O diestro é a fase luteínica na cadela caracterizada pelo aumento de progesterona (P4) sérica na primeira metade e por flutuações de 17&#946;-estradiol (E2) na segunda metade. O corpo lúteo (CL) é uma glândula endócrina temporária, que passa por um processo de desenvolvimento, manutenção e regressão, atingindo atividade secretória plena quando sua formação está completa. A insulina é o hormônio anabólico essencial para a manutenção da homeostase de glicose e do crescimento e diferenciação celular, sendo secretado pelas células &#946; pancreáticas. A sinalização intracelular da insulina começa com a sua ligação a um receptor de membrana específico, o que desencadeia uma série de ações metabólicas. Sabe-se que uma das consequências desta ligação é a translocação de transportadores de glicose 4 (GLUT4; gene SLC2A4) para que ocorra a captação de glicose. Nosso grupo demonstrou a expressão de GLUT4 no corpo lúteo de cadelas, expressão esta regulada diferencialmente ao longo do diestro. A presença deste transportador levou-nos a hipotetizar que a insulina seja importante para regulação da função luteínica. Para testar tal hipótese, utilizamos imuno-histoquímica para localizar o receptor de insulina (RI) e outros fatores regulatórios (NFKB e IL6) de GLUT4 no CL canino durante o diestro (dias 10 a >70 pós-ovulação, po) e western blotting para quantificar estas proteínas; investigamos a expressão gênica dos fatores acima mencionados por PCR em tempo real; e por fim, analisamos os efeitos da insulina sobre a expressão gênica de RI e SLC2A4 em células luteínicas nos dias 20 e 40 po e também sobre a captação de glicose destas células. No presente estudo, observou-se que o corpo lúteo canino expressa as proteínas do RI, NFKB e IL6 de maneira distinta ao longo do diestro. A expressão do RNAm do RI apresentou maior expressão nos dias 20 e 70, e diminuição no dia 40. O NFKB apresentou maior expressão no dia 40, enquanto o IL6 apresentou maior expressão do dia 10 ao 40. Observou-se correlação negativa entre o gene RI e os níveis de insulina (r = -0,69; P = 0,006) e positiva com SLC2A4 (r = 0,89; P = 0,01) em todo o diestro, enquanto o IL6 correlacionou-se de maneira positiva com o RI apenas na primeira metade (r = 0,96; P <0,0001) e o NFKB, negativamente com o RI nos dias 30, 40 e 50 (r = -0,57 P <0,05). Após a adição de insulina no meio de cultivo, observou-se que as expressões gênicas de RI e SLC2A4 se comportaram de maneira oposta de acordo com a fase do diestro estudada: células do dia 20 po apresentaram um aumento desta expressão e do dia 40 um declínio. Por fim, através da 12 captação de glicose, observou-se que as células luteínicas caninas são capazes de responder à insulina, aumentando a captação na ordem de 4 vezes (basal: 2,05 ± 0,8; insulina: 5,73 ± 0,5; valor de P <0,01 em cpm/ug proteína; basal: 79,6 ± 35,3; insulina: 212,5 ± 34,5, valor de P <0,05 em cpm/106 células). Esses resultados apontam a insulina, bem como o IL6 e o NFKB como fatores importantes que desempenham um papel na função do CL canino e trazem o CL para o grupo de tecidos que respondem ao estímulo insulínico aumentando a expressão de GLUT4 e consequentemente a captação de glicose. Além disso, estes eventos parecem sofrer controle adicional pelos hormônios esteróides. / Diestrus is the luteal phase in dogs characterized by an increase in progesterone (P4) levels in the first half and fluctuations of 17&#946;-estradiol (E2) in the second half. The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine gland, which undergoes a process of development, maintenance and regression, reaching full secretory activity when its formation is complete. Insulin is an anabolic hormone essential for the maintenance of glucose homeostasis, cell growth and differentiation, and is secreted by pancreatic beta cells. Intracellular signaling of insulin begins with its binding to a specific membrane receptor, which triggers a series of metabolic actions. It is known that one consequence of this connection is the translocation of glucose transporters 4 (GLUT4; gene SLC2A4) for glucose uptake. Our group demonstrated the expression of GLUT4 in the canine corpus luteum in a time-related manner throughout diestrus. The presence of this transporter led us to hypothesize that insulin is important for the regulation of luteal function. To test this hypothesis, we used immunohistochemistry to detect the insulin receptor (IR) and possible regulatory factors (IL6 and NFKB) of GLUT4 in canine CL during diestrus (days 10 to > 70 after ovulation, po) and western blotting to quantify these proteins. In addition, we investigated the gene expression of the above mentioned factors by real-time PCR and analyzed the effects of insulin on IR and SLC2A4 gene expression in canine luteal cells at days 20 and 40 po and also on glucose uptake by these cells. Canine CL differentialy expressed RI, NFKB and IL6 during diestrus. The IR expression was higher on days 20 and 70, with and decreased at day 40. NFKB expression was higher on day 40 and IL6 increased on days 10 to 40 po. It was observed a negative correlation between IR expression and insulin levels (r = -0.69 P = 0.006) and positive with SLC2A4 (r = 0.89, P = 0.01) throughout diestrus. IR was positively correlated with IL6 only in the first half of diestrus (r = 0.96, P <0.0001), while it was negatively correlated with NFKB on days 30, 40 and 50 (r = -0.57 P <0.05). After insulin treatment, RI and SLC2A4 expressions behave differently according to the diestrus phase: on day 20, they increased and on day 40 they declined. Finally, we could observe through glucose uptake method that canine luteal cells are able to respond to insulin stimuli, increasing glucose uptake by approximately four folds (basal: 2.05 ± 0.8; insulin: 5.73 ± 0.5 cpm / ug protein, P < 0.01; basal: 79.6 ± 35.3; insulin: 212.5 ± 34.5 cpm/106 cells, P < 0.05). These results point towards a regulatory function 14 exerted by insulin, IL6 and NFKB in the canine CL and place this organ among the insulin sensitive ones, which respond to insulin stimuli increasing GLUT4 expression and glucose uptake. Moreover, these events seems to undergo a further control by steroid hormones.

O uso da gonadotrofina coriônica equina (eCG) tem sido considerado uma potencial ferramenta nos protocolos de estimulação e superovulação para melhorarem o desempenho reprodutivo dos rebanhos. Este fato levou a hipótese de que o tratamento com eCG altera as vias de sinalização intracelular no corpo lúteo (CL) formado. Para testá-la, 18 vacas mestiças de Nelore (Bos indicus) foram divididas em três grupos: controle, estimulado e superovulado. O protocolo de sincronização da ovulação com o uso do dispositivo de P4 foi descrito anteriormente (FÁTIMA et al., 2013). O grupo estimulado recebeu 400 UI de eCG no dia da remoção do dispositivo de P4 e o superovulado recebeu 2000 UI de eCG 4 dias antes. Os animais dos grupos controle e estimulado receberam GnRH no dia 10, enquanto os animais superovulados receberam no dia 8. No sétimo dia após após a administração do GnRH, todos os animais foram abatidos e os CL foram coletados. Foi realizada análise de microarranjo, a partir da qual foram eleitos genes envolvidos na sinalização da esteroidogênese (ADM, MMP9, NOS2), da ativação das metaloproteinases da matriz e do receptor ativado de protease que regula a homeostase e inflamação (PRSS2, PLAU) e da angiogênese (ANG e ANGPT1) e validados por qPCR, western blotting e imuno-histoquímica. A expressão gênica e proteica do PRSS2 e MMP9 foi menor e as células luteínicas grandes e pequenas positivas apresentaram marcação menos intensa nos grupos estimulado e superovulado (P <0,05). A expressão proteica da ANG foi maior no estimulado (P=0,01) e superovulado (P=0,03) e da proteína ANGPT1 foi maior no estimulado (P=0,008). O número de células luteínicas grandes e pequenas positivas para ANG e ANGPT1 foram maiores nos grupos tratados (P <0,05). No estimulado, houve correlação negativa entre os níveis de progesterona e o MMP9 (r = -0,66 e P = 0,03) e com a proteína do PRSS2 (r = -0,63 e P = 0,04). No entanto, houve correlação positiva com a proteína ANG (r = 0,69 e P = 0,03). No superovulado, houve correlação positiva entre a ANG e ANGPT1 (r = 0,96 e P = 0,001). Não houve diferença na expressão de ADM, NOS2 e PLAU nos grupos tratados em relação ao controle. Em resumo, os resultados obtidos são indicativos de que a eCG altera a expressão relativa de genes e proteínas envolvidas nas vias de sinalização de inflamação e a modelação da membrana celular com uma diminuição na expressão do MMP9 e da PRSS2 e na via da angiogênese com maior expressão de ANG em ambos os tratamentos e ANGPT1 em vacas estimuladas. / The use of equine chorionic gonadotropin (eCG) have been considered a potential tool in stimulation and superovulation protocols to improve the reproductive performance of the herd. This fact led to the hypothesis that eCG treatment alters the intracellular signaling pathways in the formed CL. To test that, 18 crossbred Nellore (Bos indicus) cows were divided into three groups: control, stimulated and superovulated. The synchronization protocol with the use of P4 device was previously described (FÁTIMA et al., 2013). The stimulated group received 400 IU eCG at the P4 device removal and superovulated received 2000 IU eCG 4 days before it. Both control and stimulated animals received GnRH on day 10, while superovulated ones received it on day 8. On the seventh day after GnRH administration, CL were collected by slaughter. Microarray analysis was preformed, from which were selected genes involved in the signaling of steroidogenesis (ADM, MMP9, NOS2), activation of matrix metalloproteinases and protease activated receptor that regulates homeostasis and inflammation (PRSS2, PLAU), and angiogenesis (ANG and ANGPT1). They were evaluated by qPCR, western blot and immunohistochemistry. The gene and protein expression of MMP9 and PRSS2 decreased and large and small luteal cells showed weaker staining in stimulated and superovulated groups related to the control group (P <0.05). ANG protein expression was higher on superovulated (P=0.01) and stimulated (P=0.03) and ANGPT1 protein was higher only in stimulated (P=0.008). The number of positive large and small luteal cells for ANG and ANGPT1 were higher in treated groups (P<0.05). In stimulated, there were a negative correlation between progesterone levels and MMP9 (r = 0.03 and P = -0.66) and the PRSS2 protein expression (r = 0.04 and P = -0.63). However, there were a positive correlation with ANG protein expression (r = 0.69 and P = 0.03). In superovulated, there were a positive correlation between ANG and ANGPT1 (r = 0.96 and P = 0.001) and PRSS2 protein expression was negatively correlated with the ANG protein (r = 0.04 and P = -0.96). There was no difference in ADM, NOS2 and PLAU expression in treated groups compared to control. In summary, these findings indicate that eCG alters the relative expression of genes and proteins involved in inflammation and cell modeling signaling pathways by decreasing MMP9 and PRSS2 expression, and on angiogenesis pathway, increasing ANG expression in both stimulated and superovulated animals and ANGPT1 in stimulated cows.

O corpo lúteo (CL) canino é responsável pela síntese de E2 durante o diestro. O E2 atua de forma autócrina e/ou parácrina sobre essa glândula. O mecanismo de atuação do E2 depende da razão entre receptor alfa (ER&#945;) e receptor beta (ER&#946;). A ligação ao ER&#945; tem efeito proliferativo e ao ER&#946; antiproliferativo. O objetivo deste trabalho foi entender a sinalização mediada pelo ER&#945; e ER&#946; no processo de formação e regressão do CL. CLs foram obtidos de cadelas não prenhes (n=30) nos dias 10, 20, 30, 40, 50 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação (po). No dia da ovariossalpingohisterectomia foi colhido sangue para mensuração das concentrações de P4 e E2. Dezoito CLs (n=3/grupo) foram submetidos ao sequenciamento de RNA (RNAseq). Os genes diferencialmente expressos (DE) identificados pelo RNAseq foram submetidos ao software oPOSSUM3 para identificação das regiões de ligação mais representadas nos fatores de transcrição relacionados aos genes do ER&#945; (ESR1) e ER&#946; (ESR2). A análise de expressão temporal revelou a presença de 5.116 diferencialmente expressos (DE) em pelo menos uma comparação e 1.106 não foram anotados ainda no genoma canino, destes genes DE 295 apresentavam regiões de ligação de fatores de transcrição em comum com ESR1 e ESR2. Dez genes DE foram selecionados para validação dos resultados de RNAseq através do qPCR; usando o GAPDH como gene de referência. Desses genes, quatro apresentaram regioes em comum com ESR2 (LEF-1; PAPPA; NDGR2 ATP1A1) e um com ESR1 (CAV1) e os demais controlam proliferação celular (CTNNB1; CCND1; IGFBP 3, 4 e 5). A expressão proteíca de PAPPA e IGFBP 3, 4 e 5 (componentes do sistema IGF) foi avaliada também por imunohistoquímica. Durante a primeira metade do diestro, nossos resultados indicam que a sinalização mediada pelo E2 ocorre via interação do ER&#945; com CAV-1 (sinalização não genômica), ativando as vias de sinalização IGF e WNT/&#946;catenina, regulando o processo de proliferação celular. Enquanto na segunda metade, o ER&#946; regularia a expressão gênica de NDGR2 e ATP1A1, contribuindo para a regressão do CL. Assim nos resultados sugerem que o E2 atue tanto como um fator luteotrófico e quanto regulador da regressão do CL canino. / The canine corpus luteum (CL) is responsible for E2 synthesis during diestrus, which acts in an autocrine and / or paracrine manner in this gland. The E2 mechanism of action depends on the ratio between alpha (ER&#945;) and beta (ER&#946;) receptor The binding to ER&#945; has a proliferative effect whereas to ER&#946; an antiproliferative. The objective of this study was to understand the signaling mediated by ER&#945; and ER&#946; in the formation and regression of the CL. CLs were obtained from non-pregnant bitches (n = 30) on days 10, 20, 30, 40, 50 and 60 (n = 5 / group) post-ovulation (po). On the day of ovariohysterectomy blood was collected for measurement of P4 and E2 concentrations. Eighteen CLs (n = 3 / group) were subjected to RNA sequencing (RNA-Seq). Genes differentially expressed (DE) identified by RNA-Seq were submitted to oPOSSUM3 software for detection of over-represented transcription factors binding sites (TFBS) related to the ER&#945; (ESR1) and ER&#946; (ESR2) genes. The temporal expression analysis revealed the presence of 5116 differentially expressed (DE) genes in at least one comparison, and 1106 genes, which have not been recorded to the canine genome yet From these, 295 genes showed TFBS in common with ESR1 and ESR2. Ten DE genes were selected to validate the results of RNA-Seq by qPCR; using GAPDH as reference gene. Of these genes, four had TFBS in common with ESR2 (LEF-1; PAPPA; NDGR2; ATP1A1) and one with ESR1 (CAV1) and others genes were chosen because they control cell proliferation (CTNNB1; CCND1, IGFBP 3, 4 and 5). Protein expression of the IGF related genes (PAPPA and IGFBP 3, 4 and 5) was also evaluated by immunohistochemistry. During the first half of diestrus, it appears that E2 mediated signaling occurs via interaction of ER&#945; with CAV-1 (non-genomic signaling), activating signaling pathways of IGF and WNT / &#946;catenin, then regulating the cell proliferation process. Whereas in the second half, ER&#946; appears to regulate NDGR2 and ATP1A1 gene expression, contributing to the regression of the CL. Thus our results suggest that E2 may act as a luteotrophic and also a luteolytic factor in the canine CL.

Vacas leiteira de alta produção têm apresentado declínio da eficiência reprodutiva. Essa redução é devido a causas multifatoriais, entre elas a baixa concentração de estradiol (E2) no proestro e a baixa concentração de progesterona (P4) no ciclo estral subsequentente. O objetivo deste trabalho foi comparar o uso de gonadotrofina exógena na dinâmica folicular e na taxa de prenhez de vacas submetidas ao protocolo Ovsynch (Experimento 1) ou a protocolos utilizando P4 e E2 (Experimento 2). No Experimento 1, animais de primeiro serviço foram pré-sincronizados com dois protocolos (Presynch ou Double-Ovsynch). Já os animais de segundo ou mais serviços foram resincronizados com o protocolo Resynch. Os animais receberam GnRH (1&ordm; GnRH), seguido 7 dias depois pela adiministração de prostaglandina F2&alpha; (PGF2&alpha;). Nesse momento os animais foram divididos homogeneamente por paridade e número de inseminação em um de dois tratamentos: sem FSH (Ovsynch, n = 561) ou com FSH (Ovsynch + FSH, n = 571). O segundo GnRH (2&ordm; GnRH) foi administrado 56 horas após a PGF2&alpha; e a inseminação em tempo fixo foi realizada 16 horas após. Amostras de sangue foram colhidas no 1&ordm; e no 2&ordm; GnRH, na PGF2&alpha; e 6 e 13 dias após o 2&ordm; GnRH para dosagem de P4. Ainda, no 2&ordm; GnRH dosou-se também E2 No Experimento 2, os animais foram sincronizados no dia 0 com um dispositivo de P4 associado a 2 mg de benzoato de estradiol. Oito dias após o dispositivo foi removido e os animais receberam uma dose de PGF2&alpha;. Neste mesmo momento, as vacas foram divididas homogeneamente por paridade, número de serviços prévios, escore de condição corporal e presença de CL no inicio do protocolo em três tratamentos: Controle (sem tratamento adicional; n = 232); eCG (400 UI de eCG; n = 232) e FSH (20 mg de FSH; n = 230). Todos os animais receberam GnRH e foram insemados 56h após a retirada do dispositivo. Foram colhidas amostras de sangue a cada 48h do dia 11 ao dia 22. No Experimento 1, não houve efeito do FSH na concetração sérica de E2 no 2&ordm; GnRH (P = 0,88), no tamanho do maior folículo no 2 &ordm; GnRH (P = 0,63), na taxa de ovulação ao 2&ordm; GnRH (P = 0,69) ou na concentração sérica de P4 no 6&ordm; (P = 0,15) e 13&ordm; (P = 0,36) dia após o 2&ordm; GnRH. A taxa de prenhez foi semelhante (P&gt; 0,05) entre os animais tratados com Ovsynch (36,2%) e Ovsynch + FSH (39,1%). No Experimento 2, os tratamentos não alteraram o diâmetro do folículo ovulatório (P = 0,15), o intervalo entre a remoção do dispositivo de P4 e a ovulação (P = 0,30) e a taxa de ovulação (P = 0,44). Não houve efeito de tratamento na concentração sérica de P4 (P = 0,15). A taxa de prenhez foi diferente entre os tratamentos aos 30 dias após a IATF (Controle = 28,0a vs FSH = 18,7b vs eCG = 29,7a %; P = 0,01), mas não aos 60 dias (Controle = 21,6 vs FSH = 16,1 vs eCG = 24,1%; P = 0,08) e na perda de gestacional (Controle = 18,8 vs FSH = 14,0 vs eCG = 18,4%; P = 0,39). Assim, o tratamento com FSH não estimulou o crescimento folicular final e a função luteínica de vacas leiteiras de alta produção sincronizadas com os protocolos Ovsynch e P4/E2. / Fertility in high-producing dairy cows has decreased over the years, which has been associated with reduced estradiol (E2) concentrations during proestrus and suboptimal progesterone (P4) concentrations during early stages of gestation. The objectives of the present study were to evaluate the effects of exogenous gonadotropins on follicular dynamics and risk of pregnancy per artificial insemination (P/AI) in cows subjected to the Ovsynch protocol (Experiment 1) or to a P4/E2-based timed AI protocol (experiment 2). In experiment 1, cows were enrolled in the Ovsynch protocol (GnRH, 7 d PGF2&alpha;, 56 h GnRH, 16 h IA) either after presynchronization (Presynch or Double-Ovsynch; first AI postpartum) or 32 d after previous AI. At the PGF2&alpha; injection, cows were blocked by parity and number of AI and, within each block, randomly allocated to eitherreceive 20 mg of FSH at the moment of the PGF2&alpha;(Ovsynch + FSH, n = 571) or to remain as untreated control (Ovsynch, n = 561). Blood was sampled at the 1st and 2nd GnRH and PGF2&alpha; injections, as well as on d 6 and 13 after the 2nd GnRH to access P4 and E2 (at the 2nd GnRH only) concentrations. In experiment 2, cows were received a P4 device and 2 mg of estradiol benzoate. The device was removed 8 d later concurrently with an injection of PGF2&alpha;, followed by an injection of GnRH and AI at 56 h.At the PGF2&alpha; injection, cows were blocked by parity, number of AI, body condition score, and presence of a CL at device insertion.Within each block, cows were randomly allocated to receive either 20 mg of FSH (FSH, n = 230), 400 IU of eCG (eCG, n = 232), or no additional treatment at the moment of the PGF2&alpha; (Control, n = 232). Blood was sampled at every 48 h from 1 to 12 d after AI. In experiment 1, there was no effect of FSH on serum E2 at the 2nd GnRH (P = 0.88), follicle diameter at the 2nd GnRH (P = 0.63), ovulatory response to the 2nd GnRH (P = 0.69), or serum P4 on d 6 (P = 0.15) and 13 (P = 0.36) after the 2nd GnRH. Also, P/AI was similar (P &gt; 0.05) between Ovsynch (36.2%) and Ovsynch + FSH (39.1%). In experiment 2, treatment did not affect ovulatory diameter (P = 0.15), interval from P4 device removal and ovulation (P = 0.30), ovulatory response to the 2nd GnRH (P = 0.44), and serum P4 (P = 0.15). Interestingly, treatment with FSH reduced (P = 0.01) P/AI on d 30 (Control = 28.0a vs. FSH = 18.7b vs. eCG = 29.7a %), but not on d 60after timed AI (Control = 21.6 vs. FSH = 16.1 vs. eCG = 24.1%; P = 0.08).The risk of pregnancy loss was not affected by treatment (Control = 18.8 vs. FSH = 14.0 vs. eCG = 18.4%; P = 0.39). In conclusion, treatment with FSH failed to enhance the final growth of the ovulatory follicle and did not improve luteal function after AI in high-producing dairy cows synchronized with either the Ovsynch or P4/E2-based timed AI protocols.

O 17&beta;-estradiol (E2) desempenha um papel importante na função reprodutora e na fertilidade feminina, porém, sua ação é estendida para a maioria dos tecidos. Sabendo que o E2 tem funções pleiotrópicas em diferentes tecidos e órgãos, e que pode estar envolvido tanto na proliferação como na morte celular, nossa hipótese é que o E2 seja um dos iniciadores de regressão luteínica em cadelas não prenhes. Para testar nossa hipótese, foram usados corpos lúteos (CL) provenientes de 28 cadelas nos dias 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e >70 após a ovulação (n = 4/grupo) para os experimentos ex vivo. Nesta etapa foram analisadas as proteínas pró-apoptóticas (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) por imuno-histoquímica e western blotting, além da expressão dos genes CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1, ESR2m por PCR em tempo real. Na segunda etapa deste trabalho, utilizamos CL de 12 cadelas nos dias 20, 40 e 60 após a ovulação (n=4 por grupo), cujas células foram cultivadas e divididas em seis tratamentos: Controle, E2 (tratado com E2), bloqueador de ER&alpha; (tratado com MPP), bloqueador de ER&beta; (tratado com PHTPP), E2 + bloqueador de ER&alpha; (tratado com E2 + MPP) e E2 + bloqueador de ER&beta; (tratado com E2 + PHTPP). Foram avaliados os mesmos genes do experimento ex vivo, bem como os genes CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 e SLC2A4. De modo geral a expressão dos fatores pró-apoptóticos foi mais alta a partir do dia 40 e atingiu valores máximos nos dias 60 e 70 após a ovulação, assim como a expressão de ERS2. Essa correlação foi observada também nas células do grupo E2 + bloqueador de ER&alpha;, que também apresentaram regulação negativa de HSD3B1. Quando do bloqueio do ER&beta;, as células luteínicas responderam com aumento dos genes relacionados à esteroidogênese e à proliferação celular, principalmente quando oriundas dos dias 20 e 40 p.o. Dessa forma, conclui-se que o bloqueio do ER&alpha; levou ao aumento dos genes pró-apoptóticos, e o bloqueio do ER&beta; possibilitou aumento dos genes luteotróficos. Estes achados confirmam o papel pleiotrópico do estradiol no CL canino e incluem este hormônio, assim como o balanço entre seus receptores, dentre os atores principais da regulação da meia vida do CL canino. / The 17&beta;-estradiol (E2) plays an important role in the reproductive function and female fertility, however, its action is extended to most tissues. Knowing that E2 has pleiotropic roles in different organs and tissues, and that might be involved in both cell death and proliferation, our hypothesis is that E2 is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. To test our hypothesis, corpora lutea (CL) from 28 dogs on days 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 and >70 after ovulation (n = 4/group) were used for ex vivo experiments. Pro-apoptotic proteins expression (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) were analyzed by immunohistochemistry and western blotting, and the gene expression of CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1 and ESR2 were analyzed by real-time PCR. In the second step of this study, CL from 12 bitches on days 20, 40 and 60 (n = 4 per group) were used. Luteal cells were isolated and divided into six treatments: Control, E2 (treated with E2), ER&alpha; Blocker (treated with MPP), ER&beta; Blocker (treated with PHTPP), ER&alpha; + E2 Blocker (treated with E2 + MPP) and E2 + ER&beta; Blocker (treated with E2 + PHTPP). The expression of the same genes from the in vivo experiment was evaluated, as well as that of CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 and SLC2A4. In general, the expression of pro-apoptotic factors was higher from day 40 and reached highest expression on days 60 and 70 after ovulation, coinciding with increasing in expression of ERS2. This correlation was also observed in the cells from the group E2 + ER&alpha; blockade, which also showed HSD3B1down-regulation. When ER&beta; was blocked, cells of days 20 and 40 post ovulation responded increasing the expression of steroidogenesis and proliferation related genes. Thus, we deduce that the ER&alpha; blockade promotes the increase of pro-apoptotic and that o ER&beta; of luteotrophic genes expression. Our findings confirm the pleiotropic role of estradiol in canine CL and include this hormone, as well as the balance between its two receptors, among the factors controlling canine CL lifespan.

Com o intuito de investigar se a hipóxia representa um dos desencadeadores da regressão luteínica em cadelas não prenhes, o presente estudo foi delineado para analisar a expressão do fator transcricional indutível por hipóxia HIF1A e a de seus genes-alvo relacionados à angiogênese, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGFA) e à captação de glicose, como as proteínas transportadoras facilitadoras GLUT1/SLC2A1 e GLUT4/SLC2A4 no corpo lúteo canino ao longo do diestro (dias 10 a 70 após a ovulação). Para tal, utilizou-se imuno-histoquímica e western blotting para localizar e quantificar as proteínas do HIF1A, GLUT1 e GLUT4 e PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNAm de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR. Além disso, células luteínicas nas fases inicial (dia 10), média (dia 30) e final (dia 60) foram submetidas ao tratamento com cloreto de cobalto (CoCl2) a 500 &micro;M para avaliar os efeitos da hipóxia sobre a expressão gênica dos fatores acima citados, bem como sobre a produção de progesterona e 17&beta;-estradiol. Nossos resultados demonstraram que o HIF1A é expresso pelo corpo lúteo canino de maneira tempo-dependente ao longo do diestro, e que a expressão de seu RNAm está diretamente correlacionada a expressão gênica de SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR e com as concentrações de progesterona periférica. No cultivo primário de células luteínicas, a hipóxia induzida pelo CoCl2 diminuiu a produção de progesterona e de 17&beta;-estradiol e estimulou significativamente a expressão de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 e VEGFA. Esses resultados sugerem que o HIF1A constitui um dos fatores regulatórios da função do corpo lúteo canino participando da modulação de processos como esteroidogêne, angiogênese e da captação de glicose, atuando como fator luteolítico. / This study was designed to investigate if hypoxia is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. For that, we analyzed the hypoxia- inducible factor (HIF1A) expression as well as the expression of its target genes related to angiogenesis (vascular endothelial growth factor VEGFA) and to glucose uptake (glucose transporters GLUT/SLC2A 1 and 4) in canine corpus luteum throughout diestrus (days 10 to 70 after ovulation). We used immunohistochemistry and western blotting to localize and quantify the protein expression of HIF1A, GLUT1 and GLUT4, respectively, and real time PCR to analyze HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression. Moreover, luteal cells from early (day 10), mid (day 30) and late luteal phase (day 60) were submitted to 500 &micro;M cobalt chloride (CoCl2) treatment to verify hypoxia effects on gene expression of the above cited genes and on progesterone and 17&beta;-estradiol production. Our results showed that luteal cells expressed HIF1A in a time-dependent manner over diestrus and that its expression was directly correlated to both SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression and progesterone production. The protein expression of the studied genes also changed over diestrus and was correlated with the respective gene expression. In primary luteal cells culture, cobalt chloride-induced hypoxia downregulated progesterone and 17&beta;-estradiol production, but upregulated HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 and VEGFA gene expression. These findings suggest that HIF1A is one of the factors regulating canine luteal function by modulating important process as steroidogenesis, angiogenesis and glucose uptake, acting as a pro-survival factor.

Grande parte das perdas embrionárias ocorrem nas três primeiras semanas após a inseminação e grande parte pode-se atribuir a baixas concentrações de progesterona. Desta maneira, o objetivo do presente experimento foi avaliar os efeitos e a interação entre o escore de condição corporal (ECC) e condição ovariana (EO) em vacas suplementadas com progesterona de longa ação (P4) após IATF sobre a taxa de prenhez em vacas de corte. Neste experimento foram utilizados 1573 vacas de corte, lactantes entre 30 e 60 dias pós-parto. As vacas tiveram a ovulação sincronizada iniciando-se no dia - 10 e foram inseminadas no dia 0. No dia 4, os animais foram blocados de acordo com ECC e EO e ordem de parto e divididos em dois tratamentos: (P4, n = 786) e (Controle, n = 787). Foram feitas avaliações ultrassonograficas dos ovários nos dias -10, 0 e 4, para mensurações de tamanho de folículo e corpo lúteo e no dia -10 foi feita a avaliação do ECC. A taxa de prenhez (P/IA) entre os grupos P4 vs CONTROLE não apresentou diferenças P=0,49. Vacas com ECC &gt; 2,75 tiveram melhora P/IA (P&lt;0,05) comparadas com vacas com ECC &le; 2,5. Vacas com presença de folículo &ge; 8 mm no dia -10 apresentou melhor P/IA (P&lt;0,05) comparadas com vacas com presença de CL ou folículo &lt; 8 mm. Vacas com folículo &ge;8 mm e CL apresentaram maior tamanho de folículo, maior área de CL, no entanto, os animais com presença de folículo &ge; 8 mm apresentaram maior taxa de concepção comparado com os animais com folículo &lt; 8 mm e com presença de CL. Concluimos que a suplementação com P4 após a IATF não melhora as taxas de prenhez, independente do ECC e do EO, no entanto, o ECC e o EO apresentam influências nas taxas de prenhez, onde os animais com melhor ECC no início do protocolo apresentaram melhor EO e maior taxa de prenhez. / Embryo loss commonly occurs in the first three weeks after insemination due to low progesterone (P4) concentrations. Therefore, this study evaluates the effects of body condition score (BCS) and ovarian condition (OC) on pregnancy rates (P/AI) in beef cows supplemented with long-acting P4 after timed artificial insemination (TAI). We used 1573 lactating Nellore cows at 30-60 days postpartum. The animals were pre-synchronized on Day -10 and inseminated on Day 0. On Day 4, they were evaluated for BCS, OC and parturition order and divided into two treatment groups: P4 supplementation (N= 786) and control group (N = 787). Ultrasound exams were performed on Days -10 and 0 to measure follicle diameter and on Day 4 to evaluate corpus luteum (CL) area. BCS was determined on Day -10. P/AI did not vary between P4 supplementation and control treatments (P = 0.49). Cows with BCS &gt; 2.75 had better P/AI than cows with BCS &le; 2.5 (P &lt; 0.05). Cows without CL and with follicle diameter &ge; 8 mm on Day -10 presented better P/AI than cows with follicle &lt; 8 mm or CL (P &lt; 0.05). In conclusion, P4 supplementation after TAI did not improve P/AI. However, BCS and OC affected P/AI and the animals with better BCS at the beginning of the experiment had better OC and P/AI.

Atualmente, grande parte do onhecimento adquirido sobre reprodução de serpentes, advém de estudos levados a efeito na América do Norte e Europa, com animais de regiões temperadas; e, na Austrália, com Elapídeos tropicais. No presente estudo foram utilizadas dez serpentes fêmeas prenhes de Crotalus durissus (Viperidae) de região neotropical, com o objetivo de descrever e correlacionar a morfologia do corpo lúteo, placenta e estágio fetal. Com isso pode-se inferir também, o tempo de prenhez. As técnicas realizadas para essa descrição e correlação foram: biometria macroscópica das fêmeas e suas estruturas; microscopia de luz com coloração de hematoxilina-eosina e microscopia eletrônica de varredura. Foram coletados no total 124 corpos lúteos e 116 placentas, onde observou-se que a cascavel possui o corpo lúteo de caráter ovulatório e a placenta do tipo corioalantóica evolvida por uma delgada membrana da casca do ovo. Concluiu-se que o tamanho padrão da superfície dos corpos lúteos para uma prenhez normal é de 18 a 34 mm2 e que há um corpo lúteo para cada ovo, independente se está fertilizado ou atrésico, porém os ovos atrésicos não possuem placenta. Pela primeira vez foi possível visualizar a disposição estrutural dos filamentos calcários em forma de trama na membrana da casca do ovo. Foi inferida uma classificação da placenta em três estágios I, II e III de acordo com a morfologia e aumento das vilosidades apresentadas entre placenta e útero; e a partir da identificação do estágio de desenvolvimento embrionário e fetal pode-se inferir o tempo de prenhez em C. durissus, classificadas em três terços, inicial, médio e final, evidenciando que existe uma correlação entre a evolução dos estágios placentários com desenvolvimento fetal, conforme a evolução gradual da prenhêz / At de present time, great part of snake reproduction knowledge results from researches realized in North America and Europe, with temperate region animals; in Australia with tropical Elapides. At this present research, ten pregnant females of the snake Crotalus durissus (Viperidae), from Neotropical Region, were utilized. The main goal is to correlate the morphology, corpus luteum, placenta and fetal development. Then, it is also easy to deduce the pregnancy time. The techniques performed for this description and correlation were females macroscopic biometry and their structures; light microscopy with hematoxiline-eosine color and electronic scanning microscopy. 124 corpora lutea and 116 placentas were collected. In those samples could be observed that rattlesnakes have an ovulatory corpus luteum and a corioalantoic placenta wrapped by a slender membrane of the eggshell. Clearly the conclusion is that the normal standard size surface corpus luteum for a normal pregnancy is from 18 to 34mm² and that there is a corpus luteum for each egg, independently if it is fertilized or atresic; but, these atresic eggs have not placenta. For the first time it was possible to visualize the structural arrangement of the calcareous filaments in shaped frame in the eggshell membrane. It was inferred a placenta classification in three stages: I, II and III according to the morphology and increased vilosiddes presented among placenta and uterus; and, from the identification of embryonic and fetal development stage we can infer the time pregnancy in C. durissus, classified in three thirds, initial, middle and final, indicating that there is a correlation between the evolution of placental stage with fetal development, as the gradual evolution of pregnancy

Resumo:Comparou-se a taxa de concepção de vacas leiteiras (22,4±5,58L) submetidas à IATF, usando dispositivo intravaginal com diferentes doses de progesterona (P4). As vacas foram implantados aleatoriamente com dispositivo de 1,0g (n= 43) ou 1,3g de P4 (n = 48) em seguida foi administrado 2 mg de benzoato de estradiol (BE, IM). No D3 foi coletado sangue para análise da concentração de P4. No D8 retirou-se o implante e administrou-se 0,15 mg de D-Cloprostenol (IM). No D9, foi injetado 1 mg de BE (IM) e aproximadamente 56 h após a retirada do implante realizou-se IATF. Foi coletada temperatura ambiente nos 50 dias que antecederam a inseminação. O diagnóstico de gestação foi realizado com ultrassom após 30 dias da IATF. A taxa de prenhez foi de 19,8%, sendo oito vacas com 1,0g e dez com 1,3g de P4. Não houve diferença na taxa de prenhez entre os grupos de P4 e a presença ou ausência de CL (teste 2). A temperatura ambiente máxima nos 50 dias antes da IATF foi maior (ANOVA) no subgrupo não prenhe com 1,3g de P4 em relação às não prenhes com 1,0g e às prenhes com 1,0 ou 1,3g de P4. Para cada aumento de 1ºC na média da temperatura ambiente dos 50 dias pré IA a taxa de prenhez diminui 42,1% (análise de regressão logística). Conclui-se que suplementar vaca em lactação (22L) com mais P4 intravaginal (1 ou 1,3 g) não modificou a taxa de concepção com o protocolo de IATF utilizado sob estas condições ambientais / Abstract:We compared the conception rate of dairy cows (22.4 ± 5,58L) submitted to TAI, using intravaginal device with different doses of progesterone (P4). The cows were randomly implanted with a device of 1.0g (n = 43) or 1.3 g P4 (n = 48) was then given 2 mg of estradiol benzoate (EB, MI). In D3 blood was collected for analysis of P4 concentration. In D8 was removed and the implant was administered 0.15 mg of D-cloprostenol (IM). At D9, was injected 1 mg of EB (MI) and about 56 h after implant removal was performed TAI. Ambient temperature was collected in the 50 days prior to insemination. Pregnancy diagnosis was performed with ultrasound after 30 days of TAI. The pregnancy rate was 19.8%, eight cows with 1.0g and ten with 1.3 g of P4. There was no difference in pregnancy rates between P4 groups and the presence or absence of CL (2 test). The maximum ambient temperature in the 50 days before IATF was higher (ANOVA) in patients not pregnant with 1.3 g of P4 in relation to non-pregnant with 1.0g and pregnant with 1.0 or 1.3 g of P4. For each increase of 1°C in average ambient temperature of 50 days pre AI pregnancy rate decreases 42.1% (logistic regression analysis). It was concluded that further lactating cow (22L) over intravaginal P4 (1 or 1.3 g) did not change the design rate with artificial insemination protocol used under these environmental conditions / Orientador:Guilherme de Paula Nogueira / Banca:Daniel de Jesus Cardoso de Oliveira / Banca:Claudia Maria Bertan Membrive / Mestre

Orientador: José Antônio Dell'Aqua Júnior / Resumo: Com o aumento na produção e na comercialização mundial dos produtos derivados de jumentos, faz-se necessária uma melhor compreensão da espécie. O mercado Chinês, baseado na medicinal tradicional chinesa tem importado asininos do mundo todo, gerando um aumento de 150 % nas importações, abrindo uma novo nicho de mercado mundial. Devido a essa demanda torna se indispensável estudos relacionados com a fisiologia reprodutiva, bem como a correta compreensão dos mecanismos envolvidos na dinâmica ovariana dos asininos, possibilitando assim a utilização de biotecnologias que visam o aumento na eficácia reprodutiva da espécie. A ultrassonografia tem sido amplamente utilizada para o monitoramento dos fenômenos reprodutivos das espécies domésticas, tanto patológicos quanto fisiológico. O corpo lúteo definido como uma glândula transitória, secretora de progesterona e mantenedora da gestação nas espécies monovulátorio como asininos e bovinos . O funcionamento fisiológico do corpo lúteo é dependente de uma microvascularização local, que está diretamente relacionada com os níveis séricos de progesterona. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo o monitoramento dos eventos reprodutivos fisiológicos e comportamentais relacionados a dinâmica folicular associada com o acompanhamento da perfusão luteal períferica e sua relação com as concentrações plásmaticas de estrógeno e progesterona ao longo do ciclo . / Abstract: With the increase in the production and the worldwide commercialization of the derived products of asses, it makes if necessary a better understanding of the species. The Chinese market, based on traditional Chinese medicine has imported asininos from all over the world, generating a 150% increase in imports, and a billion dollar revenue throughout the year. In this way, it becomes indispensable the studies related to the reproductive physiology, as well as the correct understanding of the mechanisms involved in the ovarian dynamics of the asininos, thus allowing the use of biotechnologies that aim at the increase in the reproductive effectiveness of the species. Ultrasonography has been widely used for the monitoring of reproductive phenomena of domestic species, both pathological and physiological. The corpus luteum defined as a transitory gland, secreting progesterone and maintaining gestation. The physiological functioning of the corpus luteum is dependent on local microvascularisation, which is directly related to serum progesterone levels. In this way, the present study aimed to monitor the physiological and behavioral reproductive events related to ovarian dynamics associated with the monitoring of percutaneous luteal perfusion and its relation with estrogen and progesterone concentrations throughout the cycle. / Mestre