O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

O receptor ativado do peroxissomo γ (PPAR-γ) é regulador do metabolismo e diferenciação do tecido adiposo, sendo um alvo conhecido das tiazolidinedionas (TZD), utilizadas para o tratamento do diabetes tipo 2 (DM2). As TZD agem como um agente sensibilizador da ação da insulina nos tecidos periféricos e tem sido especulado que as TZDs podem ter um papel na função da célula , prevenindo perda de massa e melhorando a sua viabilidade a longo prazo. Este efeito seria supostamente mediado pela transcrição de genes que favoreceriam a lipólise, diminuindo o conteúdo intracelular de triglicérides e, portanto, diminuindo a lipotoxicidade. Entretanto, alguns estudos também mostraram efeito nulo ou mesmo deletério das TZDs sobre as ilhotas pancreáticas. Na realidade, o papel de genes-alvo para o PPAR- nas ilhotas pancreáticas é ainda pouco conhecido. Estudamos o perfil de expressão gênica induzido pelo tratamento com Pioglitazona (Pio), uma TZD aprovada e disponível para uso clínico no tratamento do DM2, em ilhotas pancreáticas murídeas em cultura primária, com concentrações normal e suprafisiológica de glicose no meio de cultura. As ilhotas foram obtidas de ratos wistar machos de dois meses de idade e isoladas pelo método do gradiente de Ficoll e então cultivadas em 5,6 mM ou 23 mM de glicose por 24h, sendo tratadas com Pio 10 M ou DMSO 0,1% (veículo). A Pioglitazona foi cedida pela Takeda Farmacêutica, Osaka, Japão. O RNA foi extraído com Trizol e purificado com o kit RNeasy (Qiagen). As amostras foram marcadas e hibridizadas no microarranjo de cDNA Mouse Panchip 13k, usando-se cinco replicatas biológicas diferentes para cada condição. A análise estatística dos dados do microarranjo foi feita com o uso do programa significance analysis of microarrays (SAM) com uso de taxa de descobrimento falso (FDR) de 20%. A análise das vias acometidas foi feita com o Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Os resultados de expressão gênica foram confirmados por RT-qPCR. Em concentração de 5,6 mM de glicose no meio de cultura, 101 genes foram modulados pela Pio, sendo 49 regulados para cima, com aumento de sua expressão na presença da droga e 52 genes regulados para baixo. Em 23 mM de glicose, 1.235 genes foram afetados, sendo 621 para cima e 623 para baixo. A comparação entre as duas condições revelou 74 genes que foram modulados em ambas as concentrações de glicose. A análise das vias biológicas alteradas mostrou que genes relacionados ao metabolismo de lípides foram modulados em ambas as concentrações de glicose. Em 23 mM foi ainda significativo o grupo de genes relacionados a ciclo celular e morte celular que tiveram sua expressão modificada pela presença da droga na cultura. Este dado demonstrou que além de seus efeitos conhecidos nos adipócitos, o sensibilizador de insulina Pioglitazona modula a expressão de genes nas ilhotas pancreáticas, especialmente na presença de concentrações suprafisiológicas de glicose, afetando notadamente genes relacionados ao metabolismo lipídico, sendo vários deles ligados a lipogênese, como Srebf1, Scd2 e Fabp4 cujas expressões aumentaram em ambas as concentrações de glicose. Além disso foi observado aumento na expressão de genes com atividade pró-apoptótica como Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd e Myc. A Pioglitazona parece induzir um perfil gênico desfavorável em ilhotas pancreáticas mantidas em cultura em concentrações suprafisiológicas de glicose. / Peroxisome proliferator-activator receptor-γ (PPAR-γ) is a target for thiazolidinedione (TZD) antidiabetic drugs and a regulator of adipose tissue differentiation and metabolism. TZD act as an insulin sensitizing agent on peripheral tissues. It has been speculated that TZD could play a role on beta-cell function, preventing loss and improving viability in the long-term. This effect is supposed to be mediated through a potential benefit against lipotoxicity, favouring lypolisis and decreasing intracellular tryglicerides content. Nevertheless some studies also showed a lack or even a potential deleterious effect of TZD on islets. The role of PPAR-γ target genes in pancreatic islets is actually still largely unclear. We studied the gene expression profile induced by the treatment with Pioglitazone (Pio), an approved TZD for T2DM therapy, on rat pancreatic islets primary culture both at normal and supraphysiological