Orientador: Augusto Ducati Luchessi / Resumo: O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é uma proteína altamente conservada em archaeas e eucariotos. Caracteriza-se por ser a única proteína conhecida a apresentar o resíduo de aminoácido hipusina, produzido a partir de uma modificação pós-traducional denominada hipusinação, a qual é essencial para sua atividade. Atualmente eIF5A é correlacionada com o início, elongação e término da tradução, além disso, sua função têm sido associada com diferentes processos celulares, fisiológicos e patológicos. Em humanos, é predito que eIF5A seja gerada a partir de cinco variantes transcricionais (A, B, C, D e X5). As variantes B, C, D e X5 codificam a proteína canônica isoforma B de 17 kDa, a qual vêm sendo estudada nas últimas décadas. Entretanto, é previsto que a variante A codifique uma isoforma alternativa (isoforma A) de 20 kDa, que tem uma sequência adicional de 30 aminoácidos na extremidade N-terminal. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar eventos moleculares inéditos envolvendo a isoforma A de eIF5A1 humana. Neste estudo, mostramos que a isoforma A é produzida em células HeLa, a qual foi mostrada ser passível de hipusinação. Análises de bioinformática mostraram que a isoforma A possui alta probabilidade de direcionamento para mitocôndria. Assim, técnicas de fracionamento subcelular mostraram que a isoforma A co-purifica com a mitocôndria, diferentemente da isoforma B. Análises de silenciamento gênico em células HeLa, utilizando moléculas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is a highly conserved protein in archaeas and eukaryotes. It is characterized by being the only protein known to present the amino acid residue hypusine, produced from a post-translational modification called hypusination, which is essential for its activity. Currently eIF5A is correlated with the beginning, elongation and termination of translation, and its function has been associated with different cellular, physiological and pathological processes. In humans, eIF5A is predicted to be generated from five transcriptional variants (A, B, C, D and X5). Variants B, C, D and X5 encode the 17 kDa canonical protein B, which has been studied in recent decades. However, variant A is expected to encode an alternative 20 kDa isoform (A isoform), which has an additional 30 amino acid sequence in the N-terminal region. In this context, the present study aimed to characterize unpublished molecular events involving the human eIF5A1 isoform A. In this study, we showed that in HeLa cells, isoform A was detected, which was shown to be subject to hypusination. Bioinformatics analysis showed that isoform A has a high probability of targeting mitochondria. Thus, subcellular fractionation techniques have shown that isoform A co-purifies with mitochondria, unlike isoform B. Analysis of gene silencing in HeLa cells using eIF5A1 isoform A-specific siRNA molecules showed that protein depletion is capable of cause apoptosis in cells, as well as... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Lucia Galvão de Albuquerque / Resumo: As características de qualidade de carne, por serem de difícil mensuração, raramente são contempladas em programas de melhoramento genético. Porém, é necessário conhecer sobre os genes e os mecanismos moleculares que controlam essas características, isso poderá auxiliar na avaliação de animais de forma precoce. Objetivo desse estudo foi identificar e analisar genes e isoformas de mRNA diferencialmente expressos no tecido do músculo Longissimus thoracis de bovinos da raça Nelore, fenotipicamente divergentes para características cor da carne, marmoreio e maciez da carne (avaliada através das metodologias de WBSF e MFI) usando dados de RNA-Seq. Além disso, esse estudo visa a identificação dos efeitos de variantes estruturais em “splice sites” de transcriptos diferencialmente expressos em animais fenotipicamente divergentes para as características de color e marmoreio da carne. Uma média de 37 mil transcritos foram detectados sendo expressos no músculo de bovinos Nelore. Foram identificados 40 e 28 isoformas de mRNA (p-valor < 0,001) diferencialmente expressas para os fenótipos de WBSF e MFI, respectivamente. Além disso, foram identificados sendo diferencialmente expressos os mRNAs [WBSF (SYNPO-201) e MFI (ANKRD23-202)], e entre outras isoformas de mRNA relacionadas a genes que afetam a velocidade de degradação das fibras musculares durante o processo de envelhecimento da carne, como e.g. [para WBSF (MYOT, CASQ1, TPM2, MB e SYNM) e para MFI (FGFRL1 e NEB)]. Na análise de enriquec... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The measurement of meat quality traits are costly, because of that it is rarely included in breeding programs. However, it is necessary to know about the genes and the molecular mechanisms that control these traits, this may help in the evaluation of animals at an early stage.Thus, the identification of mRNA isoforms and the associated splice variants affecting meat quality traits in Nellore cattle could allow to better understanding the genetic architecture of these complex traits. The objective of this study was to identify and analyze genes and mRNA isoforms differentially expressed in the Longissimus thoracis muscle tissue of Nellore cattle, phenotypically divergent for meat color, marbling and meat tenderness (evaluated using WBSF and MFI methodologies) traits, using RNA-Seq data. In addition, to identify structural variants affecting splice sites of differencially expressed mRNA isoforms for marbling and meat color traits. An average of 37 thousand transcripts were detected in the Nellore muscle transcriptomic analysis. A total of 40 and 28 mRNA isoforms (p-value |<| 0.001) were differentially expressed between divergent groups for WBSF and MFI phenotypes, respectively. The differentially expressed mRNA isoforms [WBSF(MYL1, MYL3, MYH1 and MYBPC2) and MFI (MYL6) traits], which are myosin encoders, was the family with most abundantly number of mRNA isoforms detected as diferencially expressed. In addition, we identified as DE [WBSF (SYNPO-201 isoform) and for MFI (ANKRD23... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: A leucemia linfoide aguda (LLA) \"BCR-ABL1-like\" exibe um perfil de expressão gênica semelhante ao observado em pacientes com LLA BCR-ABL1+. Este subtipo representa até 15% de todos os casos de LLA de linhagem B na população pediátrica e é frequentemente associado à presença de deleção total ou parcial do gene IKZF1. As isoformas de domínio negativo têm sido associadas a um aumento na chance de falha de resposta ao tratamento e tem sido associada com pior prognóstico. Objetivos: Analisar a presença de deleções do gene IKZF1 e a expressão de suas isoformas em amostras de medula óssea ao diagnóstico de crianças com LLA por técnica simplificada e de baixo custo de RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) e avaliar a associação desta alteração com fatores clínicos, biológicos e sobrevida. Metodologia: Foram analisadas 137 amostras de medula óssea colhidas ao diagnóstico de crianças com LLA, sendo 100 amostras de LLA de linhagem B, 35 de linhagem T e 2 na qual não foi possível a definição do imunofenópo, todas classificadas e tratadas segundo o protocolos GBTLI-99. A presença de deleções das isoformas do gene IKZF1 foi analisada por técnica de RT-PCR e confirmadas por sequenciamento automático. Associação entre deleção do IKZF1 e as variáveis idade, número de glóbulos brancos, grupo de risco, subgrupo molecular, presença de doença residual mínima e evento (recidiva ou óbito) foi analisada pelo teste exato de Fisher. Sobrevida livre de eventos, sobrevida livre de doença e sobrevida global foram avaliadas por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para testar a independência dos fatores prognósticos. Resultados: Deleção total ou parcial no gene IKZF1 foi observada em 27/100 amostras de LLA B-derivada, sendo 15 evidenciando hiperexpressão das isoformas 6 ou 10, em 9 a expressão das isoformas foi de fraca intensidade e em 3 houve deleção total do gene. Nas amostras de LLA T-derivada foram observadas 3 alterações sendo 2 hiperexpressões da isoforma Ik6 e uma deleção total do gene. Presença de expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 de IKZF1 foi associada na LLA B-derivada com pior sobrevida livre de eventos (SG), sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG)(P<0,001)). A presença de qualquer deleção do gene teve impacto apenas na SG (P=0,003). A sobrevida livre de eventos em 5 anos foi de 78,1 ± 4,6% versus 32 ± 12,4 % (P< 0,001), para os grupos sem e com expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 forte de IKZF1 respectivamente, com risco relativo de evento desfavorável de 6.034 (95% IC: 2,105 - 17,295) para a presença da deleção. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox nas LLA de linhagem B mostrou que expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 foi o principal fator prognóstico independente (P<0.001) quando analisada em associação com idade, imunofenótipo (ausência de CD10), status da medula óssea no D28 da terapia de indução (M2/M3) e presença de DRM no D28 da indução tanto para SLE, quanto para SLD e SG. Nossos dados sugerem que o uso de técnica simplificada e de baixo custo para análise de deleções do gene IKZF1 é capaz de detectar pacientes com maior risco de recidiva, podendo ser útil na estratificação de pacientes com LLA de linhagem B em futuros protocolos de tratamento. Estudos multicêntricos com maior número de casos são necessários para confirmação destes resultados. / Introduction: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) \"BCR-ABL1-like\" exhibits a gene expression profile similar to that observed in patients with BCR-ABL1 + ALL. This subtype accounts for up to 15% of all B lineage ALL cases in the pediatric population and is often associated with the presence of total or partial deletion of the IKZF1 gene. Negative domain isoforms have been associated with an increased chance of treatment failure and have been associated with poorer prognosis. Objectives: To analyze the presence of deletions of the IKZF1 gene and the expression of its isoforms in bone marrow samples to the diagnosis of children with ALL by simplified technique and lowcost RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) and to evaluate the association of this with clinical, biological and survival factors. Methodology: It has been analyzed 137 bone marrow samples collected at the diagnosis of children with ALL, 100 samples of ALL B lineage , 35 of T lineage and 2 in which it was not possible to define the immunophenotype, all classified and treated according to GBTLI protocols -99. The presence of deletions of the IKZF1 gene isoforms was analyzed by RT-PCR technique and confirmed by automatic sequencing. The association between IKZF1 deletion and the variables age, white blood cell count, risk group, molecular subgroup, presence of minimal residual disease and event (recurrence or death) were analyzed by the Fisher exact test. Event-free survival, disease-free survival and overall survival were assessed by Kaplan-Meier curves and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to test the independence of prognostic factors. Results: Total or partial deletion in the IKZF1 gene was observed in 27/100 samples of B-derived ALL, 15 of which showed hyperexpression of isoforms 6 or 10, in 9 the expression of the isoforms was of low intensity and in 3 there was total deletion of the gene . In the T- derived ALL samples, 3 alterations were observed, 2 hyperexpressions of the Ik6 isoform and a total deletion of the gene. The presence of strong Ik6/Ik10 isoform expression was associated in B-derived ALL with worse event-free survival (SLE), disease-free survival (SLD), and overall survival (OS) (P <0.001). The presence of any deletion of the gene had an impact only on the SLE (P = 0.003). The 5-year event-free survival was 78.1 ± 4.6% versus 32 ± 12.4% (P <0.001), for the groups with and without a strong deletion of IKZF1 respectively, with relative risk of unfavorable event of 6,034 (95% CI: 2,105 - 17,295) for the presence of the deletion. Multivariate analysis by Cox regression model in B lineage ALL showed that the strong expression of Ik6 / Ik10 isoforms was the main independent prognostic factor (P <0.001) when analyzed in association with age, immunophenotype (absence of CD10), marrow status bone in D28 of induction therapy (M2 / M3) and presence of DRM in induction D28 for both SLE, SLD and SG. Our data suggest that the use of simplified and low-cost IKZF1 gene deletion analysis is capable of detecting patients at higher risk of relapse and may be useful in the stratification of patients with B lineage ALL in future treatment protocols. Multicentric studies with a greater number of cases are necessary to confirm these results.

