Introduction: L’activation des cellules stellaires hépatiques (CSHs) est un point clé du processus de fibrose hépatique. Les lymphocytes T CD4+ intra-hépatiques sont une source majeure de cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10 et pro-inflammatoire (IL-17A), hépatoprotectrice (IL-22) produites par les Th17. Les Th17 sont impliqués dans de nombreuses pathologies inflammatoires mais l’effet de ces cellules sur les CSHs n’est pas encore élucidé. Objectif: Comprendre le rôle des cytokines de type Th17 dans le processus d’activation des CSHs. Méthodes: La lignée de CSHs humaine LX2 a été stimulée par l’IL-17A ou l’IL-22 puis comparée à des cellules traitées par le TGF-b et le tampon phosphate salin (PBS). L’activation des CSHs a été évaluée en examinant les molécules profibrotique alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagène de type I (COL1A1) et inhibiteur produits par les tissus des métalloprotéases matricielles I (TIMP-I) par q-PCR. L’expression protéique a été validée par immunobuvardage ou coloration au rouge de picro Sirius. L’expression membranaire de l’IL-10Rb, du TGF-b-RII et de l’IL-17RA a été mesurée par cytométrie en flux. Résultats: L’IL-17A et l’IL-22 n’activent pas les cellules LX2, car aucune induction d’a-SMA, de COL1A1 et de TIMP-I n’a été observée. Cependant, l’IL-17A et l’IL-22 sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b, tel que démontré par une forte expression et production d’a-SMA, collagène type I et TIMP-I. L’IL-17A, mais pas l’IL-22, induit la surexpression à la surface cellulaire du TGF-b-RII et inhibe partiellement la baisse d’expression du TGF--RII après stimulation au TGF-b. Conclusion: Nos résultats démontrent une fonction pro-fibrotique de l’IL-17A et de l’IL-22, car les deux cytokines sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b. L’IL-17A agit via la surexpression et la stabilisation du TGF-b-RII tandis que l’IL-22 agit probablement par des mécanismes intracellulaires. / Background: Activated hepatic stellate cells (HSCs) are key initiators of the fibrogenic process. Intrahepatic CD4+ T cells are major producers of hepatoprotective cytokines such as IL-10 produced by regulatory T cells (Tregs) or inflammatory and regulatory cytokines like IL-17 and IL-22 produced by Th17 cells. Th17 cells have been implicated in various conditions or liver damage but the mechanism of action of Th17 cytokines on HSC is still poorly understood. Aims: To understand the role of the different Th17 cytokines (IL17-A and IL-22) in modulating HSC activation. Methods: The HSC line LX2 was stimulated with increasing doses of IL-17A or IL-22, and compared to TGF-b and PBS-treated cells. Activation of HSCs was evaluated by examining the expression of the pro-fibrotic molecules alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagen type I (COL1A1) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase I (TIMP-I) by q-PCR. Protein expression was validated by either western blot or picro Sirius red stain. Cell surface expression of the cytokine receptors IL-10Rb, TGF-b-RII and IL-17RA was evaluated by flow cytometry. Results: IL-17A and IL-22 alone did not induce LX2 activation, as no induction of a-SMA, COL1A1 and TIMP-I was observed. However, both IL-17A and IL-22 sensitized HSCs to the action of suboptimal doses of TGF-b, confirmed by strong a-SMA, collagen type I and TIMP-I gene expression and protein production. IL-17A but not IL-22 upregulated TGF-b-RII cell surface expression and partially inhibited TGF-b-RII downmodulation upon TGF-b stimulation. Conclusion: Our results demonstrated a pro-fibrotic function for IL-17A and IL-22, as both cytokines sensitize HSC to the action of TGF-b. IL-17A acts through upregulation and stabilization of the TGF-b-RII while IL-22 probably acts through an intracellular mechanism.

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L'infection au virus de l'hépatite B (VHB) est étroitement liée au métabolisme énergétique hépatique. La réplication du virus est contrôlée en principal par des facteurs de transcription et récepteurs nucléaires tels que PPARa, HNF4a et Foxül, impliqués dans ce métabolisme. Ainsi, la réplication du virus est augmentée par la privation de nutriments et le stress énergétique en modèles cellulaires, et par le jeûne, en modèles murins. PGC-la, un régulateur majeur de la réponse métabolique adaptative au jeûne, est impliqué dans l'augmentation de la transcription du VHB par son interaction avec plusieurs facteurs de transcription. Il est connu que le récepteur des acides biliaires, FXRa, qui est capable d'activer le promoteur de Core du VHB, est co-activaté par PGC-la. Un autre acteur important dans l'adaptation métabolique à la privation d'énergie est la protéine déacétylase SIRTl. Lorsqu'il est activé, SIRTl hépatique est capable de désacétyler et activer autant PGC-la que FXRa. Ces données nous ont amenés à émettre l'hypothèse que SIRTl pourrait coopérer avec FXRa et PGC-la pour augmenter la transcription du VHB. Dans un premier travail, nous avons donc étudié le rôle de la coopération de ces trois facteurs métaboliques dans la réplication du virus. Ça nous a permis de décrire un nouveau réseau métabolique, composé de FXRa, PGC-la et SIRTl, qui régule l'activité transcriptionnelle du VHB. Nous avons montré que SIRTl augmente l'activité du promoteur de Core par l'intermède d'autre facteurs, parmi lesquels, FXRa. Nous avons en outre observé que la fonction de déacétylase de SIRTl était nécessaire pour l'amplification de l'effet de FXRa sur VHB promoteur de Core. Une autre cible de SIRTl, connue pour son activité co-activatrice sur FXRa, est PGC-la. Grâce à une série d'expériences de surexpression et suppression, nous avons montré que non seulement la co-activation de FXRa par PGC-la est potentialisée par SIRTl, mais la présence de PGC-la est nécessaire pour l'effet de SIRTl sur l'activation du promoteur de Core VHB induite par FXRa. Ces données suggèrent que FXRa, PGC-la et SIRTl coopèrent dans la modulation de l'activité transcriptionnelle du promoteur de Core. Nous avons ensuite confirmé nos observations initiales et avons montré que l'activation de l'axe SIRTl/PGC-la/FXRa induit la transcription de l'ARN de VHB dans des lignées cellulaires d'origine hépatique et non-hépatique. Ces résultats renforcent l'idée que la réplication du VHB peut être modulée en fonction de l'état nutritionnel. Les rapports des études précédentes menées in vitro et sur des modèles animaux suggèrent que la transcription du VHB est contrôlée de la même manière que les gènes de la néoglucogenèse. Notre hypothèse a été que chez l'homme, la réplication du VHB montrerait des fluctuations diurnes, selon les périodes de la journée de jeûne et de réalimentation. Le but de la deuxième étude a été donc de déterminer si la charge viral du VHB plasmatique montre des variations importantes tout au long du nichthemeron chez les patients chroniquement infectés par VHB, avec une réplication virale active [etc...] / Hepatitis B virus (HBV) infection is tightly linked with hepatic fuel metabolism. HBV replication depends on the activity of several liver-enriched nuclear receptors and transcription factors, such as PPARa, HNF4a, and Fox01, involved in the metabolic adaptive response to fasting. In the first part of our work, we identified a metabolic subnetwork that enhances the activity of HBV core promoter. FXRa (NR1H4), PPAR gamma coactivator 1a and SIRT1, the members of this regulatory axis, cooperate to increase HBV transcription. The three molecules are themselves key factors of liver metabolism, linking HBV replication to complex metabolic cues, such as energy status and nutrient availability during the fasting-refeeding cycles. We then observed the existence of a circadian cycle of HBV replication in humans, underlining the role of nutrient availability in the modulation of HBV replication, previously predicted by experimental models. The second part of the work focused on the plasma cell-free nucleic acids as potential biomarkers in chronic viral hepatitis. Due to the multiple links between HBV replication and cellular factors involved in fuel metabolism, we hypothesized that plasma mRNAs corresponding to these factors may constitute potential biomarkers for chronic hepatitis B. We successfully detected more than 30 plasma mRNA sequences corresponding to enzymes, transporters, nuclear receptors and transcription factors involved in fatty acids synthesis and oxidation, cholesterol synthesis, transport and excretion, and energy sensing and expenditure. The circadian