Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2007. / Submitted by Luanna Maia (luanna@bce.unb.br) on 2009-03-06T15:53:48Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Lilian Collor.pdf: 2851385 bytes, checksum: 9aa50d532a9bb626e02088248ac08715 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-03-06T16:09:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Lilian Collor.pdf: 2851385 bytes, checksum: 9aa50d532a9bb626e02088248ac08715 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-03-06T16:09:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Lilian Collor.pdf: 2851385 bytes, checksum: 9aa50d532a9bb626e02088248ac08715 (MD5) / O teste de irritação ocular é requerido pelos órgãos governamentais brasileiros durante o processo de registro de um produto agrotóxico, e essencial para sua classificação toxicológica. O presente estudo avaliou as alterações macroscópicas e microscópicas na superfície do olho de coelhos após o tratamento com quatro formulações de herbicidas contendo o ácido diclorofenoxiacético (2,4-D), utilizando a escala de graduação das reações oculares proposta por Draize. Foram utilizados 84 coelhos, 21 animais por formulação, distribuídos em 7 grupos. Uma única dose de 0,1 mL ou g foi aplicada diretamente no saco conjuntival do olho esquerdo de cada animal, e o olho direito foi utilizado como controle. As alterações na córnea, íris e conjuntivas foram graduadas nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas e 7, 14 e 21 dias após a aplicação. Em cada intervalo, três animais foram eutanasiados, seus olhos removidos e os tecidos preparados para exame histológico. Os resultados macroscópicos mostraram que não houve proporcionalidade entre a concentração de 2,4-D e a intensidade das alterações na córnea. Os produtos 1 e 2, com menor concentração de 2,4-D e pH próximo da neutralidade, mostraram alterações discretas e moderadas na córnea quando comparados aos produtos 3 e 4 que apresentaram na maioria alterações moderadas e acentuadas. As lesões produzidas no epitélio córneo foram, na maioria, reparadas durante o período do experimento, com exceção daquelas em um animal tratado com o produto 3 e de três animais do produto 4 que tiveram rompimento da córnea. Infiltrados de neutrófilos polimorfonucleares foram detectados microscopicamente na maioria das inflamações na córnea, íris e conjuntivas notadas nos exames clínicos. Entretanto, não houve em todos os casos relação direta entre a intensidade das alterações macro e microscópicas. Os exames micro ainda mostraram em alguns animais alterações que normalmente não são visualizadas clinicamente, como hiperplasia, queratinização e descamação do epitélio córneo, e inflamação do corpo ciliar, que podem comprometer o processo da visão. A legislação brasileira atual é conservadora, pois considera como extremamente tóxico qualquer produto que apresente opacidade na córnea, reversível ou não em 7 dias. Os resultados deste estudo indicam a necessidade da revisão da legislação em harmonia com os procedimentos utilizados internacionalmente. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Ocular irritation test is required by the Brazilian government authorities during the registration process of pesticide products, and it is essential for its toxicological classification. The present study evaluated the clinical and microscopic changes in the eye surface of rabbits after treatment with four pesticide formulations containing the herbicide 2,4-D dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), using the Draize scale for grading the ocular irritation. Eighty four animals were used in the experiment, being 21 for each formulation, distributed in 7 groups. A single dose of 0.1 mL or g was directly applied to the conjunctive sac of the left eye of each animal, and the right eye being used as control. Changes in the cornea, iris and conjunctives were graduated after 1, 24, 48 and 72 hours and 7, 14 and 21 days after treatment. In each interval, three animals were killed, the eyes removed and the ocular tissues prepared for the histological examination. Clinical results showed no proportionality between concentration of 2,4-D in the formulation and severity of corneal damage. The products 1 and 2, with lower 2,4-D concentration and pH near the neutrality, caused discrete and moderate changes in the cornea when compared with the products 3 and 4, which caused moderate and accentuated changes. Lesions produced in the corneal epithelium were repaired during the experiment, with exception of those in one animal treated with product 3 and three animals treated with product 4 which had corneal perforation. Infiltrates of polymorphonuclear neutrophil cells were observed microscopically in the majority of the inflammatory events clinically noted on the cornea, iris and conjunctives. However, not always the intensity of the changes observed macro and microscopically were correlated. Microscopy showed corneal hyperplasia, queratinization and desquamation and inflammation of the ciliary body of many animals as a result of the treatment, changes that can affect the vision but are not normally observed during the clinical examination. The current Brazilian legislation is conservative, as it considers any product that shows corneal opacity, reversible or not after 7 days, as extremely toxic. The present work indicates the need to update this legislation according to the international procedures.

