Made available in DSpace on 2015-03-26T13:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2231606 bytes, checksum: b29196071c5e84791111ab5a3acb8e50 (MD5) Previous issue date: 2007-02-27 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Ultrasound image attributes, quantified by computer-assisted analysis, are a good indication of corpora lutea (CL) physiological and functional status. However, a standard method to capture and processing images has not been established for bovine. The purposes of this research were to establish a methodology for capture, processing and computer-assisted analysis; to evaluate CL morphological and echotexture changes throughout a natural estrous cycle or a luteolysis induced estrous cycle; and to determine whether computer-assisted analysis is efficient or not for embryo recipient selection. In the first study, evaluations were made of methods to capture images, systems of capture and the minimum representative sample area. For transrectal (TR) images, the minimum established area was 0.25 cm² (4.42% of the major area). A correlation was found in mean pixel values (r = 0.9930; P<0.001) and heterogeneity (r = 0.9861; P<0.001) between images videotaped or direct digitized. In a second study, two experiments were developed: natural estrous cycle and induced luteolysis (day 10) estrous cycle. Echotexture parameters of the CL, in the expt. 1, were analyzed after data adjustment to the onset of luteolysis. In both experiments, mean pixel values did not differ throughout the days of the cycle (P>0.10) and there was no correlation between plasma progesterone and mean pixel value (r = -0.39 and r = -0.28; P>0.10). Pixel heterogeneity varied through the days in a cycle with natural luteolysis (P<0.01), but did not in a luteolysis induced cycle (P>0.10). Correlations were observed between pixel heterogeneity and plasma P4 in both of the experiments (r = - 0.69 and r = -0.48; P<0.05). In a third study, embryo recipients (n=259) were examined by transrectal ultrasonography on the embryo transfer day (ET). The same type of analysis was done to assess image attributes, as previously tested in the 1st and 2nd studies. Good quality embryos (grades 1 and 2) collected after conventional superovulatory treatment (MOET; n=94) or in vitro produced (IVP; 88) were transferred to the recipients. Pregnancy rates were 56.4% and 30.2% for MOET and IVP, respectively. Plasma progesterone concentration values were greater in the recipients later diagnosed as pregnant, than in non-pregnant (5.88±0.77 vs 3.98±0.48 ng/mL, respectively; P<0.05). There was no difference in plasma P4 between pregnant and non pregnant IVP recipients (3.97±0.57 vs 3.52±0.23; P>0.10). Corpus luteum and luteal tissue area did not differ between pregnant and non-pregnant animals. In addition, no difference in mean pixel values (71.80±1.29 vs 71.19±1.14; P>0.10; scale of 0 to 255) and heterogeneity (14.80 vs 14.52; P>0.10) was observed, between pregnant and non pregnant MOET or IVP recipients. Echotexture parameters (mean pixel value and heterogeneity) showed correlations with plasma P4 (0.17 and 0.18, respectively; P<0.01). In conclusion, differences between capture, processing and image analysis methods should be considered in luteal echotexture evaluation; if on one hand, pixel heterogeneity in ultrasound images is a strong indicative of functional status and steroidogenic capacity of luteal gland, on the other hand, mean pixel values are a poor indicator of these characteristics. Finally, in this approach computer-assisted analysis of ultrasound images was not efficient on embryo recipient selection, probably due to other variables which strongly influence overall pregnancy rate. / Atributos de imagens de ultra-som, quantificados por análise computacional, têm o potencial de indicar o status fisiológico e funcional de corpos lúteos (CL). Ainda não foi estabelecido, contudo, um padrão de captura e processamento das imagens para bovinos. Os objetivos desta pesquisa foram estabelecer uma metodologia para aquisição, processamento e análise computacional de imagens; avaliar as mudanças morfológicas e de ecotextura do CL ao longo do ciclo estral natural ou após indução da luteólise; e verificar a eficiência da técnica de análise computacional na seleção e triagem de receptoras de embrião. No primeiro estudo, foram avaliados métodos de geração de imagens, sistemas de captura e área de amostragem mínima representativa. Para imagens geradas por via transretal (TR), a área mínima estabelecida foi de 0,25 cm² (4,42% de variação em relação à maior área). Foi constatada uma correlação nos valores médios de pixel (r=0,99; P<0,001) e heterogeneidade (r=0,99; P<0,001) entre imagens gravadas em fitas VHS e com digitalização direta. No segundo estudo, foram realizados dois experimentos: avaliação do ciclo natural ou após luteólise induzida no 10º dia do ciclo. No experimento 1, os parâmetros de ecotextura do CL foram analisados após o ajuste dos dados para o momento da luteólise. Em ambos os experimentos, o valor médio dos pixels não variou em função dos dias (P>0,10) e não foi observada relação entre a concentração de progesterona [P4] plasmática e este parâmetro (r = -0,39 e r = -0,28; P>0,10). A heterogeneidade variou em