variation and the multiple correlations in the expression patterns of these plasma transcripts are similar to those previously described in cells both in vitro and in vivo. This suggests that cell- free mRNAs may provide a "virtual biopsy" of the transcriptional status of the organism. Moreover, we found significant differences in the plasma mRNA profiles of HBV carriers compared with healthy controls, similar to those found in experimental models of infection, suggesting that these transcripts may also serve as biomarkers of liver disease. Further research is warranted to shed new light on the complex relationship between HBV life cycle and host lipid-carbohydrate-fuel metabolism and may lead to the identification of both actionable targets in antiviral therapy, and putative biomarkers in chronic hepatitis B

Alors que 30% du génome code pour des protéines membranaires, moins de 3% des structures protéiques dans la Protein Data Bank correspondent à ces protéines. En raison de leur nature hydrophobe, les protéines membranaires sont en effet très difficiles à produire dans des systèmes d'expression classique en cellules, notamment en bactéries. L'étude structurale des protéines membranaires du virus de l'hépatite C (VHC) sous forme entière et native a donc été pendant longtemps entravée. Le VHC est un virus à ARN positif dont le complexe de réplication est basé sur un réarrangement spécifique des membranes induit par l'action concertée de plusieurs protéines non structurales du virus dont NS2, NS4B et NS5A. La structure tridimensionnelle et le rôle de ces protéines dans la réplication virale sont encore mal connus. Pour surmonter les limitations qui empêchent leurs études structurales et fonctionnelles, un système d'expression acellulaire à base d'extrait de germe de blé a été développé avec succès, permettant la production des protéines NS2, NS4B et NS5A entières directement sous une forme solubilisée en présence de détergent. Ces protéines membranaires sont produites et purifiées par chromatographie d'affinité dans des quantités de l'ordre du milligramme. Des analyses par filtration sur gel indiquent que les échantillons obtenus sont homogènes. De plus, des analyses structurales par dichroïsme circulaire montrent que les protéines produites dans ce système sont bien repliées. Leur reconstitution dans des lipides est en cours d'optimisation. Le but ultime est en effet de déterminer leur structure par RMN du solide dans un environnement lipidique mimant l'environnement natif / While 30% of the genome encodes for membrane proteins, less than 3% of protein structures in the Protein Data Bank correspond to such proteins. Due to their hydrophobic nature, membrane proteins are indeed notoriously difficult to express in classical cell-based protein expression systems. The structural study of the membrane proteins of hepatitis C virus (HCV) in their full-length and native form has therefore been for long time hampered. HCV is a positive-strand RNA virus building its replication complex on a specific membrane rearrangement (membranous web), which serves as a scaffold for the HCV replicase, and is induced by the concerted action of several HCV non-structural proteins including NS2, NS4B and NSSA. The knowledge of the three- dimensional structure of these proteins and their role in virus replication is still limited. To overcome the limitations that prevent the structural and functional studies of these proteins, a wheat germ cell-free protein expression system has been developed. A production protocol was designed which allows us to directly obtain membrane proteins in a soluble form by adding detergent during the in vitro protein synthesis. A large number of mainly viral proteins were successfully expressed, and full protocols were developed for the full-length NS2, NS4B and NSSA proteins. These membrane proteins were produced and purified by affinity chromatography using a Strep-tag II in the milligram range. These protein samples are homogenous, as shown by gel filtration analysis. Moreover, structural analyses by circular dichroism showed that the proteins produced in the wheat germ cell-free system are well folded. Reconstitution of these proteins in lipids is currently under optimization. The ultimate goal is to determine their structure by solid-state NMR in a native-like membrane lipids environment