Para a avaliação do potencial irritante de substâncias aplicadas topicamente tem-se utilizado metodologias que baseiam nos estudos de Draize, onde preconiza-se o uso de animais. Devido à forte oposição a estes testes, intensa tem sido a busca por métodos alternativos visando diminuir ou eliminar a utilização de animais. Este estudo avaliou o potencial irritante de diversas substâncias através de duas metodologias: o teste in vivo , empregando metodologia oficial do Food and Drug Administration (FDA), onde utiliza-se coelhos e o teste de citotoxicidade in vitro - método de difusão em camada de agar sobreposta à monocamada de células - empregando as linhagens celulares He La e NCTC L 929 e o corante vital vermelho neutro. As amostras de produto acabado abrangeram colírios, testados sem diluição e xampus de uso adulto e infantil testados puros e diluídos a 25%, 5%, 1% e 0,1%. As matérias-primas compreenderam tensoativos aniônicos, não-iônicos e anfóteros testados após diluição. O material de acondicionamento foi representado por frascos de polietileno para colírios, testados através dos seus extratos em solução de NaCI 0,9%. Os resultados obtidos com as amostras de colírios e frascos de acondicionamento foram negativos quanto à irritação ocular em coelhos e comprovaram ausência de citotoxicidade nas duas linhagens celulares. As amostras de xampus apresentaram boa correlação dos resultados quando testadas sem diluição ou diluídas a 1,0% e 0,1 %. Foi calculada a correlação de Spearman entre os dados obtidos com as duas linhagens celulares sendo o valor do coeficiente r = 0,950 indicando uma correlação direta entre os resultados obtidos com as duas células. Os resultados demonstram a possibilidade de desenvolvimento de metodologias alternativas, sujeitas à validação, que resultem em procedimentos sensíveis, reprodutíveis, não sujeitos a critérios subjetivos de interpretação, visando assim, num primeiro estágio diminuir o uso de animais pelo emprego destas metodologias em avalições prévias do potencial irritante de substâncias químicas. / To evaluate the irritability potential of toppically laid on substances, some methodologies based on Draize\'s study where the use of animals is demanded, have been used. Due to the strong opposition of society and scientific comunity, the search for alternative methods having in view the reduction or even the elimination of animals have been intense, either through the use of volunteers or of in vitro methodologies. The present study has evaluated the irritability of several substances including finished products, raw materials and packagíng materials through two methodologies: the in vivo test which makes use of official methodology from Food and Drug Administration (FDA), where rabbits are employed and the citotoxicity in vitro test - method of diffusion in agar layer added to the monolayer of cells - using He La and NCTC L 929 cells lines and neutral red. The samples of the finished products embraced eye drops, tested without dilution, and shampoos for adults and children use both concentrated and diluted to 25%, 5%, 1% and 0.1 %. Raw materiais included anionis, non-anionic and amphoteric surfactants tested after dilution. The packaging material, represented by eye drops polyethylene bottles, was tested through its extracts in a NaCI 0,9% solution. The results obtained with the samples of eye drops and packaging materials were negative as for ocular irritation in rabbits and confirmed the absence of cytotoxicity in both cells lines. The samples of shampoos presented good correlation of results when tested without dilution or diluted to 1% and 0.1 %. It has been calculated Spearman correlation considering dates obtained with two cells lines, with value of coefficient r = 0,950 showing a direct correlation between results obtained with two cells. The results obtained with this study are likely to lead to sensitive and reproductive procedures, which won\'t arise subjective criteria of interpretation. Thus, the elimination of the use of animals will be possible at a first stage of previous evalution, and once a posterior validation of this methodology is done, the rational use of a smaller number of animais will be a reality.

Os procedimentos descritos por Draize são a base dos testes de irritação ocular e cutânea adotados internacionalmente para avaliar produtos e substâncias. Entretanto, eles têm sido criticados por motivos éticos, devido à crueldade com os animais e, por isso, metodologias alternativas têm sido estudas para avaliar a toxicidade de produtos que entram em contato com o ser humano. Sendo assim, um estudo comparativo foi realizado entre testes de irritação ocular, cutânea e mucosa oral usando coelhos e testes in vitro pelos métodos de difusão em ágar e de captura do vermelho neutro, ambos usando as linhagens celulares NCTC clone 929, FPC-IAL e SIRC. Os cosméticos avaliados foram batons, bases faciais, pós compactos, blushes, sombras para os olhos, máscaras para os cílios, lápis ou delineadores para os olhos, e sabonetes líquidos de uso adulto e infantil. Os testes in vivo e as linhagens celulares utilizadas no método de difusão em ágar foram escolhidas de acordo com o local de uso dos produtos, com exceção da linhagem NCTC clone 929 que foi utilizada na avaliação de todas as amostras. Das 204 amostras, 141 foram avaliadas pelo teste de irritação cutânea e linhagem FPC-IAL, 80 pelo teste de irritação ocular e linhagem SIRC e 78 pelo teste de irritação de mucosa oral e linhagem FPC-IAL. Somente as amostras de sabonetes líquidos foram avaliadas também pelo método de captura do vermelho neutro com as três linhagens celulares. Na avaliação in vitro as amostras foram analisadas em diferentes concentrações e o parâmetro observado foi viabilidade celular com o corante vermelho neutro. Os resultados obtidos permitiram observar que as amostras positivas no método de difusão em ágar que apresentaram até índice de zona 3 ou seja, halo de morte celular variando de 0,5 a 1,0 cm a partir da amostra, segundo a Farmacopéia Americana, não apresentaram irritação ocular, cutânea ou de mucosa oral. As amostras que apresentaram índice de zona 4, apresentaram diferentes graus de irritação ocular e cutânea com exceção de 2 sabonetes líquidos de uso infantil que não apresentaram reações in vivo, embora apresentaram citotoxicidade até a concentração de 10%. Este método apresentou correlação significante com o teste de irritação ocular, inclusive para os valores individuais da córnea e conjuntiva. Quanto ao método de captura do vermelho neutro obteve-se correlação significante para o teste de irritação cutânea e ocular, podendo inferir que quando as amostras de sabonetes líquidos apresentarem IC50 maior que 0,085% não irão induzir irritação cutânea e ocular nos coelhos. Não foi observada relação entre a origem das linhagens celulares usadas e o tecido alvo utilizado no teste in vivo, sendo que todas as linhagens mostraram correlação significante com a linhagem NCTC clone 929. De acordo com os dados, conclui-se que os métodos in