Introdução: A leucemia linfoide aguda (LLA) \"BCR-ABL1-like\" exibe um perfil de expressão gênica semelhante ao observado em pacientes com LLA BCR-ABL1+. Este subtipo representa até 15% de todos os casos de LLA de linhagem B na população pediátrica e é frequentemente associado à presença de deleção total ou parcial do gene IKZF1. As isoformas de domínio negativo têm sido associadas a um aumento na chance de falha de resposta ao tratamento e tem sido associada com pior prognóstico. Objetivos: Analisar a presença de deleções do gene IKZF1 e a expressão de suas isoformas em amostras de medula óssea ao diagnóstico de crianças com LLA por técnica simplificada e de baixo custo de RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) e avaliar a associação desta alteração com fatores clínicos, biológicos e sobrevida. Metodologia: Foram analisadas 137 amostras de medula óssea colhidas ao diagnóstico de crianças com LLA, sendo 100 amostras de LLA de linhagem B, 35 de linhagem T e 2 na qual não foi possível a definição do imunofenópo, todas classificadas e tratadas segundo o protocolos GBTLI-99. A presença de deleções das isoformas do gene IKZF1 foi analisada por técnica de RT-PCR e confirmadas por sequenciamento automático. Associação entre deleção do IKZF1 e as variáveis idade, número de glóbulos brancos, grupo de risco, subgrupo molecular, presença de doença residual mínima e evento (recidiva ou óbito) foi analisada pelo teste exato de Fisher. Sobrevida livre de eventos, sobrevida livre de doença e sobrevida global foram avaliadas por curvas de Kaplan-Meier e teste log-rank. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox foi utilizada para testar a independência dos fatores prognósticos. Resultados: Deleção total ou parcial no gene IKZF1 foi observada em 27/100 amostras de LLA B-derivada, sendo 15 evidenciando hiperexpressão das isoformas 6 ou 10, em 9 a expressão das isoformas foi de fraca intensidade e em 3 houve deleção total do gene. Nas amostras de LLA T-derivada foram observadas 3 alterações sendo 2 hiperexpressões da isoforma Ik6 e uma deleção total do gene. Presença de expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 de IKZF1 foi associada na LLA B-derivada com pior sobrevida livre de eventos (SG), sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG)(P<0,001)). A presença de qualquer deleção do gene teve impacto apenas na SG (P=0,003). A sobrevida livre de eventos em 5 anos foi de 78,1 ± 4,6% versus 32 ± 12,4 % (P< 0,001), para os grupos sem e com expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 forte de IKZF1 respectivamente, com risco relativo de evento desfavorável de 6.034 (95% IC: 2,105 - 17,295) para a presença da deleção. Análise multivariada por modelo de regressão de Cox nas LLA de linhagem B mostrou que expressão forte das isoformas Ik6/Ik10 foi o principal fator prognóstico independente (P<0.001) quando analisada em associação com idade, imunofenótipo (ausência de CD10), status da medula óssea no D28 da terapia de indução (M2/M3) e presença de DRM no D28 da indução tanto para SLE, quanto para SLD e SG. Nossos dados sugerem que o uso de técnica simplificada e de baixo custo para análise de deleções do gene IKZF1 é capaz de detectar pacientes com maior risco de recidiva, podendo ser útil na estratificação de pacientes com LLA de linhagem B em futuros protocolos de tratamento. Estudos multicêntricos com maior número de casos são necessários para confirmação destes resultados. / Introduction: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) \"BCR-ABL1-like\" exhibits a gene expression profile similar to that observed in patients with BCR-ABL1 + ALL. This subtype accounts for up to 15% of all B lineage ALL cases in the pediatric population and is often associated with the presence of total or partial deletion of the IKZF1 gene. Negative domain isoforms have been associated with an increased chance of treatment failure and have been associated with poorer prognosis. Objectives: To analyze the presence of deletions of the IKZF1 gene and the expression of its isoforms in bone marrow samples to the diagnosis of children with ALL by simplified technique and lowcost RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) and to evaluate the association of this with clinical, biological and survival factors. Methodology: It has been analyzed 137 bone marrow samples collected at the diagnosis of children with ALL, 100 samples of ALL B lineage , 35 of T lineage and 2 in which it was not possible to define the immunophenotype, all classified and treated according to GBTLI protocols -99. The presence of deletions of the IKZF1 gene isoforms was analyzed by RT-PCR technique and confirmed by automatic sequencing. The association between IKZF1 deletion and the variables age, white blood cell count, risk group, molecular subgroup, presence of minimal residual disease and event (recurrence or death) were analyzed by the Fisher exact test. Event-free survival, disease-free survival and overall survival were assessed by Kaplan-Meier curves and log-rank test. Multivariate analysis by Cox regression model was used to test the independence of prognostic factors. Results: Total or partial deletion in the IKZF1 gene was observed in 27/100 samples of B-derived ALL, 15 of which showed hyperexpression of isoforms 6 or 10, in 9 the expression of the isoforms was of low intensity and in 3 there was total deletion of the gene . In the T- derived ALL samples, 3 alterations were observed, 2 hyperexpressions of the Ik6 isoform and a total deletion of the gene. The presence of strong Ik6/Ik10 isoform expression was associated in B-derived ALL with worse event-free survival (SLE), disease-free survival (SLD), and overall survival (OS) (P <0.001). The presence of any deletion of the gene had an impact only on the SLE (P = 0.003). The 5-year event-free survival was 78.1 ± 4.6% versus 32 ± 12.4% (P <0.001), for the groups with and without a strong deletion of IKZF1 respectively, with relative risk of unfavorable event of 6,034 (95% CI: 2,105 - 17,295) for the presence of the deletion. Multivariate analysis by Cox regression model in B lineage ALL showed that the strong expression of Ik6 / Ik10 isoforms was the main independent prognostic factor (P <0.001) when analyzed in association with age, immunophenotype (absence of CD10), marrow status bone in D28 of induction therapy (M2 / M3) and presence of DRM in induction D28 for both SLE, SLD and SG. Our data suggest that the use of simplified and low-cost IKZF1 gene deletion analysis is capable of detecting patients at higher risk of relapse and may be useful in the stratification of patients with B lineage ALL in future treatment protocols. Multicentric studies with a greater number of cases are necessary to confirm these results.

Em concentrações elevadas no plasma ou no tecido renal a Angiotensina II (Ang II) induz, alterações na hemodinâmica renal, injúria glomerular, aumento da síntese de componentes da matriz extracelular glomerular, estresse oxidativo e apoptose de células glomerulares, incluindo os podócitos. Os podócitos possuem um sistema reninaangiotensina (SRA) próprio e expressam os receptores AT1 e AT2 para o peptídeo, além do trocador Na+/H+ isoforma 1 (NHE1). O NHE1 está envolvido com a resistência e indução de apoptose, controle do volume celular e manutenção do fenótipo celular. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar em podócitos, o papel da Ang II na indução de apoptose, e os eventos intracelulares associados à atividade do NHE1 nesta condição. Nossos resultados indicam que o tratamento com Ang II em alta concentração por 24 horas promove apoptose em podócitos. Nesta condição o NHE1, promove ativação da via de sinalização intracelular p38 MAPK e aumenta a atividade do NHE1 levando a alcalose, ativação da Bax e apoptose nos podócitos. / It has been observed that high plasma, or kidney tissue concentrations of angiotensin II (Ang II) leads to changes in renal hemodynamics, severe glomerular injury, increased synthesis of glomerular extracellular matrix components, oxidative stress and apoptosis in glomerular cells, including podocyte and mesangial cells. Podocytes a local renin-angiotensin system (RAS), expresses the AT1 and AT2 receptors for Ang II and the Na + / H + exchanger (NHE1). The NHE1 is involved with resistance and induction of apoptosis, cell volume control and maintenance of cell phenotype. Thus, the goal of this study was to investigate in podocytes the role of Ang II in the induction of apoptosis, and intracellular events linked to the NHE1 activity in this condition. Our results indicate that the treatment with Ang II, in a high dose, for 24 hours induces apoptosis in podocytes, and promotes oxidative stress. However, the activation of NADPH oxidase subunits Nox4 and p22 (phox) and pro- apoptotic pprotein Bax, came before the late apoptosis observed in 24 hours of treatment with Ang II. Under physiological conditions, the NHE1 activity contributes to cell survival by preventing cytosolic acidification. Moreover, Ang II via the AT1 receptor, activates intracellular signaling pathway p38 MAPK and increases the NHE1 activiy leading to alkalosis, Bax activation and apoptosis in podocytes.

Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Agnes Thiane Machado.pdf: 7176772 bytes, checksum: 01a4049f5c4aed0935803a0cf3a6468d (MD5) Previous issue date: 2017-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Study of protein three-dimensional structures allow us to investigate the relations between amino acid sequence, structure and function, what is important chiefly for proteins from pathogenic organisms or ones that belong to the same genus of these, such that they can be used as a structural model. In this context, this work aims at the structural characterization of the enzymes alanine racemase long isoform from Trypanosoma cruzi and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi. The long isoform of alanine racemase catalyzes the conversion between L and D-alanine which, in turn, is part of one of the metabolic pathways in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The heterologous expression of this enzyme in Escherichia coli BL21 (DE3) GroEL was analyzed by SDS-PAGE, which revealed that the protein is in higher proportion in the insoluble fraction, thus it was necessary to establish a recovery protocol followed by an in vitro refolding. Data from enzymatic assays and circular dichroism revealed the success of the recovery/refolding protocol, which may in the future contribute to the search for specific inhibitors. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Naegleria gruberi catalyzes the sixth step of the organism’s glycolytic pathway. NgGAPDH enzyme was expressed in E. coli (DE3) using the pET-15b vector, and then purified by tree chromatographic steps, two of nickel affinity and one of size exclusion. The enzymatic characterization was investigated with the enzyme without the his-tag; NgGAPDH presented higher activity at pH 8.0, 25 °C and 10 mM of arsenate, and positive cooperativity for substrates G3P and NAD+. His-tag depleted NgGAPDH crystals appeared in 3 days after drop settings, the best crystal diffracted to 1.94 A resolution and belongs to space group P21 with cell parameters a = 83.74 A, b = 94.55 A, c = 90.93 A, = 99.96 °. The final refined structure presents R = 0.1652 and Rfree = 0.2029. The catalytic domain formed by residues 134 to 313 is highly conserved, as expected, with the exception of Asn145, present only in NgGAPDH, while the other GAPDHs present either Ser or Thr on the corresponding position. Molecular dynamics analysis revealed that Asn145 has correlated motion with residues Ala123, Thr125 and Pro126 that belong to what was called "bonded loop". It should be emphasized that this is the first GAPDH from the phylum Percolozoa that has its three dimensional structure determined and kinetic parameters established, such that we expect to have contributed to the understanding of the evolution of this class of proteins. / O estudo da estrutura tridimensional de proteínas nos permite investigar as relações entre sequência de aminoácidos, estrutura e função, o que é importante principalmente para proteínas de organismos patogênicos ou mesmo pertencente ao gênero destes, que podem ser utilizadas como modelo estrutural. Neste contexto, o presente trabalho visa caracterizar estruturalmente as enzimas alanina racemase isoforma longa de Trypanosoma cruzi e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi. A alanina racemase isoforma longa catalisa a conversão entre L e D-alanina em uma das vias metabólicas do T. cruzi, que é o agente etiológico da doença de Chagas. A análise por SDS-PAGE de amostras da expressão heteróloga dessa enzima em Escherichia coli BL21(DE3) GroEL revelou que a proteína está em maior proporção na fração insolúvel, por isso, foi necessário estabelecer um protocolo de recuperação seguido de um reenovelamento in vitro. Dados de ensaios enzimáticos e dicroísmo circular revelaram o sucesso do protocolo de recuperação/reenovelamento, o que poderá no futuro contribuir para a busca de inibidores específicos. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Naegleria gruberi catalisa a sexta etapa da via glicolítica do organismo. A enzima NgGAPDH foi expressa em E. coli (DE3) usando-se o vetor pET-15b e então purificada em três passos de cromatografia, dois por afinidade a níquel e um por exclusão por tamanho. A caracterização enzimática foi realizada com a enzima sem a ―his-tag‖; a NgGAPDH apresentou maior atividade em pH 8,0, 25 °C e 10 mM de arsenato, e cooperatividade positiva frente aos substratos G3P e NAD+. Cristais de NgGAPDH sem a ―his-tag‖ apareceram em 3 dias após montagem das gotas e o melhor difratou a 1,94 A de resolução, pertencendo ao grupo espacial P21 com parâmetros de cela a = 83,74 Å, b = 94,55 A, c = 90,93 A e = 99,96 °. A estrutura final refinada apresenta R = 0,1652 e Rfree = 0,2029. O domínio catalítico formado pelos resíduos 134 a 313 é altamente conservado, como esperado, com exceção da Asn145, presente somente em NgGAPDH, enquanto que as demais GAPDHs apresentam Ser ou Thr na posição correspondente. Análises por dinâmica molecular revelaram que a Asn145 tem correlação de movimento com os resíduos Ala123, Thr125 e Pro126, pertencentes ao que se chamou de ―bonded loop‖. Ressalte-se que esta é a primeira GAPDH do filo Percolozoa que tem sua estrutura tridimensional determinada e parâmetros cinéticos estabelecidos, tal que se espera contribuir para o entendimento da evolução dessa classe de proteínas.

We have investigated genetic variation in microRNA-mediated regulation as a susceptibility factor for anxiety disorders following two different approaches. We first studied two isoforms of the candidate gene NTRK3 by re-sequencing its different 3'UTRs in patients with Panic (PD) and Obsessive Compulsive disorders (OCD) as well as controls. Two rare variants that altered microRNA-mediated regulation were identified in PD. Conversely, association of a common SNP with OCD hoarding subtype was found. Moreover, we have also studied a possible involvement of microRNAs in anxiety disorders. Consequently, we have analysed the genomic organisation and genetic variation of miRNA-containing regions to construct a panel of SNPs for association analysis. Case-control studies revealed several associations. However, it is worth remarking the associations of miR-22 and miR-488 with PD; two microRNAs for which functional assays and transcriptome analysis after microRNA overexpression showed significant repression of a subset of genes involved in physiological pathways linked to PD development. / Hem investigat la variació genètica a la regulació mediada per microRNAs com a factors de susceptibilitat pels trastorns d'ansietat seguint dues aproximacions diferents. Primer vam estudiar dues isoformes del gen candidat NTRK3 mitjançant la reseqüenciació dels seus diferents 3'UTRs a pacients de pànic (TP), a pacients amb trastorn obsessiu compulsiu (TOC) i a controls. Dues variants rares que alteren la regulació mediada per microRNAs foren identificades per TP. D'altra banda, es trobà associació d'un SNP comú amb el subtipus acumulador de TOC. A més, també hem estudiat la possible implicació dels microRNAs als trastorns d'ansietat. Conseqüentment, hem analitzat l'organització genòmica i la variació genètica a regions que contenen microRNAs per construir un panell d'SNPs per fer anàlisis d'associació. Els estudis cas-control van revelar algunes associacions. Tanmateix, val la pena destacar les associacions del miR-22 i el miR-488 amb TP; dos microRNAs pels quals assajos funcionals i anàlisis de transcriptoma després de la seva sobreexpressió han mostrat una repressió significativa d'un grup de gens implicats en vies fisiològiques lligades al desenvolupament del TP.