Thesis (Ph.D. in Immunology) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 151-168). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2006. / Embargoed. Vita. Bibliography: 196-214.

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T10:55:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stoppiglia_LuizFabrizio_D.pdf: 2405428 bytes, checksum: 6387a533bea2ca65f3826092e2220b39 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: No diabetes mellitus, radicais de oxigênio estão associados com perda de sensibilidade à glicose ou destruição das células b. Nesse trabalho, investigamos a tolerância de ilhotas de Langerhans de ratos neonatos ao estresse provocado por H2O2, seus mecanismos antioxidantes de defesa e os fatores que promovem manutenção da sensibilidade à glicose. Cultivadas com 1 mM de H2O2, as ilhotas aumentaram até 6' seu consumo de glicose e resistiram ao estresse induzido por H2O2 quando em meio contendo 20 mM de glicose. A expressão da enzima catalase em resposta à glicose se mostrou necessária a essa resistência, mas não suficiente. Em concentrações baixas de H2O2, quando a catalase tem sua atividade modulada por NADPH, observamos que mesmo proteínas sem atividade catalítica adquiriam capacidade antioxidante e eram regeneradas por NADPH. Mapeando a distribuição de atividade peroxidase na ilhota, observamos sensibilidade ao NADPH nas frações nuclear e citossólica. As ilhotas cultivadas em 20 mM de glicose e as que resistem ao H2O2 possuem em comum uma maior atividade da via das pentoses, que gera NADPH citossólico. Nessas ilhotas, verificamos que a produção citossólica de NAD(P)H limita a secreção de insulina. Tais ilhotas produzem NAD(P)H principalmente da oxidação de substratos endógenos no citossol e nas mitocôndrias, ao invés de localizarem seu uso somente no citossol, como se dá nas ilhotas mais sensíveis ao H2O2. A cultura com 20 mM de glicose produziu ilhotas com alta expressão da lançadeira de NADH glicerol-fosfato, enquanto o H2O2 selecionou ilhotas com alta expressão da lançadeira mal/asp. Como ambas as lançadeiras promovem a comunicação entre citossol e mitocôndrias, concluímos que o sistema de lançadeiras e a geração de NADPH sejam fatores críticos para a manutenção da sensibilidade à glicose nas ilhotas / Abstract: In diabetes mellitus, oxygen radicals are associated with loss of glucose-sensibility and destruction of b-cells. In this work, we investigated the tolerance of neonatal rat islets to stress induced by H2O2, the islets antioxidant defense mechanism and factors maintaining islet glucoseresponsiveness. Islets cultured with 1 mM of H2O2 increased 6 fold the glucose uptake and resisted H2O2-induced stress when cultured in media containing 20 mM of glucose. Glucose-induced catalase expression was shown to be necessary to islet cell-survival, although not sufficient. In low H2O2 concentrations, the activity of catalase is dependent on NADPH and we observed that even proteins with no catalytic activity could be antioxidants regenerated by NADPH. Mapping the peroxidase activity in islets, we observed sensibility to NADPH in nuclear and cytossolic fractions. Islets cultured with 20 mM of glucose and islets that survived after culture with H2O2 both showed increased activity of the pentose phosphate pathway, which generate cytossolic NADPH. Is theses islets, we verified that cytossolic production of NAD(P)H limits insulin secretion. Such islets generate NAD(P)H principally from oxidation of endogenous fuels in cytossol and mitochondria, in contrary of the most H2O2-sensible islets which use endogenous fuels exclusively in cytossol. Culture with 20 mM of glucose produced islets with high expression of the glycerol-phosphate NADH shuttle, where as culture with H2O2 selected islets with high expression of the mal/asp shuttle. Since both shuttles promote interchange between cytossol and mitochondria, we have concluded that the shuttle system together with NAD(P)H generation ability are critical factors in maintaining islet glucoseresponsiveness / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rafacho_Alex_D.pdf: 17852608 bytes, checksum: ee7b970220681b508fc5519d53e49655 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A resistência à insulina (RI) é uma condição que exige maiores níveis de insulina circulante e que normalmente são providenciados pelo aumento da função e população de células ß. A RI pode ser observada a partir de diversos modelos experimentais em roedores tais como os modelos transgênicos, de gravidez, submetidos às dietas hiperlipídicas e hipercalóricas e a partir de infusão venosa de glicose. Estes modelos têm sido úteis para a compreensão dos mecanismos compensatórios observados durante a RI. Os glicocorticóides são amplamente utilizados na indução farmacológica da RI em modelos animais e em seres humanos, com fins científicos. A ativação da sinalização da insulina e das proteínas reguladoras do ciclo celular é crucial para a função e crescimento das células ß adultas. No presente trabalho, apresentamos