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Analyse protéomique et fonctionnelle des structures de Maurer, un compartiment sécrétoire de Plasmodium falciparum impliqué dans son développement érythrocytaireVincensini, Laetitia 21 April 2005 (has links) (PDF)
Le développement érythrocytaire de Plasmodium falciparum, l'agent du paludisme, est responsable de tous les symptômes liés à la maladie. Les formes sanguines du parasite possèdent plusieurs organites qui se sont révélés essentiels au développement intra-érythrocytaire. Parmi ceux-ci, nous nous sommes intéressés à un compartiment tout à fait original connu sous le nom de structures de Maurer. Ce compartiment, qui présente des caractéristiques de Golgi, est localisé dans le cytoplasme de la cellule hôte et assure le transfert de protéines parasitaires à la membrane érythrocytaire. Les structures de Maurer participent notamment au transport des protéines parasitaires liées au phénomène de cytoadhérence, qui est à l'origine du neuropaludisme. Notre travail a de plus permis de montrer leur rôle dans la libération des mérozoïtes infectieux. Nous avons entrepris une étude protéomique et fonctionnelle de ce compartiment afin de mieux comprendre son rôle biologique et d'identifier des enzymes essentielles au parasite, qui pourraient être validées comme cibles chimio-thérapeutiques. Nos études ont identifié dans ces structures la protéine RhopH2 qui semble présenter une activité sérine protéase dont nous poursuivons la caractérisation. Nous avons également, par une approche protéomique globale, identifié près de 50 protéines parasitaires dans des préparations de fantômes de globules rouges parasités, qui contiennent la membrane plasmique et le squelette sous-membranaire érythrocytaire ainsi que les structures de Maurer. Cette étude, ainsi que la caractérisation de l'interaction entre PfSBP1, protéine intégrale de la membrane des structures de Maurer, et LANCL1, protéine du squelette sous membranaire érythrocytaire, permettent de préciser les modalités d'interaction entre structures de Maurer et membrane plasmique de la cellule hôte du parasite. À terme, notre analyse devrait permettre de mieux comprendre le rôle biologique des structures de Maurer ainsi que les voies d'adressage des protéines parasitaires à ce compartiment extracellulaire tout à fait original.
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Franchissement de barrières biologiques, mécanisme d'action et devenir subcellulaire de nanovecteurs d'agents anticancéreux pour la thérapie des gliomesPaillard, Archibald 15 December 2009 (has links) (PDF)
En se focalisant sur l'administration de médicaments dans et vers le système nerveux central et notamment pour le traitement du glioblastome, ce travail de thèse a eu pour but la mise en place d'outils expérimentaux et l'évaluation du comportement de nanovecteurs au cours du franchissement de barrières biologiques. Trois types de nanovecteurs de taille variant entre 20 et 100nm ont été appréhendés : des nanoparticules de polysaccharide, de PLGA et des nanocapsules lipidiques (LNC). Le comportement de ces objets vis-à-vis des éléments du sang a permis de définir que le revêtement par la transferrine de nanoparticules de PLGA et l'insertion de phospholipides ou de BSA dans des nanoparticules polysaccharidiques diminuait leur reconnaissance par le système réticulo-endothélial et améliorait leur temps de résidence plasmatique. Ces modifications de surface sont également associées à une possibilité d'internalisation dans les cellules cibles F98 de gliomes influencée essentiellement par la nature lipidique ou polymérique du vecteur. L'évaluation précise du comportement cellulaire et subcellulaire des LNC dans les cellules F98 a permis de démontrer que si la nature du vecteur est impliquée notamment en ce qui concerne le recrutement de voies d'endocytoses cholestéroldépendantes, la taille, corrélée au taux de surfactant véhiculé, est également impliquée. Les LNC de 20nm sont ainsi les plus aptes à permettre l'échappement lysosomal des principes actifs véhiculés et démontrent des activités pharmacologiques renforcées notamment pour ce qui concerne la mort cellulaire induite par le paclitaxel. Ces résultats établissent donc un lien original entre le comportement subcellulaire des vecteurs et la biodisponibilité des agents anticancéreux. De nouvelles potentialités de franchissement de barrières ligand- ou taille-dépendants ont été soulignées. Ces observations renforcent donc l'intérêt d'études comparatives permettant de rationaliser l'utilisation d'un vecteur donné pour un médicament et une cible donnés. Elles démontrent également tout l'intérêt d'établir des justifications entre le comportement biologique et la pertinence thérapeutique des nanovecteurs.
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Effet combiné du diabète insulino-dépendant et de l'entraînement sur la fonction cardiaque : étude du système β-adrénergique et du système de régulation du calcium intracellulaireLe Douairon Lahaye, Solène 16 November 2009 (has links) (PDF)
Le traitement à l'insuline n'empêchant pas à long terme le développement de la cardiomyopathie, l'activité physique régulière est aujourd'hui proposée comme complément à la prise en charge médicamenteuse du diabète. Notre objectif premier était de déterminer sur une durée conséquente les effets respectifs de l'entraînement physique et du traitement à l'insuline sur la fonction cardiaque en portant une attention particulière sur le système β-adrénergique et/ou sur le système de régulation du calcium intracellulaire. A long terme le traitement à l'insuline comme l'entraînement physique ne parviennent ni l'un, ni l'autre à atténuer les désordres occasionnés par le diabète au niveau de la fonction myocardique. Si notre entraînement en endurance n'a pas permis d'améliorer les performances myocardiques dans notre modèle de rat diabétique non traité à l'insuline, il a même accentué la bradycardie et la désensibilisation β-adrénergique induites par le diabète. Ensuite, nous avons cherché à déterminer si à long terme, le traitement à l'insuline et l'entraînement physique pouvaient agir de manière synergique et ce faisant améliorer les performances myocardiques. Associés le traitement à l'insuline et l'entraînement en endurance parviennent à normaliser la fonction contractile. Cet effet additif est très certainement médié par des adaptations dans la voie de signalisation impliquant les protéines régulatrices du Ca2+. Nos travaux révèlent l'intérêt majeur d'un traitement bi-dimensionnel – traitement à l'insuline, activité physique – dans la prise en charge thérapeutique quotidienne des patients diabétiques. Néanmoins, nous soulignons l'importance d'une activité physique adaptée pour induire les effets bénéfiques escomptés
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Régulation de l'activité de la protéine Rev du HIV-1 par des modifications post-traductionnelles et inhibition de sa fonction par des peptides actifs à partir du milieu extracellulaireVitte, Anne-Laure 11 December 2006 (has links) (PDF)
La protéine Rev du HIV-1 joue un rôle essentiel dans le cycle viral en permettant l'export vers le cytoplasme des ARNm viraux non ou partiellement épissés. Dans la perspective d'inhiber cette fonction, nous avons mis au point des peptides capables de reconnaître Rev et d'inhiber sa fonction, appelés SHPR (Sumo Heptapeptide Protein transduction domain for binding Rev). Nous avons établi que ces peptides sont capables de diffuser à travers les membranes plasmiques pour atteindre ensuite le noyau, où ils induisent la dégradation de la protéine virale, principalement par la voie du protéasome. Des expériences de mutagenèse ont précisé la contribution des différents domaines des SHPR dans l'action antivirale, et ont démontré que peu d'améliorations sont possibles pour optimiser leurs propriétés. Enfin, nous avons montré que Rev n'est pas régulée par sumoylation mais qu'elle peut être modifiée par addition d'une chaîne de polyubiquitine, qui stabilise la protéine mais module son activité
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ETUDE DU MODE D'ACTION NEUROTOXIQUE D'UN REPULSIF, LE DEET UTILISE SEUL ET EN ASSOCIATION AVEC UN INSECTICIDE SUR L'ACETYLCHOLINESTERASE DES DUM NEURONES D'UN INSECTE LA BLATTE PERIPLANETA AMERICANAMohamed, Aly Ahmed Abd-Ella 31 March 2011 (has links) (PDF)
Le DEET (N, N-diéthyl-m-toluamide), est connu comme le répulsif le plus utilisé au monde. Bien qu'il soit efficace contre un large groupe d'arthropodes, son mode d'action exact et sa cible moléculaire ne sont pas encore connus précisément. Grâce à l'utilisation des techniques d'électrophysiologie (patch-clamp et oil-gap), d'imagerie calcique et biochimique, nous avons étudié le mode d'action du DEET sur des cellules neurosécrétrices identifiées, les DUM neurones de la blatte Periplaneta americana. Le DEET, à forte concentration, inhibe l'activité de l'acétylcholinestérase (AChE) au niveau du DUM neurone. A faible concentration, il induit une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire via l'activation des récepteurs cholinergiques de type muscariniques (mAChRs). Dans un deuxième temps, les interactions synergiques entre le DEET et le propoxur, un carbamate connu pour inhiber l'AChE, ont été étudiées. Les résultats ont révélé que les mAChRs, correspondent bien à une nouvelle cible potentielle pour le DEET et qu'ils sont impliqués dans l'effet synergique. Le DEET, à faible et à forte concentration, agit sur des sites allostériques positifs et négatifs des mAChRs respectivement. L'action du DEET sur le site allostérique positif des mAChRs est responsable de l'effet synergique via une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire qui potentialise l'effet anti-AChE du propoxur. L'utilisation d'outils pharmacologiques sélectifs a permis l'identification de la voie de signalisation intracellulaire (PLC, PI-PLC, CaMKinase II, récepteurs IP3) impliquée dans l'effet synergique du propoxur. Les résultats présentés dans ce mémoire vont contribuer au développement de nouvelles stratégies basées sur l'utilisation de combinaisons d'insecticides de familles chimiques différentes afin de réduire les doses des traitements tout en augmentant l'efficacité.
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Trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase chez Saccharomyces cerevisiæ : relation entre biogénèse de la télomérase et homéostasie des télomèresGallardo, Franck 02 1900 (has links)
Le contrôle de la longueur des télomères est une étape critique régissant le potentiel
réplicatif des cellules eucaryotes. A cause du problème de fin de réplication, les
chromosomes raccourcissent à chaque cycle de division. Ce raccourcissement se produit
dans des séquences particulières appelées télomères. La longueur des télomères est en
relation directe avec les capacités prolifératives des cellules et est responsable de la limite
de division de Hayflick. Cependant, dans certains types cellulaires et dans plus de 90% des
cancers, la longueur des télomères va être maintenue par une enzyme spécialisée appelée
télomérase. Encore aujourd’hui, comprendre la biogénèse de la télomérase et savoir
comment elle est régulée reste un élément clé dans la lutte contre le cancer. Depuis la
découverte de cette enzyme en 1985, de nombreux facteurs impliqués dans sa maturation
ont été identifiés. Cependant, comment ces facteurs sont intégrés dans le temps et dans
l’espace, afin de produire une forme active de la télomérase, est une question restée sans
réponse. Dans ce projet, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiæ comme
modèle d’étude des voies de biogénèse et de trafic intracellulaire de l’ARN de la
télomérase, en condition endogène.
La première étape de mon travail fut d’identifier les facteurs requis pour
l’assemblage et la localisation de la télomérase aux télomères en utilisant des techniques
d’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH). Nous avons pu montrer que la composante
ARN de la télomérase fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, en condition
endogène, dans les cellules sauvages. Nos travaux suggèrent que ce trafic sert de contrôle
qualité puisqu’un défaut d’assemblage de la télomérase conduit à son accumulation
cytoplasmique et prévient donc sa localisation aux télomères. De plus, nous avons identifié
les voies d’import/export nucléaire de cet ARN.
Dans une deuxième approche, nous avons réussi à développer une méthode de
détection des particules télomérasiques in vivo en utilisant le système MS2-GFP. Notre
iv
étude montre que contrairement à ce qui a été précédemment décrit, la télomérase n’est pas
associée de façon stable aux télomères au cours du cycle cellulaire. En fin de phase S, au
moment de la réplication des télomères, la télomérase se regroupe en 1 à 3 foci dont
certains colocalisent avec les foci télomériques, suggérant que nous visualisons la
télomérase active aux télomères in vivo. La délétion des gènes impliqués dans l’activation
et le recrutement de la télomérase aux télomères entraine une forte baisse dans
l’accumulation des foci d’ARN au sein de la population cellulaire. Nos résultats montrent
donc pour la première fois la localisation endogène de l’ARN TLC1 in situ et in vivo et
propose une vue intégrée de la biogenèse et du recrutement de la télomérase aux télomères. / Telomere length control is a critical step that governs the replicative potential of
eukaryotic cells. Due to the end replication problem, chromosomes shorten at each round of
division. This attrition occurs in specialized sequences at the extremity of chromosomes
called telomeres. Telomere size is in direct relationship with proliferative potential and
responsible for Hayflick’s division limit. However, in different cell type and in cancers, an
end-specialized enzyme called telomerase maintains telomere length. Reactivation of
telomerase in somatic cells triggers a pre-tumoral phenotype and more than 90% of cancers
highly express this enzyme. Still today, understanding how telomerase is synthesized and
reactivated can be a key step for the understanding of cancer arising and progression. Since
the discovery of this enzyme in 1985, several factors involved in the regulation of this
enzyme have been discovered. However, the spatio-temporal regulation of telomerase
biogenesis and regulation has not been determined. We used the yeast S.cerevisiæ to study
the biogenesis and recruitment of telomerase to telomeres.
The first step in my work was to determine the factors required for the biogenesis
and recruitment of telomerase to telomeres using fluorescence in situ hybridization. We
have shown that the telomerase RNA component shuttles between the nucleus and the
cytoplasm in wild type endogenous conditions. We have shown that this intracellular
trafficking is used as a quality control mechanism that prevents the nuclear localization of
miss assembled telomerase complexes. Moreover, we have identified the import/export
pathways of the telomerase RNA.
In a second step, we developed an in vivo localization system to follow the
telomerase RNA dynamics. We used the MS2-GFP system to track this RNA in vivo. Our
study shows that, contrary to what was previously described, telomerase is not stably
associated to telomeres during the cell cycle but freely diffuses in the nucleus of G1 cells.
In late S phase, at the moment of telomere replication, telomerase clusters in 1 to 3 big foci
vi
that colocalizes with telomeres clusters in vivo, suggesting the visualization of active
telomerase particles replicating telomeres. Disruption of gene coding for telomerase
activators triggers a great reduction of telomerase RNA clusters in a cell population.
Altogether, our results shows for the first time the localization of the endogenous form of
the telomerase RNA and propose an integrated view of telomerase biogenesis and
recruitment to telomeres.
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Rôle de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la régulation du programme angiogénique induit par le VEGFChabot, Catherine 03 1900 (has links)
Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine
kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et
de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de
signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une
activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a
été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme
des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des
PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement
régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation
adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la
contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques
fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de
l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à
partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des
facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses
effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2
(Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée
dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale,
une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse
angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner
les outils thérapeutiques actuels.
L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur
VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de
la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont
à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies
de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours
inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord
que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en
déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle
d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale
de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de
signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par
ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la
première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie
des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur
VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant
tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours
de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité
carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante
de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés
lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour
l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales.
Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des
mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique
dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la
survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches
thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the
importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation
of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine
phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been
regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that
PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated
with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events.
Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental
physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the
process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial
growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to
induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial
growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a
multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of
PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with
VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools.
Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of
VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell
proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the
regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained
unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively
regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific
tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a
global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of
most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ-
ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first
time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial
cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This
survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the
dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we
identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose
phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind
to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for
Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells.
These findings represent a major step forward in our understanding of the
molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic
program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of
endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.
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Étude moléculaire des mécanismes d’action de potentiateurs du canal CFTR sur le canal KCa3.1Longpré-Lauzon, Ariane 08 1900 (has links)
Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du
Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale
causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en
Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte
les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années,
plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent
rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées
potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien
documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la
sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes
respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un
activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation
soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite
à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le
cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques
et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de
considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une
caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et
structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de
différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de
déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les
mécanismes.
Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de
quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage
des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03,
la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats
suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un
effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice
indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les
effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette
v
molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets
inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que
cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la
présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le
CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire
indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi
que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions
sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des
expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont
indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état
d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son
action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant
un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis
d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ
et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la
base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR,
aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du
canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De
plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1
pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur
l’interaction CaM-KCa3.1.
Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos
résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il
est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du
VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des
potentiateurs moins efficaces. / Airway epithelial cells are the site of Cl- secretion through CFTR. Cystic
fibrosis is a fatal genetic disease caused by mutations in CFTR. The most
frequent mutation in North America (∆F508) results in impaired maturation and
altered channel gating of the protein. In the last years, several small molecules
were identified by high throughput screening that could restore mutated CFTR
function. Compounds addressing CFTR gating defects are referred to as
potentiators. The basolateral K+ channel KCa3.1 has been documented to play
a prominent role in establishing a suitable driving force for CFTR-mediated Clsecretion
in airway epithelial cells. It has been shown, for example, that the
application of 1-EBIO on T84 monolayers results in a sustained increase of Clsecretion
and that this current can be reversed by application of CTX, a KCa3.1
inhibitor (Devor et al., 1996). Thus, in a global approach of transepithelial
transport, the research for physiologically relevant CFTR potentiators should
also consider their effects on the KCa3.1 channel. Electrophysiological patch
clamp measurements and channel structural modification by site directed
mutagenesis were used to characterize the action of CFTR potentiators on
KCa3.1 and study their molecular mode of action.
In this work we present results on the effects on KCa3.1 of several
CFTR potentiators of different structures. We observed that the CFTR
potentiators genistein, curcumin, SF-03 and VRT-532 could inhibit KCa3.1
activity at concentrations known to activate CFTR. Our results suggest that SF-
03 could act indirectly on KCa3.1 through a mechanism involving an accessory
protein. Curcumin would also have an indirect inhibitory effect, probably
mediated by the plasma membrane, as documented for other ion channels. A
detailed study of VRT-532 revealed that this molecule has access to its binding
site in a state independent manner, and is poorly effective on the V282G
mutant of KCa3.1, which is constitutively active. These results suggest that
VRT-532 could act through the CaM/KCa3.1 complex and require the presence
of Ca2+ to inhibit channel activity. In contrast, CBIQ, another CFTR potentiator,
succeeded to activate KCa3.1. Our results in single channel show that CBIQ
vii
destabilizes a non conducting state of the channel. We also showed that this
molecule increases the apparent Ca2+ affinity as well as the channel open
probability, even in saturating Ca2+ conditions. Experiences in which Ba2+ was
used as a probe were also performed to determine if the action mechanism of
CBIQ involves an effect on the selectivity filter. Our results showed that Ba2+
could displace CBIQ from its interacting site, suggesting that the increases in
channel activity induced by CBIQ could result from a change in the energetics
of the channel at the level of the selectivity filter. On the basis of our results, we
conclude that CBIQ, a CFTR potentiator, could activate KCa3.1 by destabilizing
a non conducting state of the channel, probably through an action near the
selectivity filter region. Also, CFTR potentiators having an inhibitory effect on
KCa3.1 are likely to act through the plasmic membrane, the CaM/KCa3.1
interaction or an accessory protein of the channel.
In a perspective of future treatments for CF, our results indicate that
CBIQ could be an efficient potentiator since this product stimulates KCa3.1 as
well as CFTR. Conversly, the VRT-532 and SF-03 could be less efficient than
on CFTR alone, due to their inhibition of KCa3.1.
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Signalisation cellulaire et formation de complexes protéiques lors de l'étirement des cardiomyocytes de rats nouveaux-nésDuquesnes, Nicolas 18 April 2008 (has links) (PDF)
L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L'objectif principal de mon travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l'activation des MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l'étirement. Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D'une part, nous nous sommes intéressés aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l'activation des MAPK. D'autre part, nous avons cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de signalisation activées par l'étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes protéiques nécessaires à l'activation des différents partenaires. Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à l'activation de ERK et de JNK lors de l'étirement. Ces cascades de transduction peuvent être dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l'activation de ERK par l'étirement. Enfin, nous avons montré la formation d'un complexe Protein Kinase C (PKC)/Calcineurine nécessaire à l'activation et à la translocation de la PKC lors de l'étirement. Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire
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Pollution de type urbaine au monoxyde de carbone et sensibilité du myocarde au syndrome d’ischémie-reperfusion : rôle cardioprotecteur de l’exercice / Simulated urban carbon monoxide air pollution and rat heart ischemia-reperfusion injury : cardioprotective effects of exerciseMeyer, Grégory 21 October 2010 (has links)
Diverses études épidémiologiques ont mis en évidence une relation étroite entre pollution urbaine au monoxyde de carbone (CO) et mortalité cardiovasculaire. Récemment il a été mis en évidence, chez le rat, qu'une exposition prolongée à ce polluant urbain avait pour conséquence le développement d'un phénotype cellulaire pathologique, pouvant influencer la vulnérabilité du coeur à un stress aigu. L'objectif de nos travaux était donc i) d'évaluer l'impact de la pollution au CO, sur la sensibilité du myocarde de rats au syndrome d'ischémie-reperfusion (IR) ; et ii) d'évaluer les effets potentiellement cardioprotecteurs d'un exercice pratiqué régulièrement à intensité modérée, sur le remodelage phénotypique cellulaire myocardique. Pour cela, 187 rats Wistar ont été séparés en 3 groupes : des rats contrôles, des rats exposés pendant 4 semaines au CO (30-100 ppm), et des rats entraînés en endurance avant d'être exposés au CO. La sensibilité à l'IR était évaluée par ischémie régionale réalisée sur modèle de coeur isolé perfusé de Langendorff. La fonction et les mouvements calciques de cardiomyocytes isolés était évalués en condition basale et consécutivement à un protocole d'anoxie-réoxygénation. Les résultats de ce travail confirment l'apparition d’un phénotype pathologique chez les rats exposés de façon prolongée au CO. Ce phénotype pathologique caractérisé dans notre travail par une altération de l’homéostasie calcique et du statut redox cellulaire ainsi qu'une expression tissulaire de iNOS apparait comme à l'origine de la plus grande vulnérabilité du coeur à un stress d’IR. Un autre résultat majeur de ce travail est qu’une stratégie de cardioprotection par un exercice d'intensité modérée pratiqué de manière régulière, permet de prévenir le remodelage pathologique cardiomyocytaire et ainsi l'augmentation de la sensibilité du myocarde à l'IR / Epidemiological studies suggested that carbon monoxide (CO) urban air pollution is mainly related to cardiovascular mortality. In addition, recent experimental studies have highlighted that CO exposure was responsible for the development of cardiomyocytes’ pathological remodeling, which can render the heart more vulnerable to acute stresses. Therefore, the aim of this experimental work was to i) evaluate the impact of prolonged exposure to simulated CO urban pollution on the sensitivity of the myocardium to IR ; and ii) evaluate potential cardioprotective effects of regular bouts of endurance training in this model. 187 Wistar rats were separated into 3 groups : control rats, CO rats exposed during 4 weeks to CO (30-100 ppm), and CO exercised rats. Myocardial sensibility to IR was evaluated with a regional ischemia performed on a Langendorff model of isolated heart. Moreover, the cardiomyocytes’ function and calcium handling were evaluated at basal conditions, following a protocol of cellular anoxia and reoxygenation. The results of this study confirm that chronic exposure to CO is responsible for cardiac phenotypic changes, which are characterized in this work by an imbalance in the cardiomyocytes’ oxidative status, an impairment of calcium handling and iNOS expression. These phenotypic changes were associated in this work with higher heart vulnerability to IR. Another major result of this study is that regular bouts of endurance training conducted prior to CO exposure prevented the pathological cardiac remodeling, consequently leading to higher heart vulnerability due to IR
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