glucose medium concentrations. Islets were obtained from 2 month-old, male, wistar rats and isolated through the Ficoll gradient method and then cultured with 5.6 mM or 23 mM of glucose concentration for 24h, being treated with Pio 10 µM or DMSO 0.1% (vehicle). Pioglitazone was provided by Takeda Pharmaceuticals, Osaka, Japan. RNA was extracted with Trizol (Sigma) and purified with RNeasy kit (Qiagen). Samples were labeled and then hybridized on the Mouse PanChip 13k cDNA microarray, using 5 different biological replicates for each test condition. Statistical Analysis of the microarray data was performed using significance analysis of microarrays (SAM) with a false discovery rate of 20%. Pathways assessment was performed through Ingenuity Pathway Analysis (www.ingenuity.com). Gene expression results were confirmed through RT-qPCR. At 5.6 mM glucose 101 genes were modulated by Pio, 49 upregulated and 52 downregulated. At 23 mM, 1,235 genes were affected, 612 upregulated and 623 downregulated. Comparison between both conditions revealed 74 genes that were similarly modulated at both glucose concentrations. Pathway analysis of perturbed genes revealed biologically relevant networks related to lipid metabolism at both glucose medium concentrations. At 23 mM, cell cycle and cell death pathways were significant modulated as well. These data demonstrates that in addition to known effect in adipocytes, the insulin sensitizing agent Pioglitazone modulates gene expression in pancreatic islets, especially in the presence of supraphysiological glucose concentrations, affecting especially lipid metabolism and mechanisms of cell death and cell cycle. Considering the ontology of modulated genes it seems to be a trend towards lypogenesis (increased Srebf1, Scd2 and Fabp4 RNA expressions) with Pio treatment also enhancing the abundance of some genes considered to be pro apoptotic like Tnf, Bad, Bax, Caspase4, Fadd and Myc. Pioglitazone seems to induce a negative gene expression profile in islets cultured at high glucose concentrations.

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Alex Rafacho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:53:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Purificacao_ThaisAlmeida_M.pdf: 1255549 bytes, checksum: 5142cacf6ca932aa0dd1a86b9eef5074 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Administração de glicocorticóides em roedores e humanos aumenta a resistência à insulina (RI). A RI, provocada por dexametasona, leva a hiperinsulinemia por aumento da secreção do hormônio pelas ilhotas pancreáticas. Recentemente, demonstrou-se que a AS160, uma GAP (proteína ativadora de GTPase), participa no tráfego de vesículas em diferentes tipos celulares que, por sua vez, pode ser alterado por dexametasona. Neste trabalho, avaliamos possível participação da AS160 na secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona, para isto foram avaliadas proteínas envolvidas no processo de secreção; pAS160, Akt e AMPK. Ratos Wistar adultos foram tratados com o glicocorticóide (DEX) com 1mg/kg (ip) de peso corporal, ou salina (CTL), durante 5 dias. Ao final do período de tratamento, os ratos foram submetidos a um Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT) e, após sacrifício, amostras de sangue foram coletadas para dosagem de insulina. As ilhotas pancreáticas foram isoladas por digestão do pâncreas com colagenase. As proteínas insulares foram avaliadas por Western Blot e os genes por RCP-TR. A insulina, contida nas amostras de sangue e nas incubações de ilhotas, foi medida por radioimunoensaio (RIA). A razão pAS160/AS160 foi aumentada nas ilhotas DEX (P<0,05). Nestas ilhotas, resultados semelhantes foram observados para a razão pAkt/Akt (P<0,05). O tratamento com DEX também aumentou a expressão gênica e protéica da Rab27A (P<0,05), contudo, reduziu significativamente sua associação com a AS160 (P<0,05). A associação entre essas duas proteínas foi observada pela primeira vez nas ilhotas neste trabalho. O tratamento com DEX também reduziu as expressões gênica e protéica bem como a fosforilação da AMPK. A secreção de insulina foi maior nas ilhotas DEX comparado à CTL e, em ambas, a secreção foi diminuída pela wortmanina (inibidor da PI3K). Ilhotas de ratos CTL e DEX, tratados com anti-sense anti-AS160, tiveram o conteúdo protéico da AS160 reduzido em ± 80%, comparado ao CTL (P<0,05). Nas ilhotas de ratos CTL knockdown, a secreção de insulina foi maior que nos CTL e, nas ilhotas dos DEX knockdown a secreção foi semelhante às DEX. Concluindo, o aumento da secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona envolve a participação da AS160 e, essa potencialização parece ser mediada pela via PI3K/Akt. Esse aumento de secreção parece também ser diretamente proporcional ao aumento da dissociação entre a Rab27A e a AS160 / Abstract: It is well known that glucocorticoids induce insulin resistance (IR). It is also known that dexamethasone-induced IR is linked to increased levels of plasma insulin due to higher insulin secretion by pancreatic islets. Recent findings show that the Rab-GTPase AS160 plays a role in the traffic of vesicles in different cells type that, in turn, may be affected by dexamethasone. Here, we evaluated the participation of AS160 in the insulin secretion in islets from dexamethasone treated rats. Adult rats were treated with dexamethasone (DEX) with 1.0 mg/kg, body weight (ip) or saline (CTL) for 5 consecutive days. Insulin resistance was evaluated by intraperitoneal Glucose Tolerance Test (ipGTT). After, the rats were sacrificed and the islets isolated by the digestion of their pancreases with collagenase. Protein was measured by Western- Blot, and insulin by RIA. AS160 expression, phosphorylation, and the pAS160/AS160 ratio were increased in DEX islets (P<0.05). Similar results were observed for Akt (P<0.05). Dexamethasone also increased Rab27a protein and gene expression but significantly reduced its association with AS160. The association between these two proteins was observed in pancreatic islets for the first time in this work. AMPK gene and protein expression as well as phosphorylation were reduced by Dexamethasone (P<0.05). The insulin secretion was higher in DEX compared with CTL islets (P<0.05). Both secretions were reduced by wortmanin. Islets from CTL and DEX rats, treated with anti-sense anti-AS160, showed ± 80% reduction on its expression. The CTL knockdown islets secreted more insulin than CTL and the DEX knockdown secreted similar amount of insulin than DEX islets. In conclusion, these results indicated that AS160 participates in the increased insulin secretion in islets from DEX rats, and this effect seems to be dependent on the activation of the PI3K/Akt pathway. The increase in insulin secretion also depends on the dissociation between Rab27a and AS160 / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Actuellement les transplanteurs sont confrontés à une pénurie de greffons, conduisant à l'élargissement des critères de choix des donneurs. Cette démographie fait place à des greffons plus sensibles aux lésions d'ischémie-reperfusion (I/R). Ces lésions conduisent à des dysfonctions de reprises de fonction des greffons, et participent à l'augmentation de l'immunogénicité du greffon et à l'emergence de rejets aigus et chroniques. Dans un premier temps, il est donc nécessaire de limiter les lésions d'I/R et conserver l'intégrité du greffon. Dans un deuxième temps, il est important de réduire l'immunogénicité du greffon et de contrôler le rejet de greffe tout en maintenant le receveur immunocompétent. Afin de limiter les lésions d'I/R nous avons évalué la solution de préservation SCOT de type extracellulaire contenant 30g/L de PEG 20kDa, dans un modèle murin d'isolement et de transplantation d'îlots pancréatiques. L'amélioration des conditions de conservation a permit de préserver l'intégrité des îlots et de réduire l'immunogénicité du greffon, et ce due aux propriétés immunoprotectrices des PEG 20kDa (effets obtenus pour 10 à 30g/L). Dans ce même modèle notre second objectif était d'établir un état de tolérance périphérique par déplétion transitoire des lymphocytes T alloréactifs. La déplétion des lymphocytes T en division a été induite au moment de l'allotransplantation des îlots, par administration transitoire d'un analogue nucleosidique inductible. La déplétion transitoire a permit d'aboutir à une immunotolérance dominante via l'émergence de lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+FoxP3+, cellules ouvrant de nouvelles perspectives dans l'inhibition des rejets d'allogreffes. / Organ and tissue transplantation is affected by a shortage of grafts, leading to enlargement of donor criteria. Consequently, these new marginal organs are more susceptible to ischemia-reperfusion injury (IRI). IRI increases primary graft dysfunctions and contributes to increase graft immunogenicity and consequently the occurence of acute and chronic rejection. Our objectives were : firstly, the necessity to limit I/R damages and preserve graft integrity, secondly, the importance to reduce graft immunogenicity and control the graft rejection while maintaining an immunocompetent recipient. To limit IRI we evaluated the new SCOT preservation extracellular type solution containing PEG 20kDa 30g/L in a murine model of pancreatic islets isolation and transplantation. The improvement of conservation with SCOT permitted to maintain the islets integrity and to reduce graft immunogenicity, due to the immunoprotective properties of PEG 20kDa (effects obtained with PEG 20kDa at 10 to 30g /L). In this same model our second objective was to establish a peripheral immunological tolerance of the graft by transient depletion of alloreactive T cells. This depletion of T cells in division was induced at the time of islet allotransplantation by an administration of an inducible nucleosidic analogue during 14 days. Transient alloreactive T cells depletion induced a dominant immunotolerance marked by the emergence of a persistent regulatory T cells CD4+CD25+FoxP3+ population. Thus, regulation of homeostatic balance between effector and regulatory T cells could open an interesting way to control the immune reaction against allograft.

La prévalence de l’obésité et du diabète de type 1 (DT1) s’accroit dans le monde à une vitesse alarmante. L’augmentation du poids corporel, de la quantité d’acides gras libres (AGL) circulant et de la résistance à l’insuline peut induire un stress du réticulum endoplasmique (RE) dans les cellules beta du pancréas, ce qui pourrait favoriser l’inflammation. Afin de tester cette hypothèse, nous avons exposé des cellules beta à un léger stress chronique du RE induit par de l’acide ciclopiazonique (ACP) ou l’AGL palmitate et les avons ensuite traitées avec une faible dose d’interleukine 1β (IL-1β) ou de facteur de nécrose tumorale (TNF-α). L’addition d’IL- 1β, mais pas de TNF-α, a conduit à l’augmentation de la production de marqueurs pro-inflammatoires et de chimiokines. Cette différence de résultat en fonction de l’exposition à l’IL-1β ou au TNF-α peut-être au moins partiellement expliquée par un usage différentiel du complexe de la kinase IκB (IKK) et de la voie du facteur nucléaire κ-B (NF-κB), menant à terme à une activation plus élevée par l’IL-1β en comparaison à TNF-α. L’analyse des branches de la réponse de la protéine dépliée impliquées a révélé que la voie de l’Inositol-requiring enzyme 1 (IRE1) / X-box binding protein 1 spliced (XBP1s) est le médiateur clé dans le couplage avec la réponse inflammatoire déclenchée par l’IL-1β. En effet, le knockdown d’IRE1 ou de XBP1 a permis d’éviter l’exacerbation de l’activité du promoteur NF-κB et l’expression des gènes cibles de NF-κB. Les mécanismes impliqués dans la régulation XBP1-dépendante de la réponse pro-inflammatoire sont partiellement dépendant de la modulation de la Forkhead box O1 (FoxO1). Le stress du RE et l’IL-1β participent aussi à un autre évènement crucial dans le développement du DT1, à savoir la mort progressive des cellules beta, qui est également exacerbée par la combinaison ACP + IL-1β. Contrairement à l’inflammation, la voie IRE1/XBP1 n’est pas impliquée dans l’apoptose cellulaire induite par la combinaison d’ACP et d’IL-1β. Dans ce contexte, nous suggérons que le devenir de la cellule est décidé par la balance entre les protéines Bcl-2 anti-apoptotiques et pro-apoptotiques. Ainsi, nous avons montré que le gène A1 associé à Bcl-2 (A1) est négativement régulé par le stress du RE tandis que l’IL-1β active la protéine BH3-only Bim, aboutissant à une apoptose accrue des cellules beta. En conclusion, nos données suggèrent que le stress du RE est un facteur sensibilisation pour l’induction de l’inflammation des ilots pancréatiques et de l’apoptose des cellules beta. Ceci pourrait fournir une explication mécanistique à l’augmentation parallèle observée de l’obésité infantile et de la fréquence du DT1.\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Précédemment, nous avons montré que la surexpression de l'échangeur Na/Ca NCX1), une protéine responsable de la sortie de calcium (Ca2+) des cellules, augmentait la mort cellulaire programmée ou « apoptose » et réduisait la prolifération des cellules β. Afin d’étudier plus en profondeur le rôle de l’échangeur dans les cellules β in vivo, nous avons développé et caractérisé des souris présentant une inactivation de NCX1.<p>Des méthodes biologiques et morphologiques (imagerie du Ca2+, capture de Ca2+, métabolisme du glucose, sécrétion d'insuline et morphométrie par comptage de points) ont été utilisées pour évaluer la fonction de la cellule β in vitro. Les taux de glucose et d'insuline dans le sang ont été mesurés afin de déterminer le métabolisme du glucose et la sensibilité à l’insuline in vivo. Des îlots ont été transplantés sous la capsule rénale pour évaluer leur capacité à corriger le diabète chez les souris rendues diabétiques par l’alloxane.<p>L'inactivation hétérozygote de Ncx1 chez les souris provoque une augmentation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose avec un renforcement important à la fois de la première et de la deuxième phase. Ces résultats s’accompagnent d’une augmentation de la masse et de la prolifération des cellules β. La mutation augmente également le contenu en insuline, l’immunomarquage de la proinsuline, la capture de Ca2+ induite par le glucose et la résistance à l'hypoxie des cellules β. En outre, les îlots de souris Ncx1+/- montrent une capacité à compenser le diabète 2 à 4 fois plus élevé que les îlots de souris Ncx1+/+ lorsque transplantés chez des souris diabétiques.<p>En conclusion, l’inactivation de l'échangeur Na/Ca conduit à une augmentation de la fonction de la cellule β, de sa prolifération, de sa masse et de sa résistance au stress physiologique, à savoir à divers changements de fonction des cellules β opposés aux principales anomalies rencontrées dans le diabète de type 2 (Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM). Ceci nous procure un modèle unique pour la prévention et le traitement du dysfonctionnement des cellules β dans le T2DM et pour la transplantation d'îlots.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Type 1 diabetes develops through the progressive destruction of the insulin-producing beta-cells. Regeneration or replacement of beta-cells is therefore needed to restore normal glucose homeostasis. Presently, normoglycemia can be achieved by the transplantation of whole pancreas or isolated islets of Langerhans. Islet transplantation can be performed through a simple laparoscopic procedure, but the long-term graft survival is low due to poor revascularization and early cell death. This thesis examined the possibility of using different auxiliary cells (Schwann cells, endothelial progenitor cells, and neural crest stem cells) to improve the engraftment and function of endogenous and transplanted islets. Co-transplantation of Schwann cells with islets improved islet graft function early after transplantation, and caused an increased islet mass at one month posttransplantation. However, the vascular densities of these grafts were decreased, which also related to an impaired graft function. Islet grafts containing endothelial progenitor cells had a superior vascular density, with functional chimeric blood vessels and substantially higher blood perfusion and oxygen tension than control transplants. By culturing and transplanting islets together with neural crest stem cells it was found that islets exposed to these cells had a higher beta-cell proliferation compared with control islets. At one month posttransplantation, the grafts with neural crest stem cells also had a superior vascular- and neural density. The potential of intracardially injected neural crest stem cells to home to the pancreas and ameliorate hyperglycemia in diabetic mice was investigated. During a three-week period after such cell treatment blood glucose concentrations decreased, but were not fully normalized. Neural crest stem cells were present in more than 10% of the pancreatic islets at two days postinjection, at which time the beta-cell proliferation was markedly increased when compared with islets of saline-treated diabetic animals. Three weeks later, a doubled beta-cell mass was observed in animals receiving neural crest stem cells. In summary, islets can easily be transplanted together with different auxiliary cells. Some of these cells provide the possibility of improving vascular- and neural engraftment, as well as beta-cell growth and survival. Systemic administration of neural crest stem cells holds the potential of regenerating the endogenous beta-cells.

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_PriscillaMunizRibeiroda_D.pdf: 2752788 bytes, checksum: a2b912ed65ab26f33708f44d094db90a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A glutamato desidrogenase (GDH) é uma enzima mitochondrial que cataliza a reação reversível de glutamato a ?-cetoglutarato. Nas ilhotas pancreáticas, está associada com a secreção de insulina por aumentar a concentração de ATP. Ratos alimentados com dieta hipoprotéica apresentam secreção de insulina diminuída. A suplementação com leucina (LEU) aumenta a secreção de insulina em resposta a agentes insulinotrópicos. O presente estudo investigou a influência da suplementação com LEU na expressão da GDH e seu envolvimento com a secreção de insulina em ratos desnutridos e suplementados com LEU. Ratos machos foram alimentados com dietas normo- (17%, NP) ou hipoprotéicas (6%, LP) por oito semanas. Após, foram divididos e suplementados com LEU (1,5%) na água de beber (NPL e LPL) pelas quatro semanas seguintes. O conteúdo protéico de GDH no cérebro, fígado, rim e músculo esquelético não diferiu entre os grupos. Nas ilhotas LP, a expressão da GDH estava diminuída e a suplementação com LEU aumentou a expressão de RNAm restaurando o conteúdo protéico a valores similares a NP. A secreção de insulina estimulada por agentes insulinotrópicos ou inibidores, combinados ou não, estava diminuída em ilhotas LP comparada com NP. A suplementação com LEU aumentou a secreção de insulina a valores similares a NP, exceto quando as ilhotas LPL foram incubadas com EGCG. Ilhotas LP tiveram diminuição na [Ca2+]i quando expostas a GLN+BCH. A suplementação com LEU restaurou esses parâmetros aos valores de NP. Frente a esses resultados, podemos concluir que a diminuição na expressão da GDH induzida pela dieta LP foi central ao pâncreas endócrino e está associada à redução da secreção de insulina observada nas ilhotas LP. A suplementação com LEU foi capaz de restaurar a expressão da GDH, contribuindo para o aumento da secreção de insulina observado nas ilhotas LPL. Além disso, a GDH pode, ainda, estar associada com a secreção de insulina pelo acoplamento estímulo/secreção via regulação da [Ca2+]i / Abstract: Glutamate dehydrogenase (GDH) is a mitochondrial matrix enzyme that catalyzes the reversible reaction of glutamate to ?-ketoglutarate. In the pancreatic islets, this enzyme is associated with insulin secretion by augmenting ATP levels. Protein malnourished rats displayed reduced insulin secretion. Leucine (LEU) supplementation augments the insulin secretion response to insulinotropic agents. The present study investigated the influence of LEU supplementation on GDH expression and its involvement with insulin secretion in malnourished rats supplemented with LEU. Male rats were fed normal- (17%, NP) or low-protein diet (6%, LP) for eight weeks. Half of rats of each group were supplemented with LEU (1.5%) in drinking water for the following four weeks (NPL and LPL groups). GDH protein content in brain, liver, kidney and skeletal muscles was not different in any group. GDH RNAm and protein content was reduced in LP islets and LEU supplementation augmented RNAm expression restoring protein content similar to NP. Insulin secretion was reduced in LP islets compared with NP when stimulated by insulinotropics agents or inhybitors, combinaned or not. LEU supplementation augmented insulin secretion to similar values as NP, an effect that was blunted when LPL islets were incubated with EGCG. LP islets showed lower [Ca2+]i when exposed to GLN+BCH. LEU supplementation augmented these patterns similar to NP. Taken together, we may conclude that diminution in GDH expression induced by LP diet was central to endocrine pancreas and was associated with reduced insulin secretion observed in LP rats. LEU supplementation was able to restore GDH expression and it was capable to restore insulin secretion via GDH restoration. Yet, GDH may contribute to insulin secretion via Ca2+ regulation stimulus/secretion coupling / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular