Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus einzelligen Grünalgen, die in der Optogenetik verwendet werden. Photonabsorption führt zur Isomerisierung des Retinal-Kofaktors, was eine Reihe von Reaktionen auslöst, die als Photozyklus bezeichnet werden und die Bildung des leitenden Zustands umfassen. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus-Mechanismus ausgewählter ChRs mittels FTIR (Fourier Transform Infrarot)- und UV-Vis-Spektroskopie, sowie Retinalextraktion und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analyse untersucht. Photorezeptoren sind dafür optimiert, Lichtenergie zu nutzen, um Konformationsänderungen des Proteins hervorzurufen. Dafür wird ein Teil der Lichtenergie durch eine transiente Verdrillung des Chromophors gespeichert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Transfer der gespeicherten Energie zum Protein in ReaChR stark vom Protonierungszustand von Glu163 beeinflusst wird; er wird durch eine erhöhte Rigidität des aktiven Zentrums bei protoniertem Glu163 verlangsamt. In Chrimson hingegen relaxiert der Chromophor nach Photoisomerisierung, was auf einen verdrillten Chromophor im Dunkelzustand hinweist, was vermutlich für die bathochrome Verschiebung von Bedeutung ist. Zusätzlich zur Chromophorgeometrie beeinflusst der Protonierungszustand von Glu163 in ReaChR und dem homologen Glu165 in Chrimson die Stereoselektivität der Photoreaktion. Ein weiterer Faktor der Stereoselektivität ist Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2), welches im Photozyklus deprotoniert. Die Bildung des leitenden Zustands in C1C2 und ReaChR geht mit einem Wassereinstrom ins Protein einher, welcher den Transport größerer Kationen erleichtert. Die Deprotonierung von Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) verändert die Ionenselektivität des Kanals, wie aus elektrophysiologischen Messungen bekannt ist. In Chrimson ist das Ausmaß des Wassereinstroms deutlich reduziert, was – in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Experimenten – den Transport von Protonen begünstigt. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels found in single-cell algae and used in optogenetics. Photon absorption leads to isomerization of the retinal cofactor, initiating a number of reactions that are referred to as photocycle and involve formation of the ion-conducting state. In this thesis, the photocycle mechanism of selected ChRs was investigated using FTIR (Fourier Transform Infrared) and UV-Vis spectroscopy, as well as retinal extraction and subsequent HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis. Photoreceptors are optimized to use photon energy to drive conformational changes of the protein. Therefore, a fraction of the photon energy is stored by a transient distortion of the chromophore. In this thesis, it is shown that in ReaChR the transfer of the stored energy to the protein is largely affected by the protonation state of Glu163, being decelerated by protonated Glu163 due to an enhanced rigidity of the active site. In contrast, the chromophore in Chrimson relaxes upon photoisomerization, hinting at a distorted retinal geometry in the dark state, which is probably essential for its unprecedented bathochromic absorption. In addition to the chromophore geometry, the protonation state of Glu163 in ReaChR and the homologue Glu165 in Chrimson affects the stereoselectivity of the photoreaction. Another factor for stereoselectivity is Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2) which deprotonates in the photocycle. Formation of the ion-conducting state in C1C2 and ReaChR involves water influx into the protein, facilitating transport of larger cations. Deprotonation of Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) alters the ion selectivity of the channel as known from electrophysiological experiments. In Chrimson, the extent of water influx is drastically reduced which favors the conductance of protons in agreement with electrophysiological characterization.

Die Entdeckung der Kanalrhodopsine (ChRs) C1 und C2 aus der Grünalge Chlamydomonas reinhartii vor 10 Jahren brachte die neue Proteinfamilie der lichtgesteuerten Ionenkanäle hervor. Diese 7-Transmembranproteine verwenden all-trans Retinal, um Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren. Bei Lichtabsorption isomerisiert das Retinal und das Protein öffnet daraufhin seine Pore, die es Ionen wie H+, Na+ und Ca2+ erlaubt, abhängig von ihrem elektrochemischen Gradienten, die Membran zu passieren. Insbesondere in der Neurophysiologie findet seit kurzem das C2 eine breite Anwendung, da seine Expression in Nervenzellen es erlaubt, mittels kurzer Lichtpulse die elektrische Aktivität dieser Zellen zu kontrollieren. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die beiden neuen ChRs V1 und V2 aus der mehrzelligen Grünalge Volvox carteri elektrophysiologisch charakterisiert. Hierbei zeigte sich, dass V2, ähnlich wie C2, im blauen Spektralbereich absorbiert und auch, dass sich die kinetischen Eigenschaften stark ähneln. Dagegen besitzt V1 eine um 70 nm längerwellig verschobene Absorption auf 535 nm bei einer ~ 10 x langsameren Abklingkinetik als C2. Durch die schlechte Membranintegration von V1 in eukaryotischen Zellen ist der Photostrom gering und die Anwendungen in Neuronen stark eingeschränkt. Um die Membranintegration zu verbessern, wurden einzelne Helices von V1 gegen die entsprechenden Helices der anderen ChRs ausgetauscht. Hierbei wurde eine Chimäre C1V1-25, die aus den ersten 2 Helices von C1 und den restlichen 5 Helices von V1 besteht, entwickelt. Die Chimäre besitzt weiterhin eine rotverschobene Absorption bei 539 nm, einen 4 x höheren Photostrom als V1 und der doppelt so hoch ist wie der von C2. / The discovery of the channelrhodopsins (ChRs), C1 and C2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii 10 years ago, created the new protein family of light-gated ion channels. Those 7-Transmembranproteins are utilizing all-trans retinal to absorb light at specific wavelength. Upon light absorption the retinal isomerizes which leads to opening of a protein pore allowing ions such as H+, Na+ and Ca2+ to pass the membrane depending on their electrochemical gradient. In the last years C2 attracted a lot of attention in neuroscience since its expression in neurons allows to control their electrical properties with short light pulses. This work presents the electrophysiological characterization of two new ChRs V1 and V2 from the multicellular agla Volvox carteri for the first time . V2 absorbs light in the blue visible range like C2 and almost identical kinetic properties. In contrast, V1 exhibit a 70 nm redshifted absorption towards 535 nm and a ~ 10 x slower off-kinetic than C2. Since V1 displays only weak membrane targeting the resulting overall small photocurrent in eukaryotic cells significantly hampered its application in neuronal cells. To improve membrane targeting and to retain redshifted absorbance helices from V1 were exchanged with the corresponding helices from the other ChRs. A chimera called C1V1-25, which consists out of the first 2 helices from C1 and the last 5 helices from V1 showed a absorbance maximum at 539 nm and exhibit a 4 times higher photocurrent even beeing 2 times higher then the one of C2.

Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Membranproteine und agieren als Sensoren, Biokatalysatoren oder Ionentransporter. Die Ionentransporter unterteilen sich in lichtgetriebene Ionenpumpen und in lichtaktivierte Kanalrhodopsine. Besonders die Protonenpumpe Bakteriorhodopsin steht schon lange im Fokus biophysikalischer Untersuchungen. Obwohl die Protonenpumpen seit über 40 Jahren intensiv untersucht werden, ist das Wissen über deren elektrophysiologische Eigenschaften noch immer gering. Aus diesem Grund widmete sich diese Arbeit der elektrophysiologischen Charakterisierung der mikrobiellen Rhodopsine mit dem Fokus auf Protonenpumpen. Hierfür wurden vor allem „Two-Electrode Voltage Clamp“ -Messungen (TEVC) an Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus leavis durchgeführt. Die Untersuchung verschiedener Protonenpumpen hat gezeigt, dass diese eine unerwartet große Diversität in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften aufweisen. Von besonderem Interesse war die Beobachtung, dass einige Protonenpumpen neben Pumpströmen auch passive einwärts gerichtete Photoströme zeigten. Besonders deutlich war der „Pump-Kanal-Dualismus“ bei dem Gloeobacter-Rhodopsin ausgeprägt. Andere Protonenpumpen, wie das Bakteriorhodopsin oder Coccomyxa-Rhodopsin, zeigten keine einwärts gerichteten Photoströme. Das Coccomyxa-Rhodopsin wurde aufgrund seiner hohen Photostrom-Amplituden in Oozyten für eine Mutationsanalyse ausgewählt. Diese Mutationsanalyse verhalf die strukturellen Ursachen für die funktionalen Unterschiede zu identifizieren, welche sowohl zwischen den Protonenpumpen untereinander als auch gegenüber Kanalrhodopsinen beobachtet wurden. Mutationen im Gegenion-Komplex führen zu rein passiven oder inaktiven Transportern. Dagegen übernimmt der extrazelluläre Halbkanal in Protonenpumpe die Aufgabe einen passiven Protonen-Rückfluss während des Pumpzyklus zu verhindern, denn Mutationen in dieser Region verursachen passive Photoströme zusätzlich zum aktiven Pumpstrom. / Microbial rhodopsins are light-sensitive membrane proteins and operate as sensors, enzymes or ion-transporters. The ion transporters are subdivided into light-driven ion pumps and light-gated channels. Biophysical research has put focus on the proton pump bacteriorhodopsin for long time. Despite the fact that light-driven proton pumps are investigated for over 40 years, the knowledge about their electrophysiological properties is surprisingly low. For this reason, this thesis is devoted to the electrophysiological characterization of microbial rhodopsins with special focus on light-driven proton pumps. For this purpose, “Two-Electrode Voltage Clamp”-recordings (TEVC) were primarily performed using oocytes from African clawed frog Xenopus leavis. The investigation of diverse proton pumps has shown that the differences in their electrophysiological behaviors are unexpectedly high. Special interest was laid on proton pumps which show passive inward directed photocurrents when the electrochemical load exceeds a certain level. The dualism of pump and channel activity was particularly pronounced in the proton pump Gloeobacter-rhodopsin. Other proton pumps, for instance bacteriorhodopsin or Coccomyxa-rhodopsin, do not show inward directed photocurrents. Due to high photocurrent amplitudes, the Coccomyxa-rhodopsin was selected for an efficient mutagenesis study. This study allowed the identification of structural key determinants for the differences among proton pumps themselves and for the differences of proton pumps in comparison with light-gated ion channels (channelrhodopsins). Therefore, mutations of the counter-ion-complex cause inactive or purely passive transporters. The extracellular half-channel is the key element in proton pumps which prevents passive proton-backflow during the pump-cycle. Mutations in this region lead to passive leak-currents in overlap with the remaining pump-activity.