuxième objectif de mon travail a été d’identifier le site de la différenciation des IE-ILC. Thymus et épithélium intestinal expriment en effet des ligands de NOTCH ainsi que de l’IL-15. Cette partie du travail a été conduite chez la souris. Nous avons montré qu’une population d’IE-ILC similaire à celle observée chez l’homme est présente dans l’épithélium murin. L’étude de différentes souris mutantes nous a permis de démontrer sa dépendance stricte de l’IL-15. La réalisation de greffes de thymus, l’analyse de souris athymiques et le transfert de cellules de la moelle osseuse chez des souris immunodéficiences a permis d’exclure tout rôle du thymus dans la différenciation des IE-ILC, et de suggérer que ces cellules se différencient dans l’intestin avant la migration des lymphocytes T. Dans leur ensemble, ces résultats caractérisent une nouvelle population de cellules lymphoïdes innées et une voie originale de différenciation. Nos résultats éclairent un débat de longue date sur la différenciation extra-thymique des lymphocytes de l’épithélium. Nous montrons que la différenciation T peut être initiée dans l’épithélium intestinal mais que l’IL-15 bloque cette différenciation, ce qui conduit à la génération d’une population particulière de IE-ILC avec un phénotype mixte de LT et de NK. La présence des IE-ILC chez les très jeunes enfants et chez les patients greffés suggère un rôle possible dans les défenses de l’épithélium intestinal avant l’activation du système immunitaire adaptatif et la migration intraépithéliale des LT. / Refractory celiac disease type II (RCDII) is a rare but severe complication of celiac disease characterized by the appearance in gut epithelium of clonal population of innate lymphoid cells (IE-ILC) with atypical features. Our work shows that IE-ILC have mixed phenotype close both to T cells and NK cells. Indeed, IE-ILC express NK markers, intracellular CD3 chains and exhibit T cell rearrangement. Moreover, previous data from the laboratory have shown that interleukin 15 (IL-15), a cytokine overexpressed in the gut of RCDII patients, plays a key role in survival of clonal IE-ILC1 and therefore promotes their accumulation in the gut epithelium. The first objective of my thesis has been to understand the ontogeny of IE-ILC in humans. We have demonstrated that polyclonal IE-ILC sharing similar features with clonal IE-ILC are present in the gut of healthy control. In addition, IE-ILC are preponderant in the gut epithelium of young children (<1year) and of grafted patients after chemotherapy. We have shown that differentiation of IE-ILC can be recapitulated in vitro from hematopoietic stem cells (HSC) by combining both NOTCH signal and IL-15. Indeed, NOTCH signal initiates T cell program, which is blocked by IL-15, reprogramming these cells toward the NK lineage. Moreover, we have shown that Granzyme B, a serine protease induced by IL-15, cleaves the NOTCH protein into a transcriptionnally inactive peptide. The second objective of my work has been to determine the site of differentiation of IE-ILC. Thymus and gut epithelium express both NOTCH ligands and IL-15. This question has to be addressed in mouse. We have shown that the mouse gut epithelium contains the counterpart of human IE-ILC1. We first confirmed that mouse IE-ILC1 require IL-15 for their differentiation and or survival using IL-15 deficient mice. Thymus graft experiment, analysis of athymic mice (nude) and HSC transplantation in empty hosts suggested that IE-ILC1 differentiate in the gut epithelium before immigration of T cells from thymus. In summary, our results describe a novel subset of IE-ILC1 together with their novel unconventional mechanism of differentiation. Our data allow to revisit the long time controversy on extra-thymic T cell differentiation in the gut. We have demonstrated that T cell program can be initiated in the gut epithelium but IL15-induced Granzyme B blocks this program and permits the generation of unconventional IE-ILC with mixed T cell and NK cell features. Because IE-ILC1 are preponderant in the gut epithelium of young children and of patients with recent bone marrow transplantation, we suggest that IE-ILC1 can play a major role in gut defense before activation of the gut adaptative immune system activate and migration of thymus-derived T cells into the gut epithelium.