Dans le monde, 58 millions de personnes sont chroniquement infectées par le virus de l'hépatite C (VHC). Depuis 2011, l'introduction des antiviraux à action directe a permis la guérison des infections chroniques chez la majorité des sujets traités (~95 %). Toutefois, les traitements sont coûteux et ne protègent pas contre les réinfections, d'où la nécessité de développer un vaccin prophylactique pour freiner efficacement l'épidémie du VHC. Environ 30% des primo-infections sont éliminées spontanément, représentant une occasion unique d'étudier les corrélats de l’immunité protectrice nécessaires pour le développement d’un vaccin efficace. Dans cette thèse, nous avons procédé à la définition des corrélats de l'immunité protectrice au cours des infections par le VHC primaires et subséquentes aux niveaux transcriptomique, clonotypique et fonctionnel à partir d’une cohorte d’utilisateurs de drogues par injection. Le premier objectif était de caractériser le répertoire de récepteurs des cellules T CD8 spécifique de l'épitope immunodominant et cross-réactif NS3 1073-1081 (CINGVCWTV) restreint par HLA-A2 au cours d’une primo-infection aiguë progressant vers une résolution spontanée ou une infection chronique. Nous avons identifié un ensemble de treize clonotypes publics, indépendamment de l'issue de l'infection. Plusieurs clonotypes publics avaient une longue durée de vie après résolution de l’infection et ont proliféré après réinfection par le VHC. En explorant les bases de données publiques, nous avons identifié plusieurs clonotypes partagés avec d'autres épitopes viraux restreints par HLA-A2, mais ils étaient de faible fréquence et de réactivité croisée limitée, suggérant un rôle limité des lymphocytes T CD8 cross-réactifs au cours de l'infection primaire par le VHC. Le deuxième objectif était de caractériser les signatures transcriptomiques longitudinales des cellules mononucléaires du sang périphérique totaux chez huit sujets ayant spontanément résolu deux infections consécutives par le VHC. Nous avons également comparé ces signatures avec un schéma vaccinal composé d'un vecteur à adénovirus de chimpanzé suivi d'un rappel utilisant la vaccine modifiée Ankara, exprimant tout deux les protéines non-structurales du VHC. Nous avons identifié une signature transcriptomique des plasmocytes au cours d'une réinfection aiguë, absente lors de l'infection primaire et après le rappel du vaccin. La résolution spontanée est associée à une expansion rapide des cellules B mémoires spécifiques de la glycoprotéine E2 chez 3 sujets et à une augmentation transitoire des anticorps neutralisants anti- E2 chez 6 sujets. Parallèlement, il y avait une augmentation de l'étendue et de l'ampleur des lymphocytes T spécifiques du VHC chez 7 sujets. En conclusion, nous avons identifié treize clonotypes publics uniques au VHC qui ont proliféré au cours des infections primaire et secondaire. La faible fréquence des clonotypes cross-réactifs suggère qu'ils ne sont pas des déterminants majeurs de l’issue de l’infection. De plus, nous avons observé une augmentation simultanée des réponses des lymphocytes B et T spécifiques du VHC au stade aiguë précoce, suggérant un rôle des deux bras de l’immunité adaptative dans la clairance de la réinfection du VHC. Nos résultats soutiennent l'idée de combiner deux stratégies vaccinales induisant à la fois une immunité à médiation cellulaire et une immunité humorale visant à prévenir les infections chroniques par le VHC. / Worldwide, 58 million individuals are chronically infected with hepatitis C virus (HCV). Since 2011, the introduction of direct acting antivirals enabled the cure of chronic HCV in the majority of treated subjects (~95%). However, direct-acting antivirals treatments are expensive and do not protect against reinfection, urging the need to develop a prophylactic vaccine to efficiently curb the HCV epidemic. Around 30% of acutely infected individuals will spontaneously clear the infection, representing a unique opportunity to study the correlates of immune protection needed to develop a potent vaccine. In this thesis, we proceeded to define the correlates of protective immunity during primary and sub-sequent HCV infections at the transcriptomic, clonotypic and functional levels using longitudinal peripheral blood mononuclear cells samples collected from a cohort of people who inject drugs (PWID). The first aim was to characterize the CD8 T cell receptor repertoire specific to the immunodominant and cross-reactive HLA-A2 restricted NS3 1073-1081 (CINGVCWTV) epitope during acute HCV in PWID progressing to either spontaneous resolution or chronic infection. We identified a set of thirteen public clonotypes in HCV-infected subjects irrespective of infection outcome. Several public clonotypes were long-lived in resolvers and expanded upon reinfection. By mining publicly available data, we identified several TCR clonotypes shared with other HLA-A2 restricted epitopes, but they were of low frequency and limited cross-reactivity, suggesting that they are not major determinants of infectious outcome. The second aim was to characterize longitudinal transcriptomic signatures using total peripheral blood mononuclear cells, as well as T and B cell recall responses in eight subjects who spontaneously resolved two successive episodes of HCV infection. Furthermore, we compared the transcriptomic signatures of primary and secondary resolving HCV infections, with an HCV nonstructural protein vaccine regimen of recombinant chimpanzee adenovirus 3 vector prime followed by modified vaccinia Ankara boost. We identified a plasma cell transcriptomic signature during early acute HCV reinfection that was absent in primary infection and following HCV vaccine boost. Spontaneous resolution of HCV reinfection was associated with rapid expansion of glycoprotein E2-specifc memory B cells in 3 subjects and transient increase in E2-specific neutralizing antibodies in 6 subjects. Concurrently, there was an increase in the breadth and magnitude of HCV-specific T cells in 7 subjects. In conclusion, we identified thirteen new public CD8+ TCR clonotypes unique to HCV that expanded during acute infection and reinfection. The low frequency of crossreactive TCRs suggests that they are not major determinants of infectious outcome. Moreover, we observed a concurrent increase of HCV-specific B and T cell responses early during acute HCV reinfection at the transcriptomic and functional levels, suggesting a role for both arms of the adaptive immune response in HCV reinfection clearance. Our results support the combined T and B cell-based vaccine strategy aimed at preventing chronic HCV infections.

Alors que le contentieux des produits de santé n'a jamais été aussi fourni, l'application du régime spécial de responsabilité du fait des produits défectueux issu de la directive européenne du 25 juillet 1985, entraîne l'émergence d'un certain nombre d'incertitudes qui affectent directement le sort des demandes en réparation. Les incertitudes matérielles ont, pour la plupart reçu un traitement efficace par l'action conjuguée de la jurisprudence et du législateur. Si les outils juridiques traditionnels, tels que les présomptions ou la causalité alternative, ont permis de résoudre une partie non négligeable de ces incertitudes, les juges se sont également attachés à développer des outils nouveaux comme la balance bénéfice/risque ou encore la répartition de l'obligation à la dette selon les parts de marché. Cependant, si le développement de ces outils juridiques, plus adaptés aux spécificités des produits de santé, a permis d'apporter une solution efficace aux incertitudes matérielles, le traitement de l'incertitude scientifique, fondé sur les présomptions du fait de l'homme, n'apporte, toujours pas, de solutions satisfaisantes. L'étude du traitement des incertitudes dans le contentieux des produits de santé défectueux permet d'apprécier les acquis mais également les limites atteintes par l'utilisation de certains outils mis à la disposition des juges et qui se révèlent parfois inadaptés. L'intervention du législateur et la prise en compte des spécificités des produits de santé, permettraient de développer un système d'indemnisation adapté qui interviendrait de façon subsidiaire en cas d'échec de la voie contentieuse. / At a time when healthcare-product litigation is attaining record heights, the implementation into French law of the special liability regime for defective products, which derives from the European Council Directive of 25 July 1985, has led to the emergence of several grey areas of uncertainty which have a direct impact on the outcome of claims for compensation. Areas of material uncertainty have, for the most part, been effectively dealt with through the combined application of case law and the intervention of the legislator. While classic legal tools such as presumption and alternative causality provide a means to resolve a non-negligible part of these uncertainties, judges have also endeavoured to develop new tools, such as risk/utility test and market-share liability. Still, although the development of these legal tools - better suited as they are to the specific features of healthcare products - provide an effective solution to resolving areas of material uncertainty, the treatment of scientific uncertainty, which is based on presumptions of fact, does not always provide satisfactory solutions. The study of the legal treatment of uncertainty in healthcare-product litigation provides a means to assess the benefits but also the limitations of certain tools that are now available to judges but which at times prove inadequate. Intervention on the part of the legislator, while at the same time taking into account the specific features of healthcare products, could lead to the development of a suitable compensation system that could afford relief when litigation fails.