modelos para investigação da função e crescimento de células ß pancreáticas in vivo a partir da administração diária de três concentrações distintas de dexametasona (DEX) (0,1, 0,5 e 1,0 mg/kg, peso corpóreo, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 e DEX 1.0, respectivamente) por 5 dias consecutivos. A sensibilidade periférica à glicose e à insulina, parâmetros de secreção de insulina e histomorfométricos foram investigados. A análise dos níveis de proteínas relacionados à função e crescimento de células ß foi realizada por Western blotting. O tratamento com DEX induziu RI de maneira dose- dependente. Aumento da secreção de insulina em resposta à glicose foi observado tanto in vivo quanto ex vivo nos três grupos tratados com DEX. Ratos DEX 1.0, que apresentam hiperglicemia moderada e marcante hiperinsulinemia, exibiram aumento de 5,1 vezes na proliferação além de hipertrofia de células ß, com aumento significativo na massa de células ß comparado aos ratos CTL. Os ratos DEX 0.5, hiperinsulinêmicos, porém normoglicêmicos, também apresentaram aumento significante de 3,6 vezes na proliferação e modesta hipertrofia de células ß. Entretanto, os ratos DEX 0.1, que desenvolveram o menor grau de RI, compensaram à demanda de insulina apenas com aumento da função de células ß. Nenhuma alteração da freqüência de morte celular foi observada nas células ß dos três grupos DEX comparados ao grupo CTL. Foi observada ativação da via IRS-2/PI3- K/Akt/p70S6K, bem como da proteína retinoblastoma nas ilhotas do grupo DEX 1.0 e, em menor grau, no grupo DEX 0.5 quando comparados com as ilhotas do grupo CTL. Assim, aumentando a concentração de dexametasona induzem-se três graus de requerimento de insulina in vivo, servindo como modelo para investigação de alterações compensatórias em células ß. O aumento da demanda de insulina é compensado por aumento da função das células ß (em todos os GRUPOS DEX) e por hiperplasia e hipertrofia de células ß nos GRUPOS DEX 1.0 e DEX 0.5. Baseado nos presentes resultados concluímos que o aumento dos níveis circulantes de insulina parece ser o maior estímulo para proliferação e hipertrofia das células de células ß observado na RI induzida pela dexametasona. / Abstract: Insulin resistance (IR) is a condition that demand increased levels of circulating insulin that are normally provided by increase of ß-cell function and mass. The IR can be observed in several experimental rodent models such as transgenic, pregnancy, high-fat or high-caloric diet and from glucose infusion model. These models have aided in elucidating the compensatory mechanisms observed during the IR. The glucocorticoids are widely used to induce the pharmacological IR in animal models and in humans, with scientific purpose. Activation of insulin signaling and cell cycle proteins are crucial to the function and growth of adult ß-cells. At the present study, we showed models to investigation of pancreatic ß-cell function and growth in vivo from the daily administration of three different dexamethasone (DEX) concentration (0.1, 0.5 e 1.0 mg/kg, body weight, intraperitoneal - DEX 0.1, DEX 0.5 and DEX 1.0, respectively) for 5 consecutive days. The peripheral sensibility to glucose and insulin, insulin secretion and histomorphometrical parameters were investigated. The analyses of proteins related to ß -cell function and growth were done by Western blotting. DEX treatment induced IR in a dose-dependent manner. Incease of glucose-stimulated insulin secretion was observed in vivo as well as ex vivo in the three DEX groups. DEX 1.0 rats, that present moderate hyperglicemya and marked hyperinsulinemia, ehibited a 5.1-fold increase in ß-cell proliferation besides hypertrophy, with significant increase of ß -cell mass compared to CTL rats. DEX 0.5 rats, that are hiperinsulinemic and normoglicemic, also exhibited a significant 3.6-fold increase in ß-cell proliferation as well as ß -cell hypertophy. However, DEX 0.1 rats, which exhibited the lowest degree of insulin resistance, compensate for insulin demand by improving only ß -cell function. No alteration in cell death frequency was noted in ß -cells from the three DEX groups compared to CTL group. Activation of IRS-2/PI3-K/Akt/p70S6K pathway as well as the retinoblastoma protein in islets from DEX 1.0 and, in lesser extend, in DEX 0.5 group was observed compared to islets from CTL group. Therefore, increasing doses of dexamethasone induce three different degrees of insulin requirement in living rats, serving as a model to investigate compensatory beta-cell alterations. The increased insulin demand is compensated by increase of ß-cell function (in all DEX groups) and ß -cell hyperplasia and hypertrophy in DEX 0.5 and DEX 1.0 groups. Based on the present results we concluded that the augmented levels of circulating insulin seem to be the major stimulus for ß-cell proliferation and hypertrophy observed in dexamethasone-induced insulin resistance. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T21:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_ThiagoMartins_M.pdf: 1168177 bytes, checksum: 6c327ab4c396fab9844364b47f69ad79 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A desnutrição ainda é um problema de saúde pública que afeta principalmente países em desenvolvimento e sua prevalência chega a ser crescente em algumas áreas. Vários estudos obtiveram êxito em correlacionar a má nutrição em estágios iniciais de vida com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e diabetes tipo 2 na vida adulta. No modelo de desnutrição pós desmame verifica-se menor secreção de insulina estimulada por glicose e outros agentes insulinotrópicos bem como menor expressão de várias proteínas envolvidas com a funcionalidade da célula b. Estudos realizados por nosso grupo e outros laboratórios mostram que a suplementação de camundongos com taurina aumenta a secreção de insulina além de regular o influxo de íons Ca2+ para as células b, etapa crucial para o processo secretório. Para avaliar os efeitos da taurina sobre animais desnutridos, utilizamos ratos wistar, machos com 21 dias de vida. Os animais receberam dieta contendo 17% de proteína (normoprotéica) (C) ou 6% de proteína (hipoprotéica) (D). Animais C e D receberam suplementação com taurina a 2,5% na água de beber por 30 dias (CT30 e DT30) ou 90 dias (CT90 e DT90). Em seguida avaliamos parâmetros biométricos e bioquímicos, tolerância à glicose, secreção de insulina estimulada por glicose e pelo agonista colinérgico carbacol, expressão de proteínas envolvidas no controle da secreção de insulina e, finalmente, registramos os movimentos citoplasmáticos de íons Ca2+ após estímulo com glicose e carbacol. Verificamos que a restrição protéica retardou o crescimento dos animais além de reduzir a concentração plasmática de proteínas totais (C = 6,81±0,04; CT30 = 7,15±0,54; CT90 = 6,87±0,19; D = 5,35±0,24; DT30 = 5,37±0,28; DT90 = 5,70±0,09 g/dl; n = 3-5) e albumina (C = 3,20±0,11; CT30 = 3,41±0,02; CT90 = 3,18±0,05; D = 2,74±0,07; DT30 = 2,49±0,09; DT90 = 2,67±0,04 g/dl; n = 5-9) sem efeito da suplementação com taurina. Os animais D se mostraram mais tolerantes à glicose e a suplementação com taurina por 90 dias restaurou parcialmente a tolerância desses animais (C = 30249±2682; CT30 = 37255±6691; CT90 = 29365±2257; D = 16916±1609; DT30 = 18791±2859; DT90 = 23425±3856 AAC; n = 5-9). Nesse trabalho mostramos que a suplementação com taurina corrige a hipoinsulinemia verificada em animais desnutridos alimentados (C = 4,97±0,34; CT90 = 3,56±0,52; D = 1,39±0,10; DT90 = 3,31±0,70 ng/ml; n = 5-8) bem como a responsividade de ilhotas isoladas a concentrações crescentes de glicose. Verificamos também que a taurina normaliza a secreção de insulina potencializada pelo carbacol (C = 9,4+0,8; CT90 = 12,4+0,7; D = 6,4+0,5; DT90 = 9+0,7 ng/ml; n = 12). As respostas secretórias foram observadas em conjunto com a regulação da expressão das proteínas SERCA3 (C = 100+21; CT90 = 174+17; D =96+90; DT90 = 149+11 % do C; n = 6), receptor muscarínico M3 (C = 100+24; CT90 = 155+80; D = 51+10; DT90 = 108+14 % do C; n = 5) e sintaxina 1 (C = 100+30; CT90 = 92+40; D = 50+12; DT90 = 77+11 % do C; n = 5) que participam do controle de diferentes etapas do processo de secreção de insulina. Por fim, verificamos que a suplementação com taurina melhorou o padrão de oscilação de íons Ca2+ após estímulo com glicose. Concluímos então que a suplementação com taurina por 90 dias restaura a sensibilidade das ilhotas à glicose e ao carbacol possivelmente pela regulação do fluxo de cálcio para as células b bem como pela modulação da expressão de proteínas que controlam o processo de secreção de insulina. / Abstract: Malnutrition still is a public health issue, especially in developing countries. Many studies correlate malnourishment during early life and the development of cardiovascular disease and type 2 Diabetes Mellitus on latter stages. Animal models of malnutrition reveal impaired insulin secretion stimulated by glucose and other insulinotropic agents as well as lower expression of key proteins for b cell function. The literature shows that taurine supplementation increases insulin secretion and regulates calcium dynamics on b cells. Male, 21 days old, wistar rats received diet containing 17% (C) or 6% (D) of protein. Both groups received taurine supplementation on the drinking water for 30 (CT 30 and DT 30) and 90 (CT90 and DT 30) days. Next we assessed biometric and biochemical parameters, glucose tolerance, glucose and carbacholstimulated insulin secretion, protein expression of muscarinic M3 receptor, Phospholipase C b2, SERCA3, Syntaxin 1 and, finally, we registered cytoplasmic Ca2+ after stimulus with glucose and carbachol. Protein restricted rats showed lower body weight, plasma proteins (C = 6,81±0,04; CT30 = 7,15±0,54; CT90 = 6,87±0,19; D = 5,35±0,24; DT30 = 5,37±0,28; DT90 = 5,70±0,09 g/dl; n = 3-5), albumin (C = 3,20±0,11; CT30 = 3,41±0,02; CT90 = 3,18±0,05; D = 2,74±0,07; DT30 = 2,49±0,09; DT90 = 2,67±0,04 g/dl; n = 5-9) and increased glucose tolerance (C = 30249±2682; CT30 = 37255±6691; CT90 = 29365±2257; D = 16916±1609; DT30 = 18791±2859; DT90 = 23425±3856 AUC; n = 5-9). Taurine supplementation had no effect upon nutritional status parameters and partially restored glucose tolerance and insulinemia to C levels. Taurine increased secretory response to glucose and carbachol (C = 9,4+0,8; CT90 = 12,4+0,7; D = 6,4+0,5; DT90 = 9+0,7 ng/ml; n = 12). It also increased protein expression of M3 receptor (C = 100+24; CT90 = 155+80; D = 51+10; DT90 = 108+14 % of C; n = 5), SERCA 3 (C = 100+21; CT90 = 174+17; D =96+90; DT90 = 149+11 % of C; n = 6) and syntaxin 1 (C = 100+30; CT90 = 92+40; D = 50+12; DT90 = 77+11 % of C; n = 5). Finally, taurine supplementation for 90 days improved Ca2+ dynamics when the islets were stimulated with glucose. In conclusion, these data show that taurine supplementation restores secretory responsiveness to glucose and carbachol possibly through Ca2+ dynamics modulation and increased expression of key proteins for insulin secretion. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T15:50:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abrantes_JuliaLauraFernandes_M.pdf: 1271639 bytes, checksum: 76791cec4029d58aa9205ace9ab4b491 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Quando em excesso, a administração de glicocorticóides pode induzir hiperglicemia, fator que tem sido associado ao aumento do estresse oxidativo em diversos tecidos. No pâncreas endócrino, o estresse oxidativo tem sido relacionado à perda de função e massa de células P pancreáticas, contribuindo para o desenvolvimento do diabetes tipo 2. Por melhorar a sensibilidade à insulina e a capacidade antioxidante em diversos tecidos, o treinamento físico moderado poderia ser uma importante ferramenta na prevenção do estresse oxidativo em pâncreas endócrino. Para testar essa hipótese, o presente trabalho investigou o efeito do treinamento físico de intensidade moderada, realizado previamente a administração de dexametasona (DEX - 1mg/kg dep.c., durante 5 dias), sobre vários parâmetros metabólicos e sobre o estado redox de ilhotas pancreáticas de ratos. Quatro grupos experimentais foram utilizados: sedentário controle (SC), sedentário tratado com DEX (SD), treinado controle (TC) e treinado tratado com DEX (TD). O tratamento com DEX induziu hiperglicemia (níveis glicêmicos: 90.8 ± 3.9, 299.2 ± 24.3, 84.3 ± 2.9, 229.9 ± 19.2 mg/dL para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 10; P < 0.05), hipertrigliceridemia (níveis de triglicerídeos: 94.2 ± 4.3, 416.6 ± 54.3, 92.7 ± 6.0, 322.5 ± 48.7 mg/dL para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 5; P < 0.05) e hiperinsulinemia (níveis insulinêmicos: 1.10 ± 0.2, 23.01 ± 0.8, 1.21 ± 0.2, 21.66 ± 0.6 ng/mL para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 5; P < 0.05) de jejum em ratos SD e TD e resistência à insulina (RI) apenas em ratos SD (Taxa de decaimento da glicose - Kitt: 3 ± 0.2, 1.8 ± 0.1, 3.6 ± 0.2, 3.2 ± 0.4 para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 5; P < 0.05). Além disso, reduziu o conteúdo total de insulina (CT: 191.6 ± 21.5, 97.1 ± 17.1, 370.3 ± 46.5, 185.6 ± 16.3 ng/ilhota para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 10; P < 0.05) e aumentou os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) em ilhotas pancreáticas de ratos SD e TD vs respectivos controles (EROs: 2.8 mM de glicose: 41.3 ± 2.6, 54 ± 1.3, 23.4 ± 1.5, 38.9 ± 4 UF/ug proteína; 22 mM de glicose: 33.3 ± 1.7, 38.4 ± 0.5, 10.1 ± 1.6, 28 ± 1.2 UF/ug proteína para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 10; P < 0.05). Já o treinamento físico foi capaz de prevenir a RI e reduzir em 23% os níveis glicêmicos de jejum dos ratos TD vs SD. Foi observado, ainda, aumento no CT e na secreção de insulina estimulada por glicose (11.1mM) em ilhotas isoladas de ratos TC e TD (Secreção em 11.1 mM de glicose: 1.4 ± 0.2, 4.2 ± 0.2, 3.3 ± 0.2, 5.6 ± 0.5 ng/mL por ilhota por hora, para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 12; P < 0.05). Além disso, o treinamento físico induziu aumento no nível protéico da enzima antioxidante catalase (CAT: 100 ± 14.1, 113.8 ± 14.2, 151.6 ± 10.2, 183.2 ± 11.2, expresso como % SC, para SC, SD, TC, TD, respectivamente; n = 6; P < 0.05), bem como redução nos níveis de EROs em ilhotas de ratos TC e TD. Baseados nesses dados, nós sugerimos que o treinamento físico deva contribuir para melhora na homeostase glicêmica, além de aumentar a resistência de ilhotas pancreáticas ao estresse oxidativo. / Abstract: When in excess, glucocorticoid administration can induce hyperglycemia, which has been associated to increased oxidative stress in numerous tissues. In endocrine pancreas, the oxidative stress has been related to the loss of pancreatic P-cell function and mass, contributing to the development of type 2 diabetes. By improving the insulin sensitivity and the antioxidative capability in several tissues, moderate exercise training could be an important tool in the prevention of oxidative stress. To test this hypothesis, the present study aimed to investigate the effect of a moderate exercise training plan, executed previous to dexamethasone challenge (DEX - lmg/kg per b.w., for 5 days), on numerous metabolical parameters, as well as on the redox state of the pancreatic islets in rats. For this, four experimental groups were designed: sedentary control (SC), sedentary treated with DEX (SD); trained control (TC) and trained treated with DEX (TD). DEX treatment induced fasting hyperglycemia (blood glucose levels: 90.8 ± 3.9, 299.2 ± 24.3, 84.3 ± 2.9, 229.9 ± 19.2 mg/dL for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 10; P < 0.05), hypertriglyceridemia (blood triglyceride levels: 94.2 ± 4.3, 416.6 ± 54.3, 92.7 ± 6.0, 322.5 ± 48.7 mg/dL for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 5; P < 0.05) and hyperinsulinemia (blood insulin levels: 1.10 ± 0.2, 23.01 ± 0.8, 1.21 ± 0.2, 21.66 ± 0.6 ng/mL for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 5; P < 0.05) in SD and TD rats and insulin resistance (IR) only in SD rats (Rate for glucose disappearance - Kitt: 3 ± 0.2, 1.8 ± 0.1, 3.6 ± 0.2, 3.2 ± 0.4 for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 5; P < 0.05). Additionally, it reduced total insulin content (CT: 191.6 ± 21.5, 97.1 ± 17.1, 370.3 ± 46.5, 185.6 ± 16.3 ng/islet for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 10; P < 0.05) and increased reactive oxygen species levels (ROS) in pancreatic islets from SD and TD rats vs respective controls (ROS: 2.8 mMof glucose: 41.3 ± 2.6, 54 ± 1.3, 23.4 ± 1.5, 38.9 ± 4 UF/ug proteína; 22 mM of glucose: 33.3 ± 1.7, 38.4 ± 0.5, 10.1 ± 1.6, 28 ± 1.2 UF/ug protein for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 10; P < 0.05). Of note, the exercise training was able to prevent IR and to reduce by 23% the fasting blood glucose levels in TD vs. SD rats. Exercise training also induced an augmentation in CT and in insulin response to stimulating glucose concentration (11.1mM) in isolated islets from TC and TD rats (Insulin secretion in 11.1 mM of glucose: 1.4 ± 0.2, 4.2 ± 0.2, 3.3 ± 0.2, 5.6 ± 0.5 ng/mL per islet per hour, for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 12; P < 0.05).. Still, exercise training induced an increase in the catalase protein levels, an antioxidant enzyme (CAT: 100 ± 14.1, 113.8 ± 14.2, 151.6 ± 10.2, 183.2 ± 11.2, expressed as % SC, for SC, SD, TC, TD, respectively; n = 6; P < 0.05), as well as reduction in ROS levels in TC and TD islets. Based on these data, we suggest that the moderate exercise training may improve glucose homeostasis and prevent oxidative stress in pancreatic islets. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:11:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanzela_EmerielleCristine_D.pdf: 2535043 bytes, checksum: eee7b54cea5f470c5637de8c4b3385f5 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A obesidade atingiu proporções alarmantes constituindo-se num fator de risco para o desenvolvimento de várias doenças. O aumento da resistência periférica à insulina acompanha esta patologia e a incapacidade da célula beta pancreática em suprir a maior necessidade por insulina leva ao desenvolvimento de intolerância à glicose, hiperglicemia e diabetes. Por esta razão, é importante investigar mecanismos que tornem a célula beta capaz de aumentar sua capacidade secretória. A exemplo da obesidade, resistência periférica à insulina é também observada durante a prenhez. No entanto, neste caso, a célula beta é capaz de aumentar a produção e secreção do hormônio, mantendo a tolerância à glicose em condições adequadas. Diante disso,decidimos investigar a sensibilidade à insulina e a consequente resposta das células beta pancreáticas durante a prenhez em ratas obesas. Observamos que a alimentação com a dieta de cafeteria aumentou o ganho de peso, bem como os depósitos de gordura das ratas. Ratas obesas não-prenhes (Caf) e prenhes (CafP) apresentaram tolerância à glicose diminuída, associada a um aumento da insulina plasmática em resposta à sobrecarga de glicose no grupo CafP. Apesar disso, as glicemias de jejum e pós-prandial foram normais nos dois grupos. No entanto, as ratas Caf e CafP apresentaram hiperinsulinemia (jejum e alimentado), aumento do índice insulina/glicose e do AGL plasmático (alimentado). Ainda, houve redução na sinalização da insulina no fígado e músculo esquelético das ratas Caf e CafP, aos 15 e aos 19 dias de prenhez, de forma mais exacerbada do que a redução observada nas ratas controle prenhes. Em paralelo, as ilhotas isoladas das ratas Caf secretaram menos insulina em resposta a diferentes estímulos. Contudo, o conteúdo total de insulina, a secreção estimulada por PMA (ativador da PKC), a produção decompostos redutores e a oxidação de glicose, na presença de 11,1 mmol/L do açúcar, foram similares entre as ratas Caf e as controle não-prenhes. Entretanto, as ilhotas isoladas das ratas Caf apresentaram redução na mobilização do Ca2+ citoplasmático livre frente à glicose ou tolbutamida, acompanhada pela redução da expressão gênica da subunidade ?1.2 do canal de cálcio voltagem-dependente (CaVa1.2), e da Ca2+- ATPase do retículo endoplasmático tipo 2a. Independente da dieta, a prenhez aumentou a secreção de insulina em resposta à glicose, a produção de compostos redutores, a oxidação de glicose, a amplitude e a frequência das oscilações do Ca2+ citoplasmático e, a expressão gênica do CaVa1.2. Concluindo, a prenhez nas ratas obesas melhorou o manejo do Ca2+ e restaurou a secreção de insulina por ilhotas isoladas. Contudo, esta restauração não foi suficiente para vencer o aumento da resistência periférica à insulina e normalizar a tolerância à glicose nas ratas obesas / Abstract: The incidence of obesity reached alarming levels worldwide. This illness constitutes a risk factor for the development of several other diseases. The augmented peripheral insulin resistance accompanies this pathology, and the failure of the pancreatic beta cell to overcome the higher demand for insulin causes glucose intolerance, hyperglycemia and diabetes. For this reason, it became interesting to investigate mechanisms that make the beta cell capable to increases its secretory capacity. As obesity, peripheral insulin resistance is also observed during pregnancy. Nevertheless, in this situation, the beta cell is capable to enhance insulin production and release, maintaining glucose tolerance at adequate levels. Therefore, we decided to investigate insulin sensibility and the consequent beta cell response during pregnancy in obese rats. We observed that cafeteria diet enhanced weight gain and fat pads in rats. Despite no differences were noticed in obese non-pregnant (Caf) and pregnant (CafP) rats, during fast and fed states, the glucose tolerance was diminished in these rats, associated with an augmented plasma insulin levels in response to a glucose load inCafP rats. However, Caf and CafP rats had hyperinsulemia (fast and fed), higher insulin/glucose index, and enhanced plasma FFA (fed state). In addition, we observed a reduction in insulin signaling in liver and skeletal muscle from Caf and CafP rats, at15th and 19th days of pregnancy, higher than that registered in control pregnant rats. Also, there was a reduction in insulin secretion induced by different stimuli in is lets from Caf rats. However, total islet insulin content, PMA-stimulated insulin secretion, production of reducing equivalents, and glucose oxidation in the presence of 11.1mmol/L glucose, were similar between islets from Caf and non-pregnant control rats .Nevertheless, glucose- and tolbutamide-induced Ca2+ mobilization, a1.2 subunit of thevoltage sensitive Ca2+ channel (CaVa1.2), and sarcoendoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a gene expression were reduced in islets from Caf rats. Independently of the diet, pregnancy enhanced glucose stimulated insulin secretion, reducing equivalents production, glucose oxidation, amplitude and frequency of cytoplasm Ca2+ oscillations, and CaVa1.2 gene expression. In conclusion, although pregnancy improved Ca2+ handling and restored insulin secretion in cafeteria diet-induced obese rats, this restoration was not enough to overcome the increase in peripheral resistance and normalize glucose tolerance in these obese rats / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T23:23:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giozzet_VanessaAparecidaGoncalves_D.pdf: 2125921 bytes, checksum: 5e1d4923fcc0268442cc60af14fa58dd (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A desnutrição e a resistência periférica à insulina induzida por administração de glicocorticóides induzem compensações funcionais e morfológicas em ilhotas pan creáticas a fim de manter a homeostase glicêmica. Deste modo, investigamos as alterações desenvolvidas pelo tratamento com dexametasona (Dex) em animais submetidos à restrição protéica. Foram analisados: parâmetros metabólicos, secreção de insulina em resp osta a glicose e proteínas envolvidas na via de sinalização da insulina em ilhotas pancreáticas isoladas. Ratos submetidos à dieta hipoprotéica (LP) apresentaram características padrões que caracterizam a desnutrição como: diminuição de ganho de massa corp oral, redução dos níveis séricos de albumina, proteína total e insulina. Adicionalmente, os ratos LP exibiram aumento da sensibilidade periférica à insulina e redução da área das ilhotas pancreáticas comparadas ao grupo controle ( P < 0,05). Todos estes parâmetros apresentaram valores similares ao grupo controle nos ratos submetidos à dieta hipoprotéica e submetidos ao tratamento com Dex (LPD), exceto para o peso corpóreo ( P < 0,05). A secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos LPD aprese ntou maior responsividade à glicose, em níveis estimulatórios, comparados a secreção em ilhotas de ratos LP (P < 0,05). Paralelo aos resultados de secreção, os ratos LPD exibiram redução do conteúdo protéico de IRS-1, IRS-2 e aumento dos níveis protéicos d e p-FoxO1, p-ERK e PKC comparados ao grupo LP (P < 0,05). Concomitantemente, as ilhotas dos ratos LPD mostraram ¿se hipertrofiadas comparadas com ilhotas de ratos LP ( P < 0,05). Em conclusão, o tratamento com dexametasona reverte, ao menos parcialmente, os efeitos no metabolismo analisados e no funcionamento das ilhotas pancreáticas causados pela restrição protéica, confirmando a grande plasticidade das células ß frente a condições adversas facultativas e/ou permanentes / Abstract: Malnutrition caused by protein restriction and dexamethasone -induced insulin resistance, in vivo treatment (Dex) are conditions associated with morphological and functional alterations in pancreatic islets. Thus, the present study evaluated the dexamethasone treatment effects on the metabolic parameters, glucose-stimulated insulin secretion and proteins involved in the insulin - signalling pathway over low protein diet fed rats (LP). LP rats showed decrease in body weight, serum insulin, total serum protein, and serum albumin, patte rns that characterize the LP rats. Moreover, LP rats presented improved peripheral insulin sensibility and reduced islets area (P < 0,05). Except for the body weight (P < 0,05), all these parameters were proned to be normalized in rats exposed to a low protein diet and treated with dexamethasone (LPD), whose islets showed increased glucose stimulated insulin secretion (GSIS). In addition, LPD rats showed lower protein expression of IRS-1, IRS-2 and higher in p-FoxO1, p-ERK and PKC, while presenting pancreatic islet hypertrophy compared to LP rats islet. In conclusion, dexamethasone treatment revert the effects related to metabolism and islet function caused by diet protein restriction, confirming ß-cells wide plasticity, even in transient or lasting adverse conditions / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

O transplante (Tx) de ilhotas pancreáticas (IP) é uma atraente alternativa para o tratamento do diabetes melito tipo 1. No entanto, para evitar a rejeição há necessidade de imunossupressão. Uma nova idéia de tolerância surge a partir do paradoxo imunológico, onde a mãe, imunologicamente competente, não rejeita o embrião durante a gravidez. Uma das hipóteses é que células da placenta expressam a molécula IDO, a qual protege o embrião do ataque imunológico materno. O objetivo do estudo foi analisar o efeito da indução da expressão da IDO em IP em transplante experimental de IP. Para tanto, as seguintes etapas de padronização foram necessárias. Etapa 1: Padronização da perfusão e digestão do tecido pancreático de rato e determinação do método para a purificação das IP, comparando-se diferentes gradientes de densidade: descontínuo de Ficoll, contínuo de Ficoll e contínuo de iodixanol. Foi demonstrado que o gradiente contínuo de iodixanol fornece maior pureza e maior número de IP íntegras e funcionais. Etapa 2: Padronização do Tx experimental de IP sob a cápsula renal para avaliação do número mínimo de IP transplantadas para reverter o diabetes induzido por estreptozotocina, definido como glicemia >300mg/Kg. Foram transplantadas entre 200 a 3.000 IP por experimento. A rejeição das IP foi analisada pela sobrevida das IP (permanência da glicemia <300mg/dL), tanto em Tx isogênico (Lewis-Lewis) como em alogênico (Sprague-Dawley-Lewis). Para reverter o diabetes foram necessárias no mínimo 2.500 IP. No transplante entre ratos isogênicos (n=6) não houve rejeição das IP. Já no transplante entre animais alogênicos (n=12), as IP apresentaram uma curta sobrevida pós-Tx (11±1 dias; p<0,01 vs. Tx isogênico). Dez dias pós-Tx, houve um grande infiltrado de macrófagos e linfócitos T no enxerto alogênico e uma diminuição significativa da expressão de insulina (p<0,001 vs. Tx isogênico). Etapa 3: Construção do vetor de expressão para IDO. A partir de RNA extraído de placenta de rata no 10º dia de gestação, foi amplificada a seqüência completa do cDNA para IDO, utilizando-se RT-PCR. Em seguida, o cDNA para IDO foi inserido em vetor de expressão (vetor-IDO). Etapa 4: Transfecção do vetor-IDO nas IP. O vetor-IDO foi introduzido nas IP através de lipofecção (Lipofectamina 2000), testando-se diferentes concentrações do vetor-IDO (0, 0,5, 1 e 10 ng/uL) e diferentes períodos de incubação (1h, 15h e 24h). A expressão de IDO nas IP foi confirmada por RT-PCR e imuno-histoquímica. A incubação com 10 ng/uL de vetor-IDO durante 24h foi eficaz para induzir a expressão de IDO nas IP, confirmada a nível de RNAm (RT-PCR) e de proteína (imuno-histoquímica). A eficiência da transfecção em nível funcional foi confirmada pela degradação de triptofano em cultura (dosagem de triptofano por HPLC). Etapa 5: Onze transplantes alogênicos (Sprague-Dawley-Lewis) com IP transfectadas com vetor-IDO foram realizados para analisar o efeito da IDO. Três animais foram sacrificados para análise de imuno-histoquímica e 8 animais foram acompanhados por 45 dias. A sobrevida das IP transfectadas com vetor-IDO foi significativamente maior comparada com a sobrevida de IP não-transfectadas (p<0,01). O estudo conclui que a expressão da IDO protege as IP aumentando a sobrevida das IP. / Transplantation (Tx) of pancreatic islets (PI) is an attractive alternative of treatment for type 1 diabetes mellitus. However, continuous immunossupression is necessary in order to avoid allograft rejection. A new idea of tolerance is based on the immunological paradox, during pregnancy, in that the mother, immunologically competent, does not reject the semi-allogeneic fetus. The hypothesis is that the placenta produces IDO molecules, which protect the embryos against the maternal immunologic attack. The aim of this study was to analyze the effect of the induction of the IDO expression into PI in an experimental model of PI transplantation. The following steps for standardization were necessary. Step 1: Besides the standardization of the rat pancreas perfusion and digestion, the best method for purification of the PI was determined, comparing several density gradients: Ficoll discontinuous, Ficoll continuous and iodixanol continuous. The iodixanol continuous gradient was able to provide high purity and a high number of intact and functional PI. Step 2: The transplantation of the PI between rats was established determining the minimal number of PI to reverse the diabetes (glycemia > 300mg/dL) induced by streptozotocin. In addition, the rejection was analyzed by PI survival (time with glycemia <300mg/dL) in syngeneic (Lewis-Lewis) and allogeneic (Sprague-Dawley-Lewis) transplantation. To reverse the diabetes at least 2,500 PI were necessary. Transplantation between syngenic rats (n=6) disclosed no rejection of the PI. In the allogeneic transplantation (n=12), the PI had a short survival (11±1 days). Ten days post-Tx, a higher number of macrophages and T lymphocytes were observed in the grafts, accompanied by very low insulin expression. Step 3: The expression vector for IDO was constructed from RNA extracted from rat placenta. RT-PCR was carried out to amplify the IDO cDNA, which was inserted into expression vector (IDO vector). Step 4: The IDO vector was introduced into PI through lipofection (Lipofectamine 2000) analyzing several concentrations of the IDO vector (0, 0.5, 1.0 and 10 ng/uL) and several periods of incubation (1h, 15h e 24h). The IDO expression in PI was confirmed by RT-PCR and immunohistochemistry. The incubation with 10 ng/uL of IDO vector during 24h was efficient to induce IDO expression in PI. The function of the IDO was confirmed by tryptofan degradation in culture (measurement of tryptofan by HPLC). Step 5: Eleven allogenic transplants (Sprague-Dawley to Lewis) of PI expressing IDO were performed to analyze the effect of the IDO in the rejection. Eight animals were accompanied for 45 days, whereas three were sacrificed after 10 days for immunohistochemistry analysis. Finally, the survival of the PI expressing IDO was significantly higher than nontransfected PI. The study concludes that the induction of the IDO into PI protects the PI increasing the PI survival.

A privação dos hormônios sexuais, natural ou induzida, contribui para o aparecimento de diversas desordens metabólicas e endócrinas. Esse estudo investigou se a suplementação em dose única com DHEA, esteróide mais abundante em humanos, melhora a sensibilidade à insulina, bem como sua secreção e ou tolerância à glicose em ratas castradas alimentadas com dieta hiperlipídica (OHL). A castração induziu a perda da proteção fisiológica das fêmeas contra o ganho de peso. O tratamento com DHEA não promoveu alterações sobre esse parâmetro, porém, corrigiu a elevação na concentração de insulina plasmática e o índice HOMA IR, além da constante de decaimento de glicose, kitt. Os animais castrados apresentaram aumento da área da ilhota. DHEA não alterou essa condição. No entanto, as ilhotas das ratas tratadas com DHEA apresentaram aumento do grau de fosforilação da proteína Akt e melhora da capacidade secretória estática de insulina. Esse estudo sugere o uso do DHEA como alternativa protetora sobre a sensibilidade a insulina em fêmeas desprovidas de ovários. / Natural and induced privation of sexual hormones contributes to the development of several metabolic and endocrine disorders. The present study evaluated if DHEA supplementation, the most abundant steroid in humans, would improve the insulin sensitivity and secretion as well as the glucose tolerance, in high fat diet fed ovariectomized rats (OHL). Ovariectomy (OVX) reduced the physiological female protection against the weight gain. Although no effect upon adipose depot-specific action of DHEA has been found, DHEA has corrected the blood insulin levels and HOMA IR. In addition, DHEA has improved peripheral insulin action by the glucose disappearance rate, kitt. The islets area was increased in all ovariectomized groups. Pancreatic islets from DHEA-treated rats showed an increased in the Akt serine phosphorylation status and restored glucose-stimulated insulin secretion. Our results suggest that DHEA can promote protective effects by increasing the insulin sensitivity in females castrated rats exposed to health risk factors.