vitro são mais sensíveis e que o método de difusão em ágar usando a graduação da Farmacopéia Americana, pode ser adotado como ensaio de triagem na avaliação de cosméticos. Isto resulta de sua capacidade de predizer a irritação, contribuindo significativamente para a redução dos testes que utilizam animais. / The procedures described by Draize are the basis of both ocular and cutaneous irritation tests and have been adopted internationally for in vivo evaluation of products and substances. However, they have been criticized for ethical reasons, due to their cruelty towards animals. Therefore, alternative methodologies are being studied to evaluate the toxicity of products, which have contact with human beings. Thus, a comparative study was performed between ocular, cutaneous and oral mucosa irritation tests using rabbits and in vitro tests through agar diffusion method and neutral red uptake method, both with the use of NCTC clone 929, FPC-IAL and SIRC cell lines. Lipsticks, makeup base, face powder, blushes, eye shadows, mascara, pencils and eyeliners, as well as liquid soap for children and adult use were evaluated. The in vivo tests and the cell lines used in the agar diffusion test were chosen according to the place where the products are used. Only the NCTC clone 929 linage was used in the evaluation of all the samples. From the 204 analyzed samples, 141 were evaluated through the cutaneous irritation test and FPC-IAL lineage, 80 through the ocular irritation test and SIRC lineage, and 78 through the oral mucosa irritation test and FPC-IAL lineage. Only the samples of liquid soap were also evaluated through the neutral red uptake method with the three cells lines. The samples submitted to the in vitro evaluation were analyzed in different concentrations and the observed parameter was cellular viability with the use of neutral red. The results obtained revealed that the agar diffusion test positive samples which presented up to degree 3 zone rate, that is cellular death halo varying from 0,5 to 1,0cm from the samples, according to USP 25, didn’t provoke ocular, cutaneous or oral mucosa irritation. The samples which presented degree 4 zone also showed different degrees of ocular and cutaneous irritation, except to two units of liquid soap for children use which didn’t present in vivo reactions, although citotoxicity up to 10% concentration. This method showed significant correlation with the ocular irritation test and also concerning the individual values of cornea and conjunctiva. As for the neutral red uptake test, it presented significant correlation in the ocular and cutaneous irritation test, what make it possible to infer that when the liquid soap samples present IC50 above 0,085% they won’t cause ocular and cutaneous irritations in rabbits. No relation was observed between the origin of the cell lines and the target tissue used in the in vivo test, having all the cellular lines shown significant correlation with the NCTC clone 929 line. According to the data, the in vitro methods are more sensitive and the diffusion agar method, using the American Pharmacopeia graduation, can be adopted as a sorting procedure in the evaluation of cosmetics. This is a result of its capacity of predicting irritation, what largely contributes for the reduction of animal using tests.

Os procedimentos descritos por Draize são a base dos testes de irritação ocular e cutânea adotados internacionalmente para avaliar produtos e substâncias. Entretanto, eles têm sido criticados por motivos éticos, devido à crueldade com os animais e, por isso, metodologias alternativas têm sido estudas para avaliar a toxicidade de produtos que entram em contato com o ser humano. Sendo assim, um estudo comparativo foi realizado entre testes de irritação ocular, cutânea e mucosa oral usando coelhos e testes in vitro pelos métodos de difusão em ágar e de captura do vermelho neutro, ambos usando as linhagens celulares NCTC clone 929, FPC-IAL e SIRC. Os cosméticos avaliados foram batons, bases faciais, pós compactos, blushes, sombras para os olhos, máscaras para os cílios, lápis ou delineadores para os olhos, e sabonetes líquidos de uso adulto e infantil. Os testes in vivo e as linhagens celulares utilizadas no método de difusão em ágar foram escolhidas de acordo com o local de uso dos produtos, com exceção da linhagem NCTC clone 929 que foi utilizada na avaliação de todas as amostras. Das 204 amostras, 141 foram avaliadas pelo teste de irritação cutânea e linhagem FPC-IAL, 80 pelo teste de irritação ocular e linhagem SIRC e 78 pelo teste de irritação de mucosa oral e linhagem FPC-IAL. Somente as amostras de sabonetes líquidos foram avaliadas também pelo método de captura do vermelho neutro com as três linhagens celulares. Na avaliação in vitro as amostras foram analisadas em diferentes concentrações e o parâmetro observado foi viabilidade celular com o corante vermelho neutro. Os resultados obtidos permitiram observar que as amostras positivas no método de difusão em ágar que apresentaram até índice de zona 3 ou seja, halo de morte celular variando de 0,5 a 1,0 cm a partir da amostra, segundo a Farmacopéia Americana, não apresentaram irritação ocular, cutânea ou de mucosa oral. As amostras que apresentaram índice de zona 4, apresentaram diferentes graus de irritação ocular e cutânea com exceção de 2 sabonetes líquidos de uso infantil que não apresentaram reações in vivo, embora apresentaram citotoxicidade até a concentração de 10%. Este método apresentou correlação significante com o teste de irritação ocular, inclusive para os valores individuais da córnea e conjuntiva. Quanto ao método de captura do vermelho neutro obteve-se correlação significante para o teste de irritação cutânea e ocular, podendo inferir que quando as amostras de sabonetes líquidos apresentarem IC50 maior que 0,085% não irão induzir irritação cutânea e ocular nos coelhos. Não foi observada relação entre a origem das linhagens celulares usadas e o tecido alvo utilizado no teste in vivo, sendo que todas as linhagens mostraram correlação significante com a linhagem NCTC clone 929. De acordo com os dados, conclui-se que os métodos in vitro são mais sensíveis e que o método de difusão em ágar usando a graduação da Farmacopéia Americana, pode ser adotado como ensaio de triagem na avaliação de cosméticos. Isto resulta de sua capacidade de predizer a irritação, contribuindo significativamente para a redução dos testes que utilizam animais. / The procedures described by Draize are the basis of both ocular and cutaneous irritation tests and have been adopted internationally for in vivo evaluation of products and substances. However, they have been criticized for ethical reasons, due to their cruelty towards animals. Therefore, alternative methodologies are being studied to evaluate the toxicity of products, which have contact with human beings. Thus, a comparative study was performed between ocular, cutaneous and oral mucosa irritation tests using rabbits and in vitro tests through agar diffusion method and neutral red uptake method, both with the use of NCTC clone 929, FPC-IAL and SIRC cell lines. Lipsticks, makeup base, face powder, blushes, eye shadows, mascara, pencils and eyeliners, as well as liquid soap for children and adult use were evaluated. The in vivo tests and the cell lines used in the agar diffusion test were chosen according to the place where the products are used. Only the NCTC clone 929 linage was used in the evaluation of all the samples. From the 204 analyzed samples, 141 were evaluated through the cutaneous irritation test and FPC-IAL lineage, 80 through the ocular irritation test and SIRC lineage, and 78 through the oral mucosa irritation test and FPC-IAL lineage. Only the samples of liquid soap were also evaluated through the neutral red uptake method with the three cells lines. The samples submitted to the in vitro evaluation were analyzed in different concentrations and the observed parameter was cellular viability with the use of neutral red. The results obtained revealed that the agar diffusion test positive samples which presented up to degree 3 zone rate, that is cellular death halo varying from 0,5 to 1,0cm from the samples, according to USP 25, didn’t provoke ocular, cutaneous or oral mucosa irritation. The samples which presented degree 4 zone also showed different degrees of ocular and cutaneous irritation, except to two units of liquid soap for children use which didn’t present in vivo reactions, although citotoxicity up to 10% concentration. This method showed significant correlation with the ocular irritation test and also concerning the individual values of cornea and conjunctiva. As for the neutral red uptake test, it presented significant correlation in the ocular and cutaneous irritation test, what make it possible to infer that when the liquid soap samples present IC50 above 0,085% they won’t cause ocular and cutaneous irritations in rabbits. No relation was observed between the origin of the cell lines and the target tissue used in the in vivo test, having all the cellular lines shown significant correlation with the NCTC clone 929 line. According to the data, the in vitro methods are more sensitive and the diffusion agar method, using the American Pharmacopeia graduation, can be adopted as a sorting procedure in the evaluation of cosmetics. This is a result of its capacity of predicting irritation, what largely contributes for the reduction of animal using tests.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dithranol is very effective drug for the topical treatment of psoriasis. However, it has some adverse effects, such as irritation and stain in the skin that difficult its application and patient adherence to treatment. Its instability to light, high pH values, metals and the presence of oxygen, configure as a limiting step for use. So, the inclusion of drug in nanocarriers was the main objective of this work. Lipid core nanocapsules and nanoemulsions containing 0.5 mg/mL of dithranol and 0.05% of EDTA or 0.02% of ascorbic acid were prepared by interfacial deposition of preformed polymer and spontaneous emulsification methods, respectively, and evaluated in relation to its physicochemical characteristics (drug content, encapsulation efficiency, pH, mean size, polydispersity index and zeta potential). The nanocapsules, after preparation, showed satisfactory characteristics: drug content near to the theoretical concentration, encapsulation efficiency about 100%, nanometric mean size (220- 250 nm), polydispersity index below 0.25, negative zeta potential, and pH values from 5.6 to 4.4. Instead, low drug content was verified for the nanoemulsions (approximately 80%) after preparation. In photodegradation study against UVA light it was observed a higher stability of the dithranol-loaded nanocapsules comparing to solution containing the free drug (t1/2 = 4 and 1 h for nanocapsule and free drug solution containing EDTA, respectively; t1/2 = 17 and 7,5 h for nanocapsule and free drug solution containing ascorbic acid, respectively). Irritation test by HET-CAM method was conducted to evaluate the safety of the formulations. From the results it was found that nanoencapsulation of the drug decreased its toxicity compared to the effects observed for free drug. Subsequently, hydrogels containing nanocapsules were prepared employing Carbopol® 940 and Aristoflex® AVC as gel-forming polymers. The semisolid formulations showed suitable properties for topical application and higher stability when compared to nanocapsules suspensions and the hydrogel containing the free drug. Furthermore, a higher stability of dithranol was verified for hydrogels prepared with Aristoflex® AVC. / O ditranol é um fármaco muito eficaz no tratamento tópico da psoríase. Entretanto, apresenta alguns efeitos adversos, como irritação e manchas na pele que dificultam sua utilização e adesão dos pacientes ao tratamento. Sua instabilidade frente à luz, altos valores de pH, metais e a presença de oxigênio, configuram, também, um passo limitante para o seu uso. Desta forma, a inclusão do fármaco em nanocarreadores constituiu o principal objetivo deste trabalho. Nanocápsulas de núcleo lipídico e nanoemulsões contendo 0,5 mg/mL de ditranol e 0,05% de EDTA ou 0,02% de ácido ascórbico foram preparadas pelos métodos de deposição interfacial do polímero pré-formado e emulsificação espontânea, respectivamente, e avaliadas em relação as suas características físico-químicas (teor de fármaco, eficiência de encapsulamento, pH, diâmetro médio de partícula, polidispersão e potencial zeta). As nanocápsulas, após preparação, apresentaram características satisfatórias: teor de fármaco próximo ao teórico, eficiência de encapsulamento de, aproximadamente, 100%, diâmetro de partícula na faixa nanométrica (220-250 nm), índice de polidispersão abaixo de 0,25, potencial zeta negativo e valores de pH de 5,6 a 4,4. Ao contrário, um baixo teor de fármaco foi verificado para as nanoemulsões (aproximadamente, 80%) após preparação. No estudo de fotodegradação frente à luz UVA se observou uma maior estabilidade do fármaco nas nanocápsulas em comparação à solução do fármaco livre (t1/2 = 4 e 1 hora para a nanocápsula e solução do fármaco livre contendo EDTA, respectivamente; t1/2 = 17 e 7,5 horas para a nanocápsula e solução do fármaco livre contendo ácido ascórbico, respectivamente). O ensaio de irritação pelo método de HET-CAM foi realizado para a avaliação da segurança das formulações. A partir dos resultados verificou-se que a encapsulação do fármaco diminuiu sua toxicidade em relação aos efeitos observados para o fármaco livre. Posteriormente, hidrogéis contendo as nanocápsulas foram preparados empregando-se Carbopol® 940 e Aristoflex® AVC como polímeros formadores de gel. As formulações semissólidas desenvolvidas apresentaram propriedades adequadas para a aplicação tópica e maior estabilidade quando comparadas às suspensões de nanocápsulas e ao hidrogel contendo o fármaco livre. Além disso, uma maior estabilidade do ditranol foi verificada para os hidrogéis preparados com Aristoflex® AVC.

Para a avaliação do potencial irritante de substâncias aplicadas topicamente tem-se utilizado metodologias que baseiam nos estudos de Draize, onde preconiza-se o uso de animais. Devido à forte oposição a estes testes, intensa tem sido a busca por métodos alternativos visando diminuir ou eliminar a utilização de animais. Este estudo avaliou o potencial irritante de diversas substâncias através de duas metodologias: o teste in vivo , empregando metodologia oficial do Food and Drug Administration (FDA), onde utiliza-se coelhos e o teste de citotoxicidade in vitro - método de difusão em camada de agar sobreposta à monocamada de células - empregando as linhagens celulares He La e NCTC L 929 e o corante vital vermelho neutro. As amostras de produto acabado abrangeram colírios, testados sem diluição e xampus de uso adulto e infantil testados puros e diluídos a 25%, 5%, 1% e 0,1%. As matérias-primas compreenderam tensoativos aniônicos, não-iônicos e anfóteros testados após diluição. O material de acondicionamento foi representado por frascos de polietileno para colírios, testados através dos seus extratos em solução de NaCI 0,9%. Os resultados obtidos com as amostras de colírios e frascos de acondicionamento foram negativos quanto à irritação ocular em coelhos e comprovaram ausência de citotoxicidade nas duas linhagens celulares. As amostras de xampus apresentaram boa correlação dos resultados quando testadas sem diluição ou diluídas a 1,0% e 0,1 %. Foi calculada a correlação de Spearman entre os dados obtidos com as duas linhagens celulares sendo o valor do coeficiente r = 0,950 indicando uma correlação direta entre os resultados obtidos com as duas células. Os resultados demonstram a possibilidade de desenvolvimento de metodologias alternativas, sujeitas à validação, que resultem em procedimentos sensíveis, reprodutíveis, não sujeitos a critérios subjetivos de interpretação, visando assim, num primeiro estágio diminuir o uso de animais pelo emprego destas metodologias em avalições prévias do potencial irritante de substâncias químicas. / To evaluate the irritability potential of toppically laid on substances, some methodologies based on Draize\'s study where the use of animals is demanded, have been used. Due to the strong opposition of society and scientific comunity, the search for alternative methods having in view the reduction or even the elimination of animals have been intense, either through the use of volunteers or of in vitro methodologies. The present study has evaluated the irritability of several substances including finished products, raw materials and packagíng materials through two methodologies: the in vivo test which makes use of official methodology from Food and Drug Administration (FDA), where rabbits are employed and the citotoxicity in vitro test - method of diffusion in agar layer added to the monolayer of cells - using He La and NCTC L 929 cells lines and neutral red. The samples of the finished products embraced eye drops, tested without dilution, and shampoos for adults and children use both concentrated and diluted to 25%, 5%, 1% and 0.1 %. Raw materiais included anionis, non-anionic and amphoteric surfactants tested after dilution. The packaging material, represented by eye drops polyethylene bottles, was tested through its extracts in a NaCI 0,9% solution. The results obtained with the samples of eye drops and packaging materials were negative as for ocular irritation in rabbits and confirmed the absence of cytotoxicity in both cells lines. The samples of shampoos presented good correlation of results when tested without dilution or diluted to 1% and 0.1 %. It has been calculated Spearman correlation considering dates obtained with two cells lines, with value of coefficient r = 0,950 showing a direct correlation between results obtained with two cells. The results obtained with this study are likely to lead to sensitive and reproductive procedures, which won\'t arise subjective criteria of interpretation. Thus, the elimination of the use of animals will be possible at a first stage of previous evalution, and once a posterior validation of this methodology is done, the rational use of a smaller number of animais will be a reality.

Considerando que os produtos cosméticos são de livre acesso ao consumidor e alguns podem acidentalmente entrar em contato com os olhos, eles devem ser aprovados em testes de irritação ocular. Durante muitos anos, essa avaliação foi feita pelo teste de Draize utilizando animais de experimentação. Entretanto, devido a questões éticas envolvendo o uso desses animais, atualmente há uma busca por métodos alternativos para essa avaliação. Assim, o objetivo deste projeto foi propor uma estratégia para a avaliação do potencial de irritação ocular de alguns ingredientes cosméticos, como os tensoativos, dodecil sulfato de sódio (SDS), lauril éter sulfato de sódio (LESS), cocoilglutamato de sódio (CGS), polissorbato 20, capriloil/caproil metil glucamida (CCMG), cocoamidopropilbetaína (CAB), bem como os silicones, dimeticone e ciclopentasiloxano, utilizados na fabricação de produtos cosméticos para cabelo (shampoos), área dos olhos e rosto (demaquilantes e cremes). Para isso, foram utilizados métodos alternativos à experimentação animal, tais como Hen\'s Egg Test - Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) e ensaio de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina (BCOP) e análise histopatológica das córneas. O primeiro ensaio avalia os eventos vasculares, hiperemia, hemorragia e coagulação, que a substância teste possa causar na CAM, mimetizando, com isso, a conjuntiva ocular. Já o BCOP avalia as alterações na opacidade e na permeabilidade provocada pela substância teste. A análise histopatológica é uma ferramenta complementar ao ensaio de BCOP, avaliando o grau e a profundidade da lesão ocasionada pela substância teste na córnea bovina. A maioria dos tensoativos foi considerada irritante severo no ensaio de HET-CAM, com exceção do polissorbato 20 (10%) classificado como irritante moderado, enquanto que os silicones não foram irritantes. Já no ensaio de BCOP, a maioria dos tensoativos foi classificada como sem predição, exceto o polissorbato 20 (10%), o CCMG 1,5% e os silicones, os quais foram classificados como não irritantes. Na análise histopatológica, os tensoativos sem predição no BCOP, foram classificados como irritantes severos: SDS 10%, CAB 3% e 1,5% e CCMG 3%; irritantes moderados: LESS 10% e 7%; irritantes leves: SDS 1% e CGS 3%; e não irritantes: CGS 1,5% e CCMG 1,5%. Os silicones não causaram nenhum dano na córnea. Diante dos resultados obtidos no presente trabalho, a seguinte estratégia foi proposta para a avaliação do potencial de irritação ocular de ingredientes cosméticos: em um primeiro nível deve-se utilizar o ensaio de HET-CAM, o qual avalia os eventos vasculares, mimetizando a conjuntiva ocular. Em seguida, no 2º nível, com o ensaio de BCOP, avaliam-se os efeitos do ingrediente sobre a córnea (opacidade e permeabilidade). Se o ingrediente for classificado como irritante severo ou não irritante nos dois ensaios, ele não necessita de mais avaliações. Entretanto, se esse produto apresentar algum potencial irritante no HET-CAM e for classificado como sem predição ou sem categoria no BCOP, deve-se prosseguir para o 3º nível, a avaliação histopatológica. Nessa etapa o ingrediente é avaliado quanto ao grau e a profundidade da lesão que ele provoca na córnea bovina, possibilitando, até mesmo, inferir sobre a reversibilidade da lesão. Portanto, a estratégia proposta para avaliar o potencial de irritação ocular de ingredientes e produtos cosméticos é bastante promissora, pois é possível avaliar os eventuais danos que eles podem causar na conjuntiva ocular e na córnea por diferentes mecanismos toxicológicos, predizendo, assim, a toxicidade ocular desses produtos. / Cosmetic products are freely available to the consumer and may accidentally come into contact with the eyes; thus they must be approved by eye irritation tests. For many years, these evaluations were performed in experimental animals (Draize test). However, due to ethical issues involving the use of animals, there is a search for alternative methods for this evaluation. Thus, the aim of this project was to measure the ocular irritation potential of some cosmetic ingredients, such as sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium cocoylglutamate (SCG), polysorbate 20, capryloyl /caproyl methyl glucamide (CCMG), cocoamidopropyl betaine (CAPB), as well as silicones, dimethicone and cyclopentalosiloxane, used to manufacture cosmetic products for hair (shampoos), eye and face area (make-up removers and creams). For that purpose, alternative methods of animal experimentation were used, such as Hen\'s Egg Test - Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) and Bovine Corneal Permeability and Opacity (BCOP) test and histopathological analysis of the corneas. The first assay evaluates the vascular events, hyperemia, hemorrhage and coagulation, which a test substance can cause in the CAM, simulating endpoints that occur in ocular conjunctiva. BCOP evaluates alterations in opacity and permeability caused by test substance on the cornea. The histopathological analysis is a complementary tool to BCOP test, evaluating the degree and depth of the lesion caused by the test substance in the bovine cornea. Most of the surfactants were non-irritant on HET-CAM, except polysorbate 20 (10%) that was classified as moderate irritant, while silicones were non-irritant. In the BCOP assay, most surfactants were classified as unpredicted, except polysorbate 20 (10%) and CCMG 1.5%, and silicones, which were classified as no category (non-irritant). In the histopathological analysis, unpredictive surfactants in BCOP were better classified as severe irritants: SDS10%, CAB 3% and 1.5% and CCMG 3%; moderate irritants: LESS 10% and 7%; mild irritants: SDS 1% and CGS 3%; and non-irritant: CGS 1.5% and CCMG 1.5%. Silicones did not cause any damage on the cornea. Considering the results obtained in the present study, the following tiered strategy was proposed for the evaluation of the ocular irritation potential of cosmetic ingredients: the first tier should be the HET-CAM assay, which evaluates the vascular events, simulating the conjunctiva. Then, the second tier, with the BCOP assay, the effects of the ingredient on the cornea (opacity and permeability) are evaluated. If the ingredient is classified as a severe irritant or non-irritant in both tests, it does not require further evaluation. However if that ingredient or product is considered as a potential irritant in HET-CAM and in BCOP, i.e. it is classified as unpredicted or no category, it is necessary to proceed to the third tier, the histopathological evaluation. At this stage, the ingredient is evaluated for the degree and depth of the lesion that it provoked in the bovine cornea, allowing even to infer about the reversibility of the lesion. Finally, the proposed strategy for evaluating the potential of eye irritation is very promising to evaluate ingredients and cosmetic products, since it is possible to evaluate the possible damages that they can cause in the conjunctiva and in the cornea by different toxicological mechanisms, thereby predicting the ocular safety of those products.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-08-16T15:26:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rafael do Nascimento Ducas - 2015.pdf: 1199090 bytes, checksum: 197e2d02385d6512ad213fe017f881ae (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: Olhe a data na citação: DUCAS, R. N. Análise de métodos alternativos ao uso de animais para a classificação da irritação ocular induzida por corantes têxteis. 2015. 52 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2018. on 2018-08-17T11:28:42Z (GMT) / Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-08-20T11:47:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Rafael do Nascimento Ducas - 2015.pdf: 1199090 bytes, checksum: 197e2d02385d6512ad213fe017f881ae (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: Olhe a data da defesa na citação on 2018-08-21T11:19:58Z (GMT) / Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-08-21T11:36:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Rafael do Nascimento Ducas - 2015.pdf: 1199090 bytes, checksum: 197e2d02385d6512ad213fe017f881ae (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-08-22T12:39:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Rafael do Nascimento Ducas - 2015.pdf: 1199090 bytes, checksum: 197e2d02385d6512ad213fe017f881ae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Rafael do Nascimento Ducas - 2015.pdf: 1199090 bytes, checksum: 197e2d02385d6512ad213fe017f881ae (MD5) Previous issue date: 2015-05-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The evaluation of the toxicity of chemicals still involves the use of animals. However, due to animal welfare and ethical values, research laboratories and regulatory agencies are working together to develop scientifically valid alternative methods. Currently, the Bovine Cornea Opacity and Permeability Test (BCOP) can be used as an alternative methodology to the Draize Test in the determination of ocular irritation and corrosion. In addition, recent data from the literature show that the association between alternative methods represents a useful tool in the evaluation of these parameters. In this context, the objective of this study was to evaluate the efficacy of the BCOP test and the Short-Term Exposure Test (STE) in determining the ocular irritation of Reactive Orange 16 (RO16) and Reactive Green 19 (RG19) based on the United Nations Globally Harmonized System of Classification (UN GHS) and in accordance with the Occupational Safety and Health Administration - Hazard Communication Standard 29 CFR 1910 (OSHA HCS), as Category 2A (eye irritant), using the in vivo test from Draize. The STE test (OECD 491) was used to evaluate cytotoxicity in SIRC cells and the BCOP (OECD 437) assay for opacity, permeability and bovine cornea histopathology. According to the STE test, the RO16 dye obtained cell viability of 47% at 5% concentration and 51% of cell viability at the concentration of 0.05%. The corange RG19 presented cell viability of 41.5% in the concentration of 5% and 44% of cell viability in the concentration of 0.05%. Thus, the dyes were classified as Category 1 of the GHS. The BCOP assay, however, classified only RG19 dye as GHS Category 1 with IVIS: 112,760. The RO16 dye resulted in an IVIS: 12.027, not being classified by this method. To complement this assay, histopathological analyzes were performed, which allowed the observation of significant loss of epithelial cells, intense cytoplasmic vacuolization and damage to the epithelial structure of the corneas exposed to RG19 dye. Although not classified by the BCOP, the corneas exposed to RO16 showed surface coating losses and cytoplasmic vacuolization. Therefore, the STE test alone was not sufficient to define the categorization of the ocular irritation potential of the dyes in relation to the GHS system, but its association with the BCOP test added by the histomorphometric analysis may be an alternative for the prediction of this effect, investigation of other dyes to confirm this fact. / A avaliação da toxicidade de produtos químicos ainda envolve o uso de animais. No entanto, devido ao bem-estar animal e valores éticos, os laboratórios de pesquisas e as agências regulatórias estão trabalhando juntos no desenvolvimento de métodos alternativos cientificamente válidos. Atualmente, o Ensaio de Opacidade e Permeabilidade da Córnea Bovina (BCOP) pode ser utilizado como metodologia alternativa ao Teste de Draize na determinação da irritação e corrosão ocular. Além disso, dados recentes da literatura demonstram que a associação entre métodos alternativos representa uma ferramenta útil na avaliação destes parâmetros. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia da associação do ensaio BCOP com o Teste de Exposição de Curta Duração (STE) na determinação da irritação ocular dos corantes têxteis Reactive Orange 16 (RO16) e Reactive Green 19 (RG19), classificados com base no Sistema Globalmente Harmonizado de Classificação das Nações Unidas (UN GHS) e de acordo com a Occupational Safety & Health Administration - Hazard Communication Standard 29 CFR 1910 (OSHA HCS), como Categoria 2A (irritante para olhos), utilizando o teste in vivo de Draize. Para tanto, foram utilizados o teste STE (OECD 491) para avaliação da citotoxicidade em células SIRC e o ensaio BCOP (OECD 437) para análise da opacidade, permeabilidade e histopatologia da córnea bovina. De acordo com o teste STE, o corante RO16 obteve viabilidade celular de 47% na concentração de 5% e de 51% de viabilidade celular na concentração de 0,05%. Já o corange RG19 apresentou viabilidade celular de 41,5% na concentração de 5% e 44% de viabilidade celular na concentração de 0,05%. Assim, os corantes foram classificados como Categoria 1 do GHS. Já o ensaio BCOP classificou apenas o corante RG19 como Categoria 1 do GHS com IVIS:112,760. O corante RO16, resultou em um IVIS:12,027, não sendo classificado por este método. Para complementar esse ensaio, foram realizadas análises histopatológicas, o que permitiu observar a perda significativa de células epiteliais, a vacuolização citoplasmática intensa e danos à estrutura epitelial das córneas expostas ao corante RG19. Apesar de não ser classificado pelo BCOP, as córneas expostas ao RO16 apresentaram perdas do revestimento superficial e vacuolização citoplasmática. Portanto, o teste STE sozinho não foi suficiente para definir a categorização do potencial de irritação ocular dos corantes frente ao sistema GHS, mas a sua associação com o ensaio BCOP adicionado da análise histomorfométrica pode ser uma alternativa para a predição desse efeito, sendo necessária a investigação de outros corantes para a confirmação desse fato.

Insects of the family Cercopidae are easily identified by the spit-like foam that they produce to surround themselves during the nymphal stage. Known as spittlebugs, these insects can be observed developing in a wide range of host plants. Among the functions attributed to the foam, there are the protection of nymphs against high temperatures, desiccation and natural enemies. However, experimental evidence to confirm these hypotheses are sparse. Mahanarva fimbriolata is an economically important spittlebug in Brazilian sugarcane crops, especially after the harvest with burning had been prohibited. The nymphs of M. fimbriolata develop on the soil surface or below ground where they suck the xylem content of exposed sugarcane roots, blocking the water and nutrients transport, eventually causing physiological disorder. In this thesis, it was evaluated the importance of foam for the thermoregulation of M. fimbriolata nymphs, its bacterial microbiome and the protective action against predators. The thesis was divided into four chapters. The Chapter 1 presented an introduction to the bioecological aspects of M. fimbriolata and the possible role of foam produced by the nymphs, which was explored in details along the other chapters. The Chapter 2 examined the importance of foam and its chemical compounds in the thermoregulation of nymphs. The Chapter 3 explored the diversity and composition of bacterial community present in the foam, in the gut of nymphs, and in the soil close to the foam. The Chapter 4 investigated whether the foam acts in protecting the nymphs against the predatory ants Solenopsis invicta, and its topical irritancy to the cockroaches Periplaneta americana. It was demonstrated that the foam produced by M. fimbriolata: (i) serves as an important thermal microhabitat, maintaining the temperature close to the ideal for the nymphs development; (ii) harbor a diversity of bacteria previously reported as protective symbionts of insects, which are probably originated from the nymphs\'s gut; and (iii) is a repellent to predators and topical irritant to another arthropod (roaches). Taken together, the foam produced by M. fimbriolata is a thermoregulatory and defensive strategy to the nymphs. In addition, this thesis serves as a background for future research that aims to investigate the importance of foam for the growth and development of spittlebugs. / Os insetos da família Cercopidae são facilmente reconhecidos pela espuma que produzem durante o desenvolvimento ninfal para recobrir o próprio corpo. Essas ninfas, conhecidas como cigarrinhas, podem ser observadas em uma ampla gama de plantas hospedeiras. Dentre as funções atribuídas à espuma estão a proteção contra elevadas temperaturas, dessecação e inimigos naturais. Contudo, evidências experimentais para confirmar estas hipóteses são escassas. Mahanarva fimbriolata é uma cigarrinha de importância econômica em áreas de produção de cana-de-açúcar no Brasil, especialmente após a proibição da colheita da cana com queima prévia. As ninfas de M. fimbriolata se desenvolvem nas raízes de cana-de-açúcar expostas na superfície ou abaixo do solo, onde sugam a seiva do xilema, bloqueando o transporte de água e nutrientes e causando desordens fisiológicas. Nesta tese foi avaliada a importância da espuma para a termorregulação de ninfas de M. fimbriolata, seu microbioma bacteriano e sua ação protetora contra predadores. A tese foi dividida em quatro capítulos. O Capítulo 1 apresenta uma introdução sobre os aspectos bioecológicos de M. fimbriolata e o possível papel da espuma produzida pelas ninfas, o qual foi explorado em detalhes ao longo dos demais capítulos. O Capítulo 2 examinou a importância da espuma e de seus compostos químicos na termorregulação das ninfas. O Capítulo 3 explorou a diversidade e composição da comunidade bacteriana presente na espuma, no intestino das ninfas, e no solo próximo à espuma. O Capítulo 4 investigou se a espuma atua na sua proteção das ninfas contra formigas predadoras Solenopsis invicta, e sua irritação tópica a baratas Periplaneta americana. A espuma produzida por M. fimbriolata demonstrou: (i) servir como um importante microhabit térmico, mantendo a temperatura próxima da ideal para o desenvolvimento das ninfas; (ii) abrigar uma diversidade de bactérias previamente reportadas como simbiontes protetivos de insetos e que, provavelmente, são provenientes do intestino das ninfas; e (iii) ser repelente a formigas predadoras e irritante a outro artrópode (baratas). Tomados em conjunto, a espuma produzida por M. fimbriolata serve como uma estratégia termorregulatória e defensiva para as ninfas. Ademais, esta tese serve como base para futuras pesquisas que visam investigar a importância da espuma para o crescimento e desenvolvimento das cigarrinhas.

Made available in DSpace on 2016-07-27T14:19:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fabiana Fleury Curado.pdf: 935686 bytes, checksum: 3b9ed2af882b4e2d66e81f384594a6c8 (MD5) Previous issue date: 2012-04-24 / The present study examined the emotional response of irritation issued by two people referred by psychiatrists. The participants were male and had more than 30 years old, one was diagnosed with Bipolar Disorder. To analyze the variables that are likely controlled or sustain the emotional response of irritation was applied a experimental design of multiple conditions. The experimental design of multiple conditions was performed on three conditions: condition (1) attention, condition (2) alone and condition (3) game. The condition (1) attention was divided on two: (1.1) attention, a signal of disapproval; (1.2) attention, activity questioned. In condition (3) game the participants played a card game in software that controls the gain and loss of points to set up schemes consequences: positive reinforcement and negative punishment. The results of condition (1) attention show that the presentation of aversive stimuli produced reports of irritation and repertoire of emotional response indicatives of irritation in both participants. The results of condition, (3) game indicate that positive emotions was more frequently in the procedures of positive reinforcement and negative emotions in the procedures of punishment. The results presented indicate that emotional irritation was emitted more frequently against presentation of disapproval and inquisitive speeches and situations of loss of points, what contributed to the study of variables that evoke irritation. / O presente trabalho analisou a resposta emocional de irritação emitida por duas pessoas encaminhadas por psiquiatras. Os participantes eram do sexo masculino e com mais de 30 anos, sendo um deles diagnosticado com o Transtorno do Humor Bipolar. Para análise das variáveis que provavelmente controlavam ou mantinham a resposta emocional de irritação aplicou-se um delineamento de múltiplas condições. O delineamento experimental de múltiplas condições foi aplicado em três condições: condição (1) atenção, condição (2) sozinho e (3) jogo. A condição (1) atenção foi manipulada duas subcondições: (1.1) atenção, sinal de reprovação; (1.2) atenção, atividade questionada. Na condição (3) jogo os participantes interagiam com um software que simulava um jogo de cartas e que controlava o ganho e a perda de pontos para configurar dois esquemas de consequências: reforçamento positivo e punição negativa. Os resultados obtidos nas condições de (1) atenção mostram que a apresentação de estímulos aversivos produziu os relatos irritação e repertórios indicativos da resposta emocional de irritação em ambos os participantes. Os resultados da condição (3) jogo indicam que emoções positivas foram emitidas com maior frequência nos procedimentos de reforço positivo e emoções negativas nos procedimentos de punição. Os resultados apresentados indicam que as respostas indicativas da emoção irritação foram emitidas com maior frequência diante da apresentação das falas reprovativas e questionadoras e das situações de perdas de pontuações, o que contribuiu para o estudo das variáveis evocativas de irritação.