Este trabalho teve como objetivo a prospecção e caracterização de enzimas fúngicas, que degradam a biomassa, visando à aplicação no biobranqueamento da polpa de celulose. Para isto, foram selecionados 13 fungos filamentosos da Micoteca e entre estes Aspergillus versicolor e A. brasiliensis foram aqueles que se sobressaíram quanto à produção de xilanase, amilase, CMCase, avicelase e ?-glucosidase. As melhores condições de produção enzimática corresponderam à utilização de bagaço de cevada como fonte de carbono em meio SR (Segato Rizzatti) para xilanase, amilase e ?- glucosidase e meio M5 para CMCase, avicelase e FPase, nos cultivos incubados por tempos variáveis de 72 a 168 horas. Para otimizar a concentração da fonte de carbono e a temperatura nos cultivos foi realizado um Delineamentro Composto Central Rotacional. Como resultante da otimização do bioprocesso foram obtidos os extratos brutos: (i) meio BSR, para a produção de xilanase por A. brasiliensis, com 96 horas de cultivo estático, a 30°C, com bagaço de cevada 3% em meio SR; (ii) Meio VSR para amilase e ?-glucosidase a partir do A. versicolor, com 120 horas de cultivo estático, a 35°C, com bagaço de cevada 3,41% em meio SR; (iii) Meio VM5 para CMCase, avicelase e FPase de A. versicolor com 120 horas de cultivo estático, a 30°C, com bagaço de cevada 2% em meio M5. Lacase foi produzida por Trametes versicolor (iv), cultivado por quinze dias em Fermentação Submersa estática, a 30°C, em meio contendo vinhaça e água destilada (1:5 v/v), 1% de algodão e 0,1% de peptona. Paralelamente, a produção de xilanases de A. tamarii Kita (v) com bagaço de cevada 2,9% foi otimizada em meio ADAMS por 129 horas (recebendo a denominação - meio TKADAMS). Quanto à caracterização das enzimas de A. versicolor (xilanase) e A. brasiliensis (demais enzimas) a temperatura ótima de xilanase foi 70°C; amilase 60-65°C; CMCase 65°C; avicelase 50°C; FPase e lacase 60°C e ?-glucosidase 70-75°C. Quanto à estabilidade térmica, xilanase mostrou-se com 60% de atividade relativa por até 24 horas à 40°C e 30 minutos à 50°C. A 60°C mostrou-se pouco estável. A amilase mostrou-se estável por 24 horas a 40 e 50°C, com 80% da atividade relativa. CMCase e FPase mostraram-se pouco estável nas temperaturas citadas. Avicelase apresentou ativação quando exposta ao aquecimento de 40, 50 e 60°C. ?-glucosidase foi estável a 40°C por até 24 horas, com atividade relativa de 80%; a 50°C apresentou 60% de atividade relativa por 180 minutos e a 60°C exibiu 40% por até 30 minutos. Lacase foi estável a 50°C, com um t50 de 60 minutos; a 60°C teve atividade relativa próxima de 30%, por até 240 minutos e a 70°C apresentou 40% de atividade por 30 minutos. Quanto ao pH, xilanase apresentou uma faixa ótima de 4,0-5,0 e também entre 7,0-8,0. Amilase, CMCase, avicelase, FPase, ?-glucosidase e lacase apresentaram atividades mais expressivas na faixa de pH 4,0-5,5. Com relação à estabilidade ao pH em 24 horas, xilanase foi mais estável nos pH 5,5-7,0, amilase nos pH 5,0-6,5, CMCase, FPase e lacase em pH 4,5, avicelase em pH 3,0 e ?-glucosidase em pH 5,0-5,5. Quanto ao efeito de íons, CMCase e ?-glucosidase foram ativadas por K+, Zn+ e Ba2+; CMCase, ?-glucosidase e lacase foram ativadas por NH4+ e Ca2+; amilase, CMCase, ?-glucosidase e lacase foram ativadas por Co2+; amilase, CMCase e ?- glucosidase foram ativadas por Al3+ e Fe2+; xilanase, avicelase, CMCase e ?-glucosidase foram ativadas por Mn+; avicelase e CMCase foram ativadas por Ag+; lacase por EDTA; ?-glucosidase e lacase por Mg2+, CMCase por Hg2+ e xilanase, ?-glucosidase e lacase por Cu2+. Os extratos foram utilizados na formulação de coquetéis enzimáticos para biobranqueamento da polpa de celulose. A aplicação dos extratos BSR, VSR, VM5 sobre a polpa marrom não resultou em uma redução significativa do número Kappa quando comparados ao controle, uma vez que todos os extratos apresentavam uma coloração muito escura, a qual fora originada por componentes e pigmentos provenientes dos meios de cultivo dos micro-organismos com bagaço de cevada e que, consequentemente, interferiram na determinação do número Kappa. Desta forma, o coquetel otimizado teve como formulação: 20,3 mL do meio TKADAMS e 10 mL do extrato do meio produtor de lacase para cada 4 gramas de polpa tratada, pH 5,5; 35,9ºC, 48 horas. Este tratamento resultou na redução de 1,83 pontos no número Kappa da polpa marrom, representando uma eficiência de 20,3%, e aumento de 4,65 na alvura, em relação ao controle. A aplicação do coquetel nos resíduos lignocelulósicos ocasionou a formação máxima de 85 mg/mL de açúcares redutores, em 24 horas no tratamento do bagaço de cevada, e 25 mg/mL de açúcares redutores, em 3 horas no tratamento do bagaço de cana. A aplicação do coquetel nas polpas de papel reciclado ocasionou um maior destintamento. A aplicação do coquetel desenvolvido na polpa de celulose, nos resíduos lignocelulósicos e fibras secundárias mostrou-se promissora para biobranqueamento, biodegradação e destintamento destes, respectivamente. A aplicação de enzimas no processo de biobranqueamento da polpa de celulose é uma alternativa viável e que auxilia a redução de custos, água, energia e colabora com o meio ambiente. A lacase foi importante no biobranqueamento da polpa de celulose sendo que o aumento da escala de produção do T. versicolor para biorreator levou a uma produção 6,25 vezes maior comparada aquela em Erlenmeyer, provavelmente devido a aeração constante / This work aimed to prospect and characterize fungal enzymes, which break biomass, looking for the cellulose pulp biobleaching application. For this, 13 filamentous fungi of the Fungi Library were selected and among them Aspergillus versicolor and A. brasiliensis were those that stood out as inducers of xylanase, amylase, CMCase, avicelase and ?-glucosidase production. The use of barley bagasse as carbon source was the best condition for xylanase, amylase and ?-glucosidase production in SR medium (Segato Rizzatti) and M5 medium was the best for CMCase, avicelase and FPase production, in cultures incubated for 72-168 h. In order to optimize the concentration of the carbon source and the temperature of the cultures, a Central Composite Rotational Design was elaborated. (i) BSR extract, in SR medium for the xylanase production by A. brasiliensis, 96 hours, in static culture, at 30°C with barley bagasse 3%; (ii) VSR extract, in SR medium, for the amylase and ?-glucosidase from A. versicolor, 120 hours in static culture, at 35°C, with barley bagasse 3.41%. (iii) VM5 extract, in M5 medium for CMCase, avicelase and FPase from A. versicolor, 120 hours of static culture, at 30°C with barley bagasse 2%. Lacase was produced by Trametes versicolor (iv), in a medium containing vinasse and distilled water (1:5 v/v), cotton 1% and peptone 0.1%, for 15 days at 30ºC. In parallel, the production of a xylanase from A. tamarii Kita (v) with barley bagasse 2.9% was optimized in ADAMS medium for 129 hours (designated - TKADAMS medium). The thermal stability study showed that xylanase was stable with 60% of relative activity at 40°C for up to 24 hours and for 30 minutes at 50°C. At 60°C the enzyme was poorly stable. Amylase was stable for 24 hours at 40 and 50°C, with 80% of relative activity. CMCase and FPase was poorly stable at all temperatures tested. Avicelase was activated by the exposure at 40, 50 and 60°C. ?-glucosidase was stable at 40°C for up to 24 hours, with 80% of relative activity; at 50°C it showed a relative activity of 60% for 180 minutes and at 60° it showed 40% of relative activity for 30 minutes. Laccase was stable at 50°C with t50 for 60 minutes. At 60°C it showed an activity of 30% for up to 240 minutes and at 70°C it showed 40% of activity for 30 minutes. As for pH, xylanase showed the best activity in a range of pH 4.0-5.0 and 7.0-8.0. Amylase, CMCase, avicelase, FPase, ?-glucosidase and laccase showed expressive activities in a range of pH 4.0-5.5. The tests of pH stability in 24 hours showed that xylanase was stable at pH 5.5-7.0, amylase at pH 5.0-6.5, CMCase, FPase and laccase at pH 4.5, avicelase at pH 3.0 and ?-glucosidase at pH 5.0-5.5. The effect of ions showed that CMCase and ?-glucosidase were activated by K+, Zn+ and Ba2+; CMCase, ?-glucosidase and lacase were activated by NH4+ and Ca2+; amylase, CMCase, ?-glucosidase and lacase were activated by Co2+; amylase, CMCase and ?-glucosidase by Al3+ and Fe2+; xylanase, avicelase, CMCase and ?-glucosidase by Mn+; avicelase and CMCase by Ag+; lacase by EDTA; ?-glucosidase e lacase by Mg2+, CMCase by Hg2+ and xylanase, ?-glucosidase and lacase by Cu2+. The extracts were used in the formulation of enzymatic cocktails for cellulose pulp biobleaching. The application of BSR, VSR and VM5 extracts on the brown pulp did not result on a significant reduction of the Kappa number when compared to the control, on account of the dark coloration of these extracts caused by the components and pigments from the cultivation with the microorganisms and barley bagasse, which as a consequence, interfered in the determination of the Kappa number. Thus, an optimized cocktail was formulated: for each 4 grams of treated pulp 20.3 mL of TKADAMS extract and 10 mL of laccase extract, pH 5.5; 35.9°C, 48 hours. This treatment resulted in the reduction of 1.83 points in the Kappa number of the brown pulp, representing an efficiency of 20.3%, and a brightness increase of 4.65 when compared to the control. The application of the cocktail in the lignocellulosic residues resulted in the formation of 85 mg/mL of reducing sugars in barley bagasse treatment for 24 hours and, 25 mg/ml of reducing sugars in sugarcane bagasse treatment for 3 hours. The application of the cocktail in the recycled paper pulps caused a greater deinking. The application of the formulated cocktail in the cellulose pulp, lignocellulosic residues and secondary fibres was promising for biobleaching, biodegradation and deinking, respectively. The enzyme application in cellulose biobleaching is a viable alternative, which helps reducing costs, water, energy and collaborates with the environment. Laccase was important in the cellulose biobleaching and the increase of its production by T. versicolor through bioreactor led to a production 6.25 times higher than that in Erlenmeyer, probably due to the constant aeration

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 270809 bytes, checksum: 2ca0830f4e6318653c848e9cda88dae8 (MD5) Previous issue date: 2002-11-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Penicillium expansum is a filamentous fungus that produces extracelular xylanase. An extracellular xylanase was found to be the major protein in the filtrated culture of P. expansum when grown on 0,3 % wheat bran. In contrast to other microorganism no xilanase multiplicity was found in P. expansum under the conditions used. The used partial purification estrategy was ammonium sulfate fractioning, molecular exclusion cromatography, ultrafiltration and anion exchange chromatography. The proteins eluation profile showed only one form of xylanase that was partially characterized. The optimum pH and temperature were 5,5 and 40 0C, respectively. The enzyme kept stable when preincubed for 1 h under pH between 5.5 and 6.5. It also kept stable when preincubed for 1h under temperature between 20-40 0C. The enzime showed km of 3,03 mg mL-1 and Vmax of 0,027 mmol min-1 μg –1 of protein. The enzymatic activity was increased by 34 % by Mg3(PO4)2 (1 mM); 31 % by MgSO4 (1 mM).and 28 % by Al2(SO4)3 (1 mM). / O Penicillium expansum é um fungo filamentoso produtor de xilanase extracelular. Uma xilanase extracelular foi encontrada como a principal proteína na cultura filtrada de P. expansum quando cultivado em farelo de trigo 0,3 %. Em contraste com outros microrganismos, não foi encontrada multiplicidade de xilanase de P. expansum sob as condições usadas. Como estratégia de purificação parcial da enzima, foram realizados fracionamento com sulfato de amônia, cromatografia de exclusão molecular, ultrafiltração e cromatografia de troca iônica. O perfil de eluição das proteínas mostrou uma única forma de xilanase, sendo esta parcialmente caracterizada. O pH ótimo e a temperatura ótima foram 5,5 e 40 0C, respectivamente. A enzima se manteve estável quando pré-incubada por 1 h em pH entre 5,5 e 6,5. Também manteve a estabilidade quando pré-incubada por 1 h em temperatura entre 20-40 0C. A enzima apresentou Km de 3,03 mg mL-1 e Vmax de 0,027 mmol min-1 μg-1 de proteína. A atividade enzimática foi aumentada 34 % por Mg3(PO4)2 (1 mM); 31 % por MgSO4 (1 mM) e 28 % por Al2(SO4)3 (1 mM).

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RodrigoCG_DISSERT_2010.pdf: 836774 bytes, checksum: 86ff894110e71c4fda4b7950daeb0674 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Nowadays generation ethanol second, that t is obtained from fermentation of sugars of hydrolyses of cellulose, is gaining attention worldwide as a viable alternative to petroleum mainly for being a renewable resource. The increase of first generation ethanol production i.e. that obtained from sugar-cane molasses could lead to a reduction of lands sustainable for crops and food production. However, second generation ethanol needs technologic pathway for reduce the bottlenecks as production of enzymes to hydrolysis the cellulose to glucose i.e. the cellulases as well as the development of efficient biomass pretreatment and of low-cost. In this work Trichoderma reesei ATCC 2768 was cultivated under submerged fermentation to produce cellulases using as substrates waste of lignocellulosic material such as cashew apple bagasse as well as coconut bagasse with and without pretreatment. For pretreatment the bagasses were treated with 1 M NaOH and by explosion at high pressure. Enzyme production was carried out in shaker (temperature of 27?C, 150 rpm and initial medium pH of 4.8). Results showed that T.reesei ATCC 2768 showed the higher cellulase production when the cashew apple bagasse was treated with 1M NaOH (2.160 UI/mL of CMCase and 0.215 UI/mL of FPase), in which the conversion of cellulose, in terms of total reducing sugars, was of 98.38%, when compared to pretreatment by explosion at high pressure (0.853 UI/mL of CMCase and 0.172 UI/mL of Fpase) showing a conversion of 47.39% of total reducing sugars. Cellulase production is lower for the medium containing coconut bagasse treated with 1M NaOH (0.480 UI/mL of CMcase and 0.073 UI/mL of FPase), giving a conversion of 49.5% in terms of total reducing sugars. Cashew apple bagasse without pretreatment showed cellulase activities lower (0.535 UI/mL of CMCase and 0,152 UI/mL of FPase) then pretreated bagasse while the coconut bagasse without pretreatment did not show any enzymatic activity. Maximum cell concentration was obtained using cashew nut bagasse as well as coconut shell bagasse treated with 1M NaOH, with 2.92 g/L and 1.97 g/L, respectively. These were higher than for the experiments in which the substrates were treated by explosion at high pressure, 1.93 g/L and 1.17 g/L. Cashew apple is a potential inducer for cellulolytic enzymes synthysis showing better results than coconut bagasse. Pretreatment improves the process for the cellulolytic enzyme production / Recentemente o etanol de segunda gera??o, obtido da fermenta??o dos hidrolisados de celulose, vem despertando a aten??o mundial por ser uma alternativa vi?vel e ambientalmente correta ao petr?leo, uma vez que aumentar a produ??o de etanol a partir do mela?o da cana-de-a??car, o etanol de primeira gera??o, implicaria na utiliza??o de terras destinadas a produ??o de alimentos. Entretanto, o etanol de celulose exige rotas