função dos dias na luteólise natural (P<0,01), mas não na induzida (P>0,10). Ainda, foram observadas relações entre heterogeneidade e a [P4] plasmática nos dois experimentos (r = -0,69 e r = -0,48; P<0,05). No terceiro estudo, receptoras de embrião (n=259) foram examinadas por ultra-sonografia no dia da transferência de embriões (TE). Foi feito o mesmo tipo de análise dos atributos das imagens previamente testado nos estudos 1 e 2. Foram transferidos embriões de boa qualidade (1 e 2) obtidos por superovulação convencional (TE; n=94) ou produzidos in vitro (PIV; n=88). As taxas de gestação foram de 56,4% e 30,2% para embriões TE e PIV, respectivamente. Nas receptoras TE, os valores de [P4] plasmática foram maiores nos animais posteriormente diagnosticados como gestantes que nos não gestantes (5,88±0,77 vs 3,98±0,48 ng/mL, respectivamente; P<0,05). No entanto, nas receptoras PIV não houve diferenças entre gestantes ou não (3,97±0,57 vs 3,52±0,23; P>0,10). A área do CL e área de tecido luteal entre gestantes e não gestantes não diferiu. Não foram observadas diferenças nos valores médios (71,80±1,29 vs 71,19±1,14; P>0,10; escala de 0 a 255) e na heterogeneidade (14,80 vs 14,52; P>0,10) dos pixels, em receptoras gestantes ou não gestantes, que receberam embriões TE ou PIV. Os parâmetros de ecotextura (média dos pixels e heterogeneidade) apresentaram baixas relações com a [P4] plasmática (0,17 e 0,18; respectivamente; P<0,01). Conclui-se que as diferenças nos métodos de captura, processamento e análise de imagens devem ser consideradas quando se avalia a ecotextura luteal; a heterogeneidade, ao contrário do valor médio, de pixels em imagens ultrasonográficas é indicativo de funcionalidade e capacidade esteroidogênica da glândula luteal; e a análise computacional de imagens não foi eficiente no auxílio à seleção e triagem de receptoras de embriões, possivelmente pela forte influência que outras variáveis exercem sobre a taxa de gestação final.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-01-19. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:18Z : No. of bitstreams: 1 000870638.pdf: 975473 bytes, checksum: 098ce51567505d382abc919825c10877 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / We compared the conception rate of dairy cows (22.4 ± 5,58L) submitted to TAI, using intravaginal device with different doses of progesterone (P4). The cows were randomly implanted with a device of 1.0g (n = 43) or 1.3 g P4 (n = 48) was then given 2 mg of estradiol benzoate (EB, MI). In D3 blood was collected for analysis of P4 concentration. In D8 was removed and the implant was administered 0.15 mg of D-cloprostenol (IM). At D9, was injected 1 mg of EB (MI) and about 56 h after implant removal was performed TAI. Ambient temperature was collected in the 50 days prior to insemination. Pregnancy diagnosis was performed with ultrasound after 30 days of TAI. The pregnancy rate was 19.8%, eight cows with 1.0g and ten with 1.3 g of P4. There was no difference in pregnancy rates between P4 groups and the presence or absence of CL (2 test). The maximum ambient temperature in the 50 days before IATF was higher (ANOVA) in patients not pregnant with 1.3 g of P4 in relation to non-pregnant with 1.0g and pregnant with 1.0 or 1.3 g of P4. For each increase of 1°C in average ambient temperature of 50 days pre AI pregnancy rate decreases 42.1% (logistic regression analysis). It was concluded that further lactating cow (22L) over intravaginal P4 (1 or 1.3 g) did not change the design rate with artificial insemination protocol used under these environmental conditions

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Coorientador: Milo C. Wiltbank / Resumo: Em ruminantes a luteólise natural é caraterizada pela liberação de vários pulsos de prostaglandina F2alfa (PGF) produzidos pelo útero. A PGF é o hormônio luteolítico, enquanto a prostaglandina E1 (PGE1) é considerada um mediador luteoprotetor. Em estudos anteriores, infusões com doses baixas de PGF no útero com intervalos de 6 horas (h) resultou em regressão do corpo luteo (CL). A proposta deste experimento é desenvolver um modelo para avaliar o efeito de baixas doses de PGE1, também infundidas no lúmen uterino sobre a resposta luteal à PGF intrauterina (IU). Vacas no dia 10 do ciclo estral receberam infusões IU de salina (0,1 ml de salina + 0,1 ml de DMSO), PGE (2 mg de PGE1 em 0,1ml de DMSO) ou PGF (0,25 mg of PGF em 0,1 ml de salina) em intervalos de 6 h em um desenho experimental 2 X 2. Portanto os animais foram agrupados em quatro tratamentos: SALINA (4 infusões de salina; n=5), PGE (4 infusões de PGE1; n=5), PGF (4 infusões de PGF; n=5) e PGE+PGF (4 infusões de PGE1+PGF; n=5). As concentrações plasmáticas de progesterona (P4) foram dosadas por radioimunoensaio e o volume luteal foi determinado por ultrassonografia transretal. As concentrações circulantes de PGFM e PGEM foram dosadas antes e 10 minutos após as primeiras duas infusões. Biopsias luteais foram coletadas de cada vaca 30 minutos após cada infusão para determiner a expressão de genes em resposta a cada tratamento. As concentrações circulantes de PGFM 10 minutos após as infusões foram maiores em vacas que receb... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Atualmente, grande parte do onhecimento adquirido sobre reprodução de serpentes, advém de estudos levados a efeito na América do Norte e Europa, com animais de regiões temperadas; e, na Austrália, com Elapídeos tropicais. No presente estudo foram utilizadas dez serpentes fêmeas prenhes de Crotalus durissus (Viperidae) de região neotropical, com o objetivo de descrever e correlacionar a morfologia do corpo lúteo, placenta e estágio fetal. Com isso pode-se inferir também, o tempo de prenhez. As técnicas realizadas para essa descrição e correlação foram: biometria macroscópica das fêmeas e suas estruturas; microscopia de luz com coloração de hematoxilina-eosina e microscopia eletrônica de varredura. Foram coletados no total 124 corpos lúteos e 116 placentas, onde observou-se que a cascavel possui o corpo lúteo de caráter ovulatório e a placenta do tipo corioalantóica evolvida por uma delgada membrana da casca do ovo. Concluiu-se que o tamanho padrão da superfície dos corpos lúteos para uma prenhez normal é de 18 a 34 mm2 e que há um corpo lúteo para cada ovo, independente se está fertilizado ou atrésico, porém os ovos atrésicos não possuem placenta. Pela primeira vez foi possível visualizar a disposição estrutural dos filamentos calcários em forma de trama na membrana da casca do ovo. Foi inferida uma classificação da placenta em três estágios I, II e III de acordo com a morfologia e aumento das vilosidades apresentadas entre placenta e útero; e a partir da identificação do estágio de desenvolvimento embrionário e fetal pode-se inferir o tempo de prenhez em C. durissus, classificadas em três terços, inicial, médio e final, evidenciando que existe uma correlação entre a evolução dos estágios placentários com desenvolvimento fetal, conforme a evolução gradual da prenhêz / At de present time, great part of snake reproduction knowledge results from researches realized in North America and Europe, with temperate region animals; in Australia with tropical Elapides. At this present research, ten pregnant females of the snake Crotalus durissus (Viperidae), from Neotropical Region, were utilized. The main goal is to correlate the morphology, corpus luteum, placenta and fetal development. Then, it is also easy to deduce the pregnancy time. The techniques performed for this description and correlation were females macroscopic biometry and their structures; light microscopy with hematoxiline-eosine color and electronic scanning microscopy. 124 corpora lutea and 116 placentas were collected. In those samples could be observed that rattlesnakes have an ovulatory corpus luteum and a corioalantoic placenta wrapped by a slender membrane of the eggshell. Clearly the conclusion is that the normal standard size surface corpus luteum for a normal pregnancy is from 18 to 34mm² and that there is a corpus luteum for each egg, independently if it is fertilized or atresic; but, these atresic eggs have not placenta. For the first time it was possible to visualize the structural arrangement of the calcareous filaments in shaped frame in the eggshell membrane. It was inferred a placenta classification in three stages: I, II and III according to the morphology and increased vilosiddes presented among placenta and uterus; and, from the identification of embryonic and fetal development stage we can infer the time pregnancy in C. durissus, classified in three thirds, initial, middle and final, indicating that there is a correlation between the evolution of placental stage with fetal development, as the gradual evolution of pregnancy

O diestro é a fase luteínica na cadela caracterizada pelo aumento de progesterona (P4) sérica na primeira metade e por flutuações de 17&#946;-estradiol (E2) na segunda metade. O corpo lúteo (CL) é uma glândula endócrina temporária, que passa por um processo de desenvolvimento, manutenção e regressão, atingindo atividade secretória plena quando sua formação está completa. A insulina é o hormônio anabólico essencial para a manutenção da homeostase de glicose e do crescimento e diferenciação celular, sendo secretado pelas células &#946; pancreáticas. A sinalização intracelular da insulina começa com a sua ligação a um receptor de membrana específico, o que desencadeia uma série de ações metabólicas. Sabe-se que uma das consequências desta ligação é a translocação de transportadores de glicose 4 (GLUT4; gene SLC2A4) para que ocorra a captação de glicose. Nosso grupo demonstrou a expressão de GLUT4 no corpo lúteo de cadelas, expressão esta regulada diferencialmente ao longo do diestro. A presença deste transportador levou-nos a hipotetizar que a insulina seja importante para regulação da função luteínica. Para testar tal hipótese, utilizamos imuno-histoquímica para localizar o receptor de insulina (RI) e outros fatores regulatórios (NFKB e IL6) de GLUT4 no CL canino durante o diestro (dias 10 a >70 pós-ovulação, po) e western blotting para quantificar estas proteínas; investigamos a expressão gênica dos fatores acima mencionados por PCR em tempo real; e por fim, analisamos os efeitos da insulina sobre a expressão gênica de RI e SLC2A4 em células luteínicas nos dias 20 e 40 po e também sobre a captação de glicose destas células. No presente estudo, observou-se que o corpo lúteo canino expressa as proteínas do RI, NFKB e IL6 de maneira distinta ao longo do diestro. A expressão do RNAm do RI apresentou maior expressão nos dias 20 e 70, e diminuição no dia 40. O NFKB apresentou maior expressão no dia 40, enquanto o IL6 apresentou maior expressão do dia 10 ao 40. Observou-se correlação negativa entre o gene RI e os níveis de insulina (r = -0,69; P = 0,006) e positiva com SLC2A4 (r = 0,89; P = 0,01) em todo o diestro, enquanto o IL6 correlacionou-se de maneira positiva com o RI apenas na primeira metade (r = 0,96; P <0,0001) e o NFKB, negativamente com o RI nos dias 30, 40 e 50 (r = -0,57 P <0,05). Após a adição de insulina no meio de cultivo, observou-se que as expressões gênicas de RI e SLC2A4 se comportaram de maneira oposta de acordo com a fase do diestro estudada: células do dia 20 po apresentaram um aumento desta expressão e do dia 40 um declínio. Por fim, através da 12 captação de glicose, observou-se que as células luteínicas caninas são capazes de responder à insulina, aumentando a captação na ordem de 4 vezes (basal: 2,05 ± 0,8; insulina: 5,73 ± 0,5; valor de P <0,01 em cpm/ug proteína; basal: 79,6 ± 35,3; insulina: 212,5 ± 34,5, valor de P <0,05 em cpm/106 células). Esses resultados apontam a insulina, bem como o IL6 e o NFKB como fatores importantes que desempenham um papel na função do CL canino e trazem o CL para o grupo de tecidos que respondem ao estímulo insulínico aumentando a expressão de GLUT4 e consequentemente a captação de glicose. Além disso, estes eventos parecem sofrer controle adicional pelos hormônios esteróides. / Diestrus is the luteal phase in dogs characterized by an increase in progesterone (P4) levels in the first half and fluctuations of 17&#946;-estradiol (E2) in the second half. The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine gland, which undergoes a process of development, maintenance and regression, reaching full secretory activity when its formation is complete. Insulin is an anabolic hormone essential for the maintenance of glucose homeostasis, cell growth and differentiation, and is secreted by pancreatic beta cells. Intracellular signaling of insulin begins with its binding to a specific membrane receptor, which triggers a series of metabolic actions. It is known that one consequence of this connection is the translocation of glucose transporters 4 (GLUT4; gene SLC2A4) for glucose uptake. Our group demonstrated the expression of GLUT4 in the canine corpus luteum in a time-related manner throughout diestrus. The presence of this transporter led us to hypothesize that insulin is important for the regulation of luteal function. To test this hypothesis, we used immunohistochemistry to detect the insulin receptor (IR) and possible regulatory factors (IL6 and NFKB) of GLUT4 in canine CL during diestrus (days 10 to > 70 after ovulation, po) and western blotting to quantify these proteins. In addition, we investigated the gene expression of the above mentioned factors by real-time PCR and analyzed the effects of insulin on IR and SLC2A4 gene expression in canine luteal cells at days 20 and 40 po and also on glucose uptake by these cells. Canine CL differentialy expressed RI, NFKB and IL6 during diestrus. The IR expression was higher on days 20 and 70, with and decreased at day 40. NFKB expression was higher on day 40 and IL6 increased on days 10 to 40 po. It was observed a negative correlation between IR expression and insulin levels (r = -0.69 P = 0.006) and positive with SLC2A4 (r = 0.89, P = 0.01) throughout diestrus. IR was positively correlated with IL6 only in the first half of diestrus (r = 0.96, P <0.0001), while it was negatively correlated with NFKB on days 30, 40 and 50 (r = -0.57 P <0.05). After insulin treatment, RI and SLC2A4 expressions behave differently according to the diestrus phase: on day 20, they increased and on day 40 they declined. Finally, we could observe through glucose uptake method that canine luteal cells are able to respond to insulin stimuli, increasing glucose uptake by approximately four folds (basal: 2.05 ± 0.8; insulin: 5.73 ± 0.5 cpm / ug protein, P < 0.01; basal: 79.6 ± 35.3; insulin: 212.5 ± 34.5 cpm/106 cells, P < 0.05). These results point towards a regulatory function 14 exerted by insulin, IL6 and NFKB in the canine CL and place this organ among the insulin sensitive ones, which respond to insulin stimuli increasing GLUT4 expression and glucose uptake. Moreover, these events seems to undergo a further control by steroid hormones.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2066_1.pdf: 3090209 bytes, checksum: e0b760046ce4fa4fd2c09d83583976e3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / A fim de avaliar a repercussão da hipertensão porta nos índices de resistência arterial e na drenagem venosa ovariana e uterina, foram estudadas vinte portadoras de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica submetidas à esplenectomia e ligadura da veia gástrica esquerda (grupo I) e um grupo similar de pacientes não submetidas à cirurgia (grupo II). Os parâmetros foram comparados com vinte voluntárias sadias (grupo III). Todos os grupos foram submetidos a um exame ultra-sonográfico transvaginal com Doppler colorido pelo mesmo observador, no 22º dia do ciclo menstrual (fase lútea média). O índice de resistência de Pourcelot foi usado como referencia (RI=S-D/S). Não houve diferença significante no que diz respeito às médias dos índices de resistência arterial ovariano entre os grupos. A média dos índices de resistência da artéria uterina direita foi significantemente maior no grupo II. Observou-se também uma tendência, no que diz respeito à artéria uterina esquerda. As médias dos calibres das veias ovarianas foram significantemente maiores nos grupos com a doença esquistossomótica (operadas ou não) quando comparadas com o controle. As pacientes operadas (grupo I) tiveram as médias dos calibres das veias uterinas significantemente maiores do que os outros grupos. Índices de resistência arterial significantemente mais baixos foram observados na periferia do corpo lúteo, quando comparados com as artérias ovarianas contra laterais. A média dos calibres das veias ovarianas foi significantemente maior no lado esquerdo do grupo II. Os resultados mostram que a irrigação arterial ovariana de portadoras de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica é similar quando comparada com o grupo sadio. A hipertensão portal em portadoras de doença esquistossomótica na forma hepatoesplênica não altera o fenômeno natural do aumento de fluxo sangüíneo arterial no ovário onde ocorre a ovulação. A drenagem venosa ovariana é feita com maior dificuldade nas pacientes esquistossomóticas quando comparada com o controle. A estase venosa é significantemente maior nos ovários do lado esquerdo no grupo II. Na irrigação arterial uterina, os índices de resistência são significantemente mais altos no grupo II. Existe maior estase venosa uterina no grupo I, quando comparada com os outros grupos

Com o intuito de investigar se a hipóxia representa um dos desencadeadores da regressão luteínica em cadelas não prenhes, o presente estudo foi delineado para analisar a expressão do fator transcricional indutível por hipóxia HIF1A e a de seus genes-alvo relacionados à angiogênese, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGFA) e à captação de glicose, como as proteínas transportadoras facilitadoras GLUT1/SLC2A1 e GLUT4/SLC2A4 no corpo lúteo canino ao longo do diestro (dias 10 a 70 após a ovulação). Para tal, utilizou-se imuno-histoquímica e western blotting para localizar e quantificar as proteínas do HIF1A, GLUT1 e GLUT4 e PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNAm de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR. Além disso, células luteínicas nas fases inicial (dia 10), média (dia 30) e final (dia 60) foram submetidas ao tratamento com cloreto de cobalto (CoCl2) a 500 &micro;M para avaliar os efeitos da hipóxia sobre a expressão gênica dos fatores acima citados, bem como sobre a produção de progesterona e 17&beta;-estradiol. Nossos resultados demonstraram que o HIF1A é expresso pelo corpo lúteo canino de maneira tempo-dependente ao longo do diestro, e que a expressão de seu RNAm está diretamente correlacionada a expressão gênica de SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR e com as concentrações de progesterona periférica. No cultivo primário de células luteínicas, a hipóxia induzida pelo CoCl2 diminuiu a produção de progesterona e de 17&beta;-estradiol e estimulou significativamente a expressão de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 e VEGFA. Esses resultados sugerem que o HIF1A constitui um dos fatores regulatórios da função do corpo lúteo canino participando da modulação de processos como esteroidogêne, angiogênese e da captação de glicose, atuando como fator luteolítico. / This study was designed to investigate if hypoxia is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. For that, we analyzed the hypoxia- inducible factor (HIF1A) expression as well as the expression of its target genes related to angiogenesis (vascular endothelial growth factor VEGFA) and to glucose uptake (glucose transporters GLUT/SLC2A 1 and 4) in canine corpus luteum throughout diestrus (days 10 to 70 after ovulation). We used immunohistochemistry and western blotting to localize and quantify the protein expression of HIF1A, GLUT1 and GLUT4, respectively, and real time PCR to analyze HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression. Moreover, luteal cells from early (day 10), mid (day 30) and late luteal phase (day 60) were submitted to 500 &micro;M cobalt chloride (CoCl2) treatment to verify hypoxia effects on gene expression of the above cited genes and on progesterone and 17&beta;-estradiol production. Our results showed that luteal cells expressed HIF1A in a time-dependent manner over diestrus and that its expression was directly correlated to both SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression and progesterone production. The protein expression of the studied genes also changed over diestrus and was correlated with the respective gene expression. In primary luteal cells culture, cobalt chloride-induced hypoxia downregulated progesterone and 17&beta;-estradiol production, but upregulated HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 and VEGFA gene expression. These findings suggest that HIF1A is one of the factors regulating canine luteal function by modulating important process as steroidogenesis, angiogenesis and glucose uptake, acting as a pro-survival factor.

Grande parte das perdas embrionárias ocorrem nas três primeiras semanas após a inseminação e grande parte pode-se atribuir a baixas concentrações de progesterona. Desta maneira, o objetivo do presente experimento foi avaliar os efeitos e a interação entre o escore de condição corporal (ECC) e condição ovariana (EO) em vacas suplementadas com progesterona de longa ação (P4) após IATF sobre a taxa de prenhez em vacas de corte. Neste experimento foram utilizados 1573 vacas de corte, lactantes entre 30 e 60 dias pós-parto. As vacas tiveram a ovulação sincronizada iniciando-se no dia - 10 e foram inseminadas no dia 0. No dia 4, os animais foram blocados de acordo com ECC e EO e ordem de parto e divididos em dois tratamentos: (P4, n = 786) e (Controle, n = 787). Foram feitas avaliações ultrassonograficas dos ovários nos dias -10, 0 e 4, para mensurações de tamanho de folículo e corpo lúteo e no dia -10 foi feita a avaliação do ECC. A taxa de prenhez (P/IA) entre os grupos P4 vs CONTROLE não apresentou diferenças P=0,49. Vacas com ECC &gt; 2,75 tiveram melhora P/IA (P&lt;0,05) comparadas com vacas com ECC &le; 2,5. Vacas com presença de folículo &ge; 8 mm no dia -10 apresentou melhor P/IA (P&lt;0,05) comparadas com vacas com presença de CL ou folículo &lt; 8 mm. Vacas com folículo &ge;8 mm e CL apresentaram maior tamanho de folículo, maior área de CL, no entanto, os animais com presença de folículo &ge; 8 mm apresentaram maior taxa de concepção comparado com os animais com folículo &lt; 8 mm e com presença de CL. Concluimos que a suplementação com P4 após a IATF não melhora as taxas de prenhez, independente do ECC e do EO, no entanto, o ECC e o EO apresentam influências nas taxas de prenhez, onde os animais com melhor ECC no início do protocolo apresentaram melhor EO e maior taxa de prenhez. / Embryo loss commonly occurs in the first three weeks after insemination due to low progesterone (P4) concentrations. Therefore, this study evaluates the effects of body condition score (BCS) and ovarian condition (OC) on pregnancy rates (P/AI) in beef cows supplemented with long-acting P4 after timed artificial insemination (TAI). We used 1573 lactating Nellore cows at 30-60 days postpartum. The animals were pre-synchronized on Day -10 and inseminated on Day 0. On Day 4, they were evaluated for BCS, OC and parturition order and divided into two treatment groups: P4 supplementation (N= 786) and control group (N = 787). Ultrasound exams were performed on Days -10 and 0 to measure follicle diameter and on Day 4 to evaluate corpus luteum (CL) area. BCS was determined on Day -10. P/AI did not vary between P4 supplementation and control treatments (P = 0.49). Cows with BCS &gt; 2.75 had better P/AI than cows with BCS &le; 2.5 (P &lt; 0.05). Cows without CL and with follicle diameter &ge; 8 mm on Day -10 presented better P/AI than cows with follicle &lt; 8 mm or CL (P &lt; 0.05). In conclusion, P4 supplementation after TAI did not improve P/AI. However, BCS and OC affected P/AI and the animals with better BCS at the beginning of the experiment had better OC and P/AI.

O uso da gonadotrofina coriônica equina (eCG) tem sido considerado uma potencial ferramenta nos protocolos de estimulação e superovulação para melhorarem o desempenho reprodutivo dos rebanhos. Este fato levou a hipótese de que o tratamento com eCG altera as vias de sinalização intracelular no corpo lúteo (CL) formado. Para testá-la, 18 vacas mestiças de Nelore (Bos indicus) foram divididas em três grupos: controle, estimulado e superovulado. O protocolo de sincronização da ovulação com o uso do dispositivo de P4 foi descrito anteriormente (FÁTIMA et al., 2013). O grupo estimulado recebeu 400 UI de eCG no dia da remoção do dispositivo de P4 e o superovulado recebeu 2000 UI de eCG 4 dias antes. Os animais dos grupos controle e estimulado receberam GnRH no dia 10, enquanto os animais superovulados receberam no dia 8. No sétimo dia após após a administração do GnRH, todos os animais foram abatidos e os CL foram coletados. Foi realizada análise de microarranjo, a partir da qual foram eleitos genes envolvidos na sinalização da esteroidogênese (ADM, MMP9, NOS2), da ativação das metaloproteinases da matriz e do receptor ativado de protease que regula a homeostase e inflamação (PRSS2, PLAU) e da angiogênese (ANG e ANGPT1) e validados por qPCR, western blotting e imuno-histoquímica. A expressão gênica e proteica do PRSS2 e MMP9 foi menor e as células luteínicas grandes e pequenas positivas apresentaram marcação menos intensa nos grupos estimulado e superovulado (P <0,05). A expressão proteica da ANG foi maior no estimulado (P=0,01) e superovulado (P=0,03) e da proteína ANGPT1 foi maior no estimulado (P=0,008). O número de células luteínicas grandes e pequenas positivas para ANG e ANGPT1 foram maiores nos grupos tratados (P <0,05). No estimulado, houve correlação negativa entre os níveis de progesterona e o MMP9 (r = -0,66 e P = 0,03) e com a proteína do PRSS2 (r = -0,63 e P = 0,04). No entanto, houve correlação positiva com a proteína ANG (r = 0,69 e P = 0,03). No superovulado, houve correlação positiva entre a ANG e ANGPT1 (r = 0,96 e P = 0,001). Não houve diferença na expressão de ADM, NOS2 e PLAU nos grupos tratados em relação ao controle. Em resumo, os resultados obtidos são indicativos de que a eCG altera a expressão relativa de genes e proteínas envolvidas nas vias de sinalização de inflamação e a modelação da membrana celular com uma diminuição na expressão do MMP9 e da PRSS2 e na via da angiogênese com maior expressão de ANG em ambos os tratamentos e ANGPT1 em vacas estimuladas. / The use of equine chorionic gonadotropin (eCG) have been considered a potential tool in stimulation and superovulation protocols to improve the reproductive performance of the herd. This fact led to the hypothesis that eCG treatment alters the intracellular signaling pathways in the formed CL. To test that, 18 crossbred Nellore (Bos indicus) cows were divided into three groups: control, stimulated and superovulated. The synchronization protocol with the use of P4 device was previously described (FÁTIMA et al., 2013). The stimulated group received 400 IU eCG at the P4 device removal and superovulated received 2000 IU eCG 4 days before it. Both control and stimulated animals received GnRH on day 10, while superovulated ones received it on day 8. On the seventh day after GnRH administration, CL were collected by slaughter. Microarray analysis was preformed, from which were selected genes involved in the signaling of steroidogenesis (ADM, MMP9, NOS2), activation of matrix metalloproteinases and protease activated receptor that regulates homeostasis and inflammation (PRSS2, PLAU), and angiogenesis (ANG and ANGPT1). They were evaluated by qPCR, western blot and immunohistochemistry. The gene and protein expression of MMP9 and PRSS2 decreased and large and small luteal cells showed weaker staining in stimulated and superovulated groups related to the control group (P <0.05). ANG protein expression was higher on superovulated (P=0.01) and stimulated (P=0.03) and ANGPT1 protein was higher only in stimulated (P=0.008). The number of positive large and small luteal cells for ANG and ANGPT1 were higher in treated groups (P<0.05). In stimulated, there were a negative correlation between progesterone levels and MMP9 (r = 0.03 and P = -0.66) and the PRSS2 protein expression (r = 0.04 and P = -0.63). However, there were a positive correlation with ANG protein expression (r = 0.69 and P = 0.03). In superovulated, there were a positive correlation between ANG and ANGPT1 (r = 0.96 and P = 0.001) and PRSS2 protein expression was negatively correlated with the ANG protein (r = 0.04 and P = -0.96). There was no difference in ADM, NOS2 and PLAU expression in treated groups compared to control. In summary, these findings indicate that eCG alters the relative expression of genes and proteins involved in inflammation and cell modeling signaling pathways by decreasing MMP9 and PRSS2 expression, and on angiogenesis pathway, increasing ANG expression in both stimulated and superovulated animals and ANGPT1 in stimulated cows.

In beef cows, long-acting injectable progesterone (iP4) supplementation in the early diestrus has paradoxical effects, as it both increases fertility in the field as well as induces anticipation of luteolysis in part of the treated animals. Considering that estradiol (E2) from the ovarian follicles during the luteal phase plays a central role in the induction of uterine PGF2&#945; release and luteal regression, here we tested the central hypothesis that the absence of post-deviation follicles (i.e., a low E2 tone) delays the early onset of luteolysis and extends the estrous cycle in Bos indicus cows supplemented with iP4. This dissertation consists of two studies. A first study was carried out to validate the use of cytologic brushes (cytobrush) as a tool to collect sequential samples of endometrium to characterize temporal changes in the transcriptome along the estrous cycle. It was concluded that the cytobrush technique was confirmed as a reliable, repeatable, and safe method for studying bovine uterine biology in vivo. In the second study, cyclic Nelore cows were synchronized and distributed in a 2 x 2 factorial arrangement to receive treatment with placebo or 300 mg iP4 three days after ovulation (D0), and to be subjected or not to follicular aspiration (FA) during the luteal phase. Endometrial samples were collected on D15, D17 and D19 using the cytobrush technique, and abundance of transcripts was measured by qPCR. The iP4 decreased the size of the largest follicle on D6 and the area of the CL between D8 and 10 compared to the placebo groups. Cows submitted to FA had a longer cycle but timing of luteolysis was similar to non-FA cows. Treatment with iP4 and submitted to FA tended to advance the timing of structural luteal regression ( &le;D16). Furthermore, in the moments preceding luteolysis (D11 to D16), cows from this group that underwent luteolysis before or at D16 presented a smaller CL compared with cows of the same group that underwent luteolysis after D16. In addition, cows treated with iP4 that presented early luteolysis had a smaller CL across the luteal phase. There were no significant differences in the abundance of endometrial transcripts related to programming (PGR, ESR1) or execution (OXTR, PTGS2) of PGF2&#945; release. In summary, supplementation of P4 at early diestrus affected CL growth but did not modulate endometrial transcripts associated with luteolysis, suggesting that the uterine component might not be involved in this process. It is concluded that CLs impaired by exposure to iP4 during luteogenesis are most likely to undergo early luteal regression, and this may be exacerbated by low E2 concentrations resulting from FA. In conclusion, we rejected the hypothesis that reduced follicular E2 could prevent iP4-induced early onset of luteolysis in Bos indicus cows. / Em vacas de corte, a suplementação com progesterona injetável de longa ação (iP4) no diestro inicial tem efeitos paradoxais, uma vez que tanto aumenta a fertilidade a campo quanto induz a antecipação da luteólise em uma parte dos animais tratados. Considerando que o estradiol (E2) proveniente dos folículos ovarianos durante a fase luteal desempenha um papel central na indução da liberação de PGF2&#945; uterina e regressão luteal, testou-se a hipótese central de que a ausência de folículos pós-desvio previne a antecipação do momento da luteólise e prolonga o ciclo estral em vacas Bos indicus suplementadas com iP4. Esta dissertação consiste em dois estudos. Um primeiro estudo foi realizado para validar a utilização de escovas citológicas (cytobrush) como uma ferramenta para coletar amostras sequenciais do endométrio para caracterizar as mudanças temporais no transcriptoma ao longo do ciclo estral. Concluiuse que a técnica de cytobrush foi confirmada como um método confiável, repetível, e seguro para o estudo da biologia uterina bovina in vivo. No segundo estudo, vacas Nelore cíclicas foram sincronizadas e distribuídas em um arranjo fatorial 2 x 2 para receber tratamento com placebo ou 300 mg de iP4 três dias após a ovulação (D0), e serem submetidos ou não à aspiração folicular (AF) durante a fase lútea. Amostras endometriais foram coletadas no D15, D17 e D19 usando a técnica de cytobrush, e a abundância de transcritos foi medida por qPCR. A iP4 diminuiu o tamanho do maior folículo no D6 e a área do CL entre D8 e D10 comparado aos grupos placebo. Vacas submetidas à AF tiveram um ciclo mais longo, porém o momento da luteólise foi semelhante ao das vacas não aspiradas. O tratamento com iP4 e AF tendeu a adiantar o momento da regressão lútea estrutural (&le; D16). Além disso, nos momentos precedentes à luteólise (D11 ao D16), vacas desse grupo detectadas em luteólise antes ou no D16 apresentaram um CL menor em comparação com vacas do mesmo grupo em luteólise após o D16. Adicionalmente, vacas tratadas com iP4 com luteólise precoce apresentaram um menor CL ao longo da fase lútea. Não houve diferenças significativas na abundância de transcritos endometriais relacionados com a programação (PGR, ESR1) ou execução (OXTR, PTGS2) da liberação de PGF2&#945;. Em resumo, a suplementação com iP4 no início do diestro afetou o crescimento do CL mas não modulou os transcritos endometriais associados com a luteólise, sugerindo que o componente uterino pode não estar envolvido neste processo. Conclui-se que CLs comprometidos pela exposição à iP4 durante a luteogênese são mais susceptíveis à regredir antecipadamente, e isto pode ser exacerbado por baixas concentrações de E2 resultantes da AF. Em conclusão, rejeitamos a hipótese de que a redução do E2 folicular previne a antecipação da luteólise induzida pela iP4 em vacas Bos indicus.