Resumo: A Leishmaniose visceral canina (LVC), conhecida como calazar, é uma antropozoonose endêmica no Brasil, causada pela Leishmania L. chagasi. O teste sorológico de ELISA tem sido empregado na rotina de inquéritos epidemiológicos e no auxílio diagnóstico clínico de cães suspeitos. O método de ensaio imunoenzimático em fase sólida (ELISA) usando o antígeno total de Leishmania L. chagasi (ELISA-AgT), assim como, o ELISA - Ligante de Fucose e Manose (ELISA-FML), tem demonstrado boa sensibilidade e especificidade para detectar a doença em cães assintomáticos e oligossintomáticos. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois antígenos pelo método de ELISA no sorodiagnóstico de cães naturalmente infectados pela LVC, positivos no exame parasitológico, e agrupados em: grupo sintomático e, grupo oligossintomáticos, tendo como grupo controle cães de área não endêmica. Nos animais oligossintomáticos, a sensibilidade observada para ELISA-AgT foi de 86,7%, já para o método ELISA-FML apresentou valor de 90%. A especificidade foi de 100% no método de ELISA-AgT e 96,7 % para o ELISA-FML. Nos animais sintomáticos, a sensibilidade e especificidade para o ELISA-AgT foram de 90% e 93,3%, respectivamente; já o método de ELISA-FML apresentou sensibilidade e especificidade de 86,7% e 96,7%. No teste ELISA-AgT o valor preditivo positivo foi de 93,1% nos sintomáticos e 100% nos oligossintomáticos, enquanto que nos animais submetidos ao teste ELISA-FML, foi observado 96,3% para os sintomáticos e 96,4% para os oligossintomáticos. O índice Kappa foi utilizado para medir o grau de concordância real entre os dois métodos imunoenzimáticos empregados e o exame parasitológico direto, mostrando boa concordância entre os métodos realizados. / Abstract: Visceral canine leishmaniasis or calazar is Brazilian an endemic antropozoonosis caused by Leishmania L. chagasi. ELISA sorologycal test has been used in routine of epidemiological studies and in diagnosis of clinical suspect dogs. The immunoenzymatic assay in solid phase (ELISA) using Leishmania L. chagasi total antigens AgT-ELISA and Fucose Manose ligant-ELISA (FML-ELISA) has been showed good sensibility and specificity for detection disease in asymptomatic and oligosymptomatic dogs. The present paper has the goal of compare the efficiency of two antigens by ELISA methods in dogs naturally affect by leishmaniasis with positive parasitological exam and grouped by symptoms. Group composed by symptomatic dogs, and Group by oligosymptomatic dogs. Control group was constituted of dogs from Leishmania free areas. Dogs of Group oligosymptomatics presented 86,7% of sensibility in AgT-ELISA and 90% at FML-ELISA. The specificity was 100% at AgT-ELISA and 96.7% for FML-ELISA. At Group symptomatics the sensibility and specificity for AgTELISA and FML-ELISA were respectively 90% and 93.3% and, the FMLELISA showed 86.7% and 96.7% corresponding to sensibility and specificity. On ELISA-AgT the positive predictive valor was 93.1% at symptomatic and 100% at oligosymptomatic, moreover in the dogs tested by FML-ELISA the valor was 96.3% for the symptomatic and 96.4% for oligosymptomatics. The Kappa was used and showed a good concordance between both methods tested. Our results had shown that in oligosymptomatics animals the FML-ELISA presented greater sensitivity, while that, in the symptomatic animals, the AgT-ELISA showed more sensible in the detention of positive. / Orientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Coorientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Marcia Dalastra Laurenti / Banca: Gisele Fabrino Machado / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-05Bitstream added on 2014-06-13T19:53:39Z : No. of bitstreams: 1 candido_tc_me_araca.pdf: 695625 bytes, checksum: 2f5b5c66c41e1d07fc364672891e34d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Leishmaniose visceral canina (LVC), conhecida como calazar, é uma antropozoonose endêmica no Brasil, causada pela Leishmania L. chagasi. O teste sorológico de ELISA tem sido empregado na rotina de inquéritos epidemiológicos e no auxílio diagnóstico clínico de cães suspeitos. O método de ensaio imunoenzimático em fase sólida (ELISA) usando o antígeno total de Leishmania L. chagasi (ELISA-AgT), assim como, o ELISA - Ligante de Fucose e Manose (ELISA-FML), tem demonstrado boa sensibilidade e especificidade para detectar a doença em cães assintomáticos e oligossintomáticos. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois antígenos pelo método de ELISA no sorodiagnóstico de cães naturalmente infectados pela LVC, positivos no exame parasitológico, e agrupados em: grupo sintomático e, grupo oligossintomáticos, tendo como grupo controle cães de área não endêmica. Nos animais oligossintomáticos, a sensibilidade observada para ELISA-AgT foi de 86,7%, já para o método ELISA-FML apresentou valor de 90%. A especificidade foi de 100% no método de ELISA-AgT e 96,7 % para o ELISA-FML. Nos animais sintomáticos, a sensibilidade e especificidade para o ELISA-AgT foram de 90% e 93,3%, respectivamente; já o método de ELISA-FML apresentou sensibilidade e especificidade de 86,7% e 96,7%. No teste ELISA-AgT o valor preditivo positivo foi de 93,1% nos sintomáticos e 100% nos oligossintomáticos, enquanto que nos animais submetidos ao teste ELISA-FML, foi observado 96,3% para os sintomáticos e 96,4% para os oligossintomáticos. O índice Kappa foi utilizado para medir o grau de concordância real entre os dois métodos imunoenzimáticos empregados e o exame parasitológico direto, mostrando boa concordância entre os métodos realizados. / Visceral canine leishmaniasis or calazar is Brazilian an endemic antropozoonosis caused by Leishmania L. chagasi. ELISA sorologycal test has been used in routine of epidemiological studies and in diagnosis of clinical suspect dogs. The immunoenzymatic assay in solid phase (ELISA) using Leishmania L. chagasi total antigens AgT-ELISA and Fucose Manose ligant-ELISA (FML-ELISA) has been showed good sensibility and specificity for detection disease in asymptomatic and oligosymptomatic dogs. The present paper has the goal of compare the efficiency of two antigens by ELISA methods in dogs naturally affect by leishmaniasis with positive parasitological exam and grouped by symptoms. Group composed by symptomatic dogs, and Group by oligosymptomatic dogs. Control group was constituted of dogs from Leishmania free areas. Dogs of Group oligosymptomatics presented 86,7% of sensibility in AgT-ELISA and 90% at FML-ELISA. The specificity was 100% at AgT-ELISA and 96.7% for FML-ELISA. At Group symptomatics the sensibility and specificity for AgTELISA and FML-ELISA were respectively 90% and 93.3% and, the FMLELISA showed 86.7% and 96.7% corresponding to sensibility and specificity. On ELISA-AgT the positive predictive valor was 93.1% at symptomatic and 100% at oligosymptomatic, moreover in the dogs tested by FML-ELISA the valor was 96.3% for the symptomatic and 96.4% for oligosymptomatics. The Kappa was used and showed a good concordance between both methods tested. Our results had shown that in oligosymptomatics animals the FML-ELISA presented greater sensitivity, while that, in the symptomatic animals, the AgT-ELISA showed more sensible in the detention of positive.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi são considerados um dos melhores modelos para estudo de fatores relacionados à imunossupressão que ocorre durante a leishmaniose visceral ativa, pois apresenta manifestações clínicas similares ao que ocorre no homem e não conseguem controlar a infecção. Neste estudo, hamsteres infectados intraperitonealmente com 2x107 parasitos foram utilizados para avaliação de possíveis fatores envolvidos na dinâmica da imunossupressão. Os parâmetros avaliados foram a produção de citocinas de padrão Th1 e Th2, produção de óxido nítrico por células esplênicas e detecção de apoptose em linfócitos esplênicos em tempos precoces (6, 20, 48 e 72 horas), intermediários (7 e 15 dias) e tardios (30 e 60 dias) de infecção. Inicialmente avaliamos a carga parasitária no baço e observamos aumento progressivo dependente do tempo de infecção, ratificando que hamster infectado é um bom modelo para desenvolvimento de doença. A resposta celular frente a mitógeno e antígeno de Leishmania foi o parâmetro utilizado para avaliação de imunossupressão. Observamos resposta preservada à concanavalina A em todos os tempos de infecção e resposta preservada ao antígeno de Leishmania nos tempos precoces, porém com ausência de resposta antígeno específica a partir do tempo de 7 dias de infecção. A quantificação de óxido nítrico foi determinada em sobrenadante de células esplênicas de cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania, pelo método de Griess. Observamos inicialmente baixo nível de produção de óxido nítrico em todos os tempos de infecção, no entanto quando as células foram estimuladas com antígeno de Leishmania observamos níveis ainda menores nos tempos de 48 e 72 horas de infecção. O perfil de citocinas produzido foi determinado pela reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa, sendo detectado RNA mensageiro tanto de citocinas Th1, quanto Th2 em todos os tempos de infecção (precoce, intermediária e tardia), em células ex-vivo e estimuladas; e também em animais controles não infectados; não havendo um padrão de dicotomização de produção de citocinas neste modelo experimental. Detecção de apoptose em células esplênicas não aderentes (prováveis linfócitos T) ex-vivo e em cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania foi avaliada pelos seguintes métodos: Anexina V, caspase 3 clivada e TUNEL por citometria de fluxo. Houve marcação da exposição de fosfatidil serina pelo método da anexina V, nos tempos de 6 horas de infecção, quando as células foram estimuladas com mitogeno ou antígeno de Leishmania; e com 48 horas e 60 dias de infecção somente quando estimuladas com antígeno de Leishmania. Em células esplênicas em cultura estimuladas com concanavalina não houve marcação de caspase 3 clivada, porém em células esplênicas ex-vivo nos tempos 20, 48 e 72 horas de infecção houve detecção de apoptose, definida por marcação de caspase 3 clivada. A marcação de células esplênicas não aderentes para quebra de DNA foi baixa em todos os tempos analisados, porém observamos aumento de marcação em células esplênicas não aderentes, estimuladas com antígeno nos tempos de 20 horas e posteriormente de 7 dias até 60 dias de infecção. Nossos resultados sugerem que a imunossupressão na leishmaniose visceral no modelo de hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi é antígeno dependente e instala-se nos tempos intermediários de infecção, a partir de 7 dias. Esta imunossupressão parece estar relacionada com aumento de apoptose em linfócitos já nos tempos precoces de infecção, que pode favorecer a progressão da infecção, por ocorrer principalmente em células esplênicas antígenos reativas. Nossos dados sugerem ainda, que a imunossupressão não é decorrente da dicotomização da produção de citocinas Th1 e Th2 / Hamsters infected by Leishmania (L.) chagasi are considered one of the most remarkable models to study several characteristics related to immunosuppression, raised during active visceral leishmaniasis especially because hamsters show similar clinical manifestations as it is found in humans without surmounting the infection. In this study, hamsters infected intraperitoneally with 2x107 parasites were used to evaluate the possible factors involved in the dynamic of immunosuppression that occurs during the disease development. The evaluated parameters were the production of Th1 and Th2 cytokines profile, nitric oxide production of splenic cells and detection of apoptosis in splenic lymphocytes at early (6,20, 48 e 72 hours), intermediate (7 e 15 days) and late times (30 e 60 days) of infection. Initially, we evaluate the parasite load in the spleen and observed a progressive increase dependent on the time of infection, ratifying that infected hamsters are good models to set up the disease development. Cellular response upon mitogen or Leishmania antigen was the parameter used to evaluate the immunosuppression showing a preserved response to concanavalin A at all period of infection and a preserved response to the Leishmania antigen at all early phases however with no specific antigen response from 7 day of infection until the late phase of infection. Nitric oxide quantification was determined in the splenic cells supernatant in culture stimulated upon concanavalin A and Leishmania antigen and we observed initially low level of nitric oxide production, measured by the Griess method. Nonetheless, when the cells were stimulated upon Leishmania antigen we observed a lower level nitric oxide production at 48 and 72 hours of infection. mRNA of Th1 e Th2 cytokines profile was determined by RT-PCR at all period of infection studied in infected or non infected hamsters showing no difference at the cytokine profile in this experimental model. Detection of apoptosis in the non adherent splenic cells (probably T lymphocytes) ex-vivo and in the stimulated culture with concanavalin A and Leishmania antigen was evaluated by the following methods: annexin V-FITC, cleaved caspase 3 and TUNEL by flow cytometry analysis. There was phosphatidilserine staining by annexin method, at 6 hour of infection when cells were stimulated by mitogen or Leishmania antigen at 48 hours and 60 days of infection only when stimulated by Leishmania antigen. Splenic cells in culture stimulated by concanavalin A showed no cleaved caspase 3 staining in all period of infection studied. Otherwise, apoptosis was detected in the ex-vivo splenic cells at 20, 48 and 72 hours of infection by cleaved caspase 3 staining. We observed a low DNA break staining of non adherent splenic cells in all period analyzed, although this staining was increased in non adherent cells stimulated upon Leishmania antigen at 20 hours from 7 day of infection until 60 day of infection. Our results suggest that a visceral leishmaniasis immunosuppression in the hamsters model infected by Leishmania (L.) chagasi is antigen dependent and sets up in the intermediate phases of infection from 7 days on. This immunosuppression seems to be related to the apoptosis increase in lymphocytes already in the early period of infection probably favoring its progression especially because of its occurrence in reactive splenic antigen. Our data also suggest that the immunosuppression is not provided by dichotomization in the Th1 and Th2 cytokines profile

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-23Bitstream added on 2014-06-13T18:31:15Z : No. of bitstreams: 1 boraschi_css_me_araca.pdf: 289037 bytes, checksum: b95c02a6d8122e8e60723dae0639d0e0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral (LV) é um importante problema de saúde pública e as medidas de prevenção preconizadas nem sempre são conhecidas pela população. Esta pesquisa avaliou, por meio da aplicação de um questionário, o conhecimento que a população de Três Lagoas, MS tem sobre esta zoonose. Dos 384 entrevistados, 100% afirmaram que já tinham conhecimento prévio da LV, 64,5% sabiam que é transmitida através do inseto vetor e 65,4% sabiam que a prevenção se dá evitando o criadouro deste. Observaram-se 93,5% de respostas para manutenção do quintal limpo como medida preventiva conhecida. Pelo menos um método de prevenção era utilizado no animal por 50,5% dos entrevistados e observou-se associação estatisticamente significante entre o grupo de proprietários cujos cães nunca apresentaram leishmaniose visceral canina e o grupo que fazia uso de alguma prevenção no animal (p=0,0006). / Visceral Leishmaniasis (VL) is an important public health problem and the measures to prevent it are not always known by the population. This research evaluated the knowledge that the population of Três Lagoas, MS, Brazil has about this zoonosis. One hundred percent of the interviewed (384) had previous knowledge of the disease, 64.5% knew that a vector transmits it and 65.4% knew that the prevention is achieved by preventing vector’s breeding sites. Maintenance of the backyard clean was informed by 93,5% as a known preventive measure. At least one preventive method was used in the animal by 51% of the interviewed ones and statically significant association between the group of owners whose dogs had never presented canine visceral leishmaniasis and owners that used some preventive method in the animal (p=0.0006) was observed.

Hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi são considerados um dos melhores modelos para estudo de fatores relacionados à imunossupressão que ocorre durante a leishmaniose visceral ativa, pois apresenta manifestações clínicas similares ao que ocorre no homem e não conseguem controlar a infecção. Neste estudo, hamsteres infectados intraperitonealmente com 2x107 parasitos foram utilizados para avaliação de possíveis fatores envolvidos na dinâmica da imunossupressão. Os parâmetros avaliados foram a produção de citocinas de padrão Th1 e Th2, produção de óxido nítrico por células esplênicas e detecção de apoptose em linfócitos esplênicos em tempos precoces (6, 20, 48 e 72 horas), intermediários (7 e 15 dias) e tardios (30 e 60 dias) de infecção. Inicialmente avaliamos a carga parasitária no baço e observamos aumento progressivo dependente do tempo de infecção, ratificando que hamster infectado é um bom modelo para desenvolvimento de doença. A resposta celular frente a mitógeno e antígeno de Leishmania foi o parâmetro utilizado para avaliação de imunossupressão. Observamos resposta preservada à concanavalina A em todos os tempos de infecção e resposta preservada ao antígeno de Leishmania nos tempos precoces, porém com ausência de resposta antígeno específica a partir do tempo de 7 dias de infecção. A quantificação de óxido nítrico foi determinada em sobrenadante de células esplênicas de cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania, pelo método de Griess. Observamos inicialmente baixo nível de produção de óxido nítrico em todos os tempos de infecção, no entanto quando as células foram estimuladas com antígeno de Leishmania observamos níveis ainda menores nos tempos de 48 e 72 horas de infecção. O perfil de citocinas produzido foi determinado pela reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa, sendo detectado RNA mensageiro tanto de citocinas Th1, quanto Th2 em todos os tempos de infecção (precoce, intermediária e tardia), em células ex-vivo e estimuladas; e também em animais controles não infectados; não havendo um padrão de dicotomização de produção de citocinas neste modelo experimental. Detecção de apoptose em células esplênicas não aderentes (prováveis linfócitos T) ex-vivo e em cultura estimuladas com concanavalina A e antígeno de Leishmania foi avaliada pelos seguintes métodos: Anexina V, caspase 3 clivada e TUNEL por citometria de fluxo. Houve marcação da exposição de fosfatidil serina pelo método da anexina V, nos tempos de 6 horas de infecção, quando as células foram estimuladas com mitogeno ou antígeno de Leishmania; e com 48 horas e 60 dias de infecção somente quando estimuladas com antígeno de Leishmania. Em células esplênicas em cultura estimuladas com concanavalina não houve marcação de caspase 3 clivada, porém em células esplênicas ex-vivo nos tempos 20, 48 e 72 horas de infecção houve detecção de apoptose, definida por marcação de caspase 3 clivada. A marcação de células esplênicas não aderentes para quebra de DNA foi baixa em todos os tempos analisados, porém observamos aumento de marcação em células esplênicas não aderentes, estimuladas com antígeno nos tempos de 20 horas e posteriormente de 7 dias até 60 dias de infecção. Nossos resultados sugerem que a imunossupressão na leishmaniose visceral no modelo de hamsteres infectados com Leishmania (L.) chagasi é antígeno dependente e instala-se nos tempos intermediários de infecção, a partir de 7 dias. Esta imunossupressão parece estar relacionada com aumento de apoptose em linfócitos já nos tempos precoces de infecção, que pode favorecer a progressão da infecção, por ocorrer principalmente em células esplênicas antígenos reativas. Nossos dados sugerem ainda, que a imunossupressão não é decorrente da dicotomização da produção de citocinas Th1 e Th2 / Hamsters infected by Leishmania (L.) chagasi are considered one of the most remarkable models to study several characteristics related to immunosuppression, raised during active visceral leishmaniasis especially because hamsters show similar clinical manifestations as it is found in humans without surmounting the infection. In this study, hamsters infected intraperitoneally with 2x107 parasites were used to evaluate the possible factors involved in the dynamic of immunosuppression that occurs during the disease development. The evaluated parameters were the production of Th1 and Th2 cytokines profile, nitric oxide production of splenic cells and detection of apoptosis in splenic lymphocytes at early (6,20, 48 e 72 hours), intermediate (7 e 15 days) and late times (30 e 60 days) of infection. Initially, we evaluate the parasite load in the spleen and observed a progressive increase dependent on the time of infection, ratifying that infected hamsters are good models to set up the disease development. Cellular response upon mitogen or Leishmania antigen was the parameter used to evaluate the immunosuppression showing a preserved response to concanavalin A at all period of infection and a preserved response to the Leishmania antigen at all early phases however with no specific antigen response from 7 day of infection until the late phase of infection. Nitric oxide quantification was determined in the splenic cells supernatant in culture stimulated upon concanavalin A and Leishmania antigen and we observed initially low level of nitric oxide production, measured by the Griess method. Nonetheless, when the cells were stimulated upon Leishmania antigen we observed a lower level nitric oxide production at 48 and 72 hours of infection. mRNA of Th1 e Th2 cytokines profile was determined by RT-PCR at all period of infection studied in infected or non infected hamsters showing no difference at the cytokine profile in this experimental model. Detection of apoptosis in the non adherent splenic cells (probably T lymphocytes) ex-vivo and in the stimulated culture with concanavalin A and Leishmania antigen was evaluated by the following methods: annexin V-FITC, cleaved caspase 3 and TUNEL by flow cytometry analysis. There was phosphatidilserine staining by annexin method, at 6 hour of infection when cells were stimulated by mitogen or Leishmania antigen at 48 hours and 60 days of infection only when stimulated by Leishmania antigen. Splenic cells in culture stimulated by concanavalin A showed no cleaved caspase 3 staining in all period of infection studied. Otherwise, apoptosis was detected in the ex-vivo splenic cells at 20, 48 and 72 hours of infection by cleaved caspase 3 staining. We observed a low DNA break staining of non adherent splenic cells in all period analyzed, although this staining was increased in non adherent cells stimulated upon Leishmania antigen at 20 hours from 7 day of infection until 60 day of infection. Our results suggest that a visceral leishmaniasis immunosuppression in the hamsters model infected by Leishmania (L.) chagasi is antigen dependent and sets up in the intermediate phases of infection from 7 days on. This immunosuppression seems to be related to the apoptosis increase in lymphocytes already in the early period of infection probably favoring its progression especially because of its occurrence in reactive splenic antigen. Our data also suggest that the immunosuppression is not provided by dichotomization in the Th1 and Th2 cytokines profile

Orientador: Ana Carla Pereira Latini / Resumo: A leishmaniose é uma doença antropozoonótica causada pelo protozoário do gênero Leishmania. Ele apresenta três formas clínicas, conhecidas como leishmaniose visceral, leishmaniose cutânea e leishmaniose mucocutânea. A leishmaniose visceral afeta dois milhões de indivíduos anualmente no mundo. Os fato res genéticos envolvidos na interação hospedeiro - parasita foram associados ao desfecho clínico da doença. Este estudo investigou pela primeira vez a associação de polimorfismos nos genes candidatos IL10, NOD2 e TLR1 com leishmaniose visceral na população b rasileira. Para isso, escolhemos três marcadores anteriormente associados a infecções causadas por parasitas intracelulares na população brasileira. Nós genotipificamos 135 pacientes e 380 controles saudáveis. A presença do alelo G do rs4833095 no gene TLR 1 foi fortemente associada à susceptibilidade a esta doença: análise do alelo G (OR 2.04; IC 1.22 - 3.39; p - value 0.0061); Análise do genótipo GG (OR 3,87; 95 %IC 1,85 - 8,08, p - valor 0,0003); Análise de portadores de G (OR 2,5; 95 %IC 1,33 - 5,00; valor p 0,0047) . Para o gene NOD2, também encontramos uma associação para o genótipo AA (OR 2.07 95 %IC 1.05 - 4.05, p - value 0.0335) do polimorfismo rs8057341. Finalmente, poderíamos confirmar a associação do marcador rs1800871 na região promotora do gene IL10 com susceptib ilidade à leishmaniose visceral, para o genótipo TT (OR 2,34; CI 95 %IC 1,11 - 4,94 p - value 0,0245). Conclusão. Nossos dados demonstram pela primeira... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Not available / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Felix Lima / Resumo: O cão tem sido alvo do controle da Leishmaniose Visceral (LV), pois são reservatórios potenciais de Leishmania infantum e desempenham um papel fundamental na cadeia epidemiológica da doença no homem. Portanto, o diagnóstico da leishmaniose canina (Lcan) no Brasil tem sido um desafio para os órgãos de controle de endemias, uma vez que apresentam limitações quanto à sensibilidade e especificidade em áreas endêmicas. Nesta perspectiva a presente pesquisa objetivou desenvolver e validar um ELISA plasmônica indireto rK28 (pELISA) para o diagnóstica da Lcan. Para o desenvolvimento do pELISA, foram realizados diferentes ensaios de otimização, determinação das concentrações ideais de peróxido de hidrogênio, íons ouro, anticorpo IgG anti-dog biotinilado e também do soro. Para a validação do ensaio, 170 amostras de soro de cães de área endêmica para Lcan e 26 amostras de cães saudáveis de área não endêmica para a doença foram testadas pelo pELISA e comparadas com ELISA indireto rk28 e com o teste imunocromatográfico (Dual Path Platform, TR_DPP®) usando como teste padrão-ouro o qPCR em amostras de sangue e/ou swab de subconjuntival. O ensaio foi padronizado com as concentrações de 250 μM de peróxido de hidrogênio, 0,30 mM de íons ouro e a melhor diluição do conjugado de estreptavidina-catalase foi de 1/50. O TR_DPP®, ELISA indireto rK28 e pELISA apresentaram sensibilidade de 79,0%, 89,5% e 94,7% e especificidade de 90,1%, 91,4% e 100,0%, respectivamente. Os maiores valores preditivos po... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dogs have been the target of control of Visceral Leishmaniasis (VL) in humans, as they are potential reservoirs of Leishmania infantum and play a key role in the epidemiological chain of the disease. Therefore, the diagnosis of Canine Leishmaniasis (CanL) in Brazil has been a challenge for endemic control organs, since they have limitations on sensitivity and specificity in endemic areas. In this perspective the present research aimed to develop and validate an indirect plasmonic ELISA rK28 (pELISA) for the diagnosis of CanL. For the development of pELISA, different concentrations of hydrogen peroxide, gold ions, biotinylated anti-dog IgG antibody and serum were tested in order to establish ideal values to each parameter. For the validation of the assay, 170 dog serum samples from endemic area to CanL and 26 healthy dog samples from an area nonendemic to the disease were tested by pELISA and compared with indirect ELISA rk28 and the imunocromatografic test (Dual Path Platform, TR_DPP®) using as gold standard assay the real-time PCR in blood samples and/or subconjunctival swab. The assay was standardized with the concentrations of 250 μM hydrogen peroxide, 0.30 mM gold ions, and dilution of the streptavidin-catalase conjugate of 1/50. The TR_DPP®, indirect ELISA rK28 and pELISA presented sensitivity of 79.0%, 89.5% and 94.7% and specificity of 90.1%, 91.4% and 100%, respectively. The highest predictive positive (100%), negative (99.3%) and accuracy (99.4%) values were observed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A patogenia na leishmaniose visceral (LV) não é totalmente conhecida. Em LV em hamsteres avaliamos a participação de imunoglobulinas nas lesões. IgG foi detectada no sinusóide hepático, nos septos pulmonares e nos capilares glomerulares, em maior intensidade aos 30 e 45 dias pós-infecção (PI); C3 estava ausente, exceto no rim. Os dados não sendo compatíveis com a deposição de imunocomplexo, estudamos ultraestruturalmente a internalização de imunoglobulinas. No fígado e no rim a quantidade de imunoglobulina em célula endotelial era maior aos 30 dias PI em relação ao controle não infectado e no pulmão, aos 30 dias PI em relação aos 60 dias PI. Imunoglobulina internalizada por célula endotelial observada neste estudo na LV em hamsteres, marcadamente aos 30 dias PI, pode ser um mecanismo alternativo de lesão na LV / Pathogenesis of visceral leishmaniasis (VL) is not fully known. In VL in hamsters we evaluated the participation of immunoglobulins in the lesions. IgG was detected in the hepatic sinusoid, in the lung alveolar walls and in the glomerular capillaries in higher intensity at 30 and 45 days post-infection (PI); there were no C3, except in the kidney. Since the data were not compatible with immune complex deposition, we studied ultraestructurally the internalization of immunoglobulins. In the liver and in kidney the amount of immunoglobulin within endothelial cells was greater at 30 days PI than in non infected control, and in the lung at 30 days PI in relation to 60 days PI. Immunoglobulin internalized by endothelial cells observed in VL in hamsters, remarkably at 30 days PI, may be an alternative mechanism of lesion in VL

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Coorientador: Rosemari de Oliveira Vasconcelos / Banca: José Angelo Lauletta Lindoso / Banca: Gisele Fabrino Machado / Resumo: Leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada pelo parasita intracelular do gênero Leishmania, que acomete o homem e várias espécies animais. O cão é um dos principais reservatórios urbanos do parasita, e desempenha um papel central no ciclo de transmissão aos seres humanos pelos flebotomíneos. Estudos sobre a resposta imune em cães com Leishmaniose Visceral têm demonstrado que a imunidade protetora está associada à resposta imune do tipo celular, enquanto que a progressão da doença está associada à resposta humoral e à produção de IL-10 e TGF-β. Essas citocinas induzem a desativação de macrófagos e têm potencial para incapacitar a defesa do hospedeiro contra Leishmania spp., levando à visceralização da infecção. O objetivo do estudo foi avaliar a produção de IL-10 e de TGF-β por células T regulatórias (Treg) em amostras de sangue e de baço de cães naturalmente infectados por Leishmania spp., e correlacionar à carga parasitária e aos achados histopatológicos. Cinco cães saudáveis e vinte e nove cães com manifestações clínicas de leishmaniose visceral e sorologia positiva para anticorpos anti-Leishmania foram incluídos no grupo de estudo. A PCR em tempo real foi utilizada para a quantificação da carga parasitária e para confirmação da infecção por Leishmania spp. Realizou-se, por citometria de fluxo, a quantificação das células T CD4 regulatórias produtoras de IL-10 e TGF-β. O teste t não pareado foi utilizado para comparar o percentual de células Treg produtoras de IL-10 e TGF-β entre os cães infectados e os saudáveis, e utilizou-se o teste de Mann-Whitney para comparar o percentual de IL-10 e TGF-β no sangue e no baço de cães com LV... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)) / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the intracellular parasite of the Leishmania genus that affects humans and several animal species. The dog is one of the main urban reservoirs of the parasite once it plays a central role in the transmission cycle to humans by sandflies. Studies about the immune response in dogs with visceral leishmaniasis have demonstrated that protective immunity is associated with the immune response of the cellular type, while disease progression is associated with the humoral response and IL-10 and TGF-β production. These cytokines induce the macrophages deactivation and have the potential to disable the host defense against Leishmania spp. leading to infection visceralization. The aim of this study was to evaluate the regulatory T cells (Treg) producing IL-10 and TGF-β in blood and spleen samples from dogs naturally infected by Leishmania spp. and correlate to the parasite load and histopathology. Five healthy dogs and twenty-nine dogs with clinical visceral leishmaniasis manifestations, and seropositivity for anti-Leishmania antibodies were included in the study group. The real-time PCR was used to quantify the parasite load and infection confirmation with Leishmania spp. The regulatory CD4 T cells producing IL-10 and TGF-β quantification was performed by flow cytometry. The unpaired t test was used to compare the percentage of Treg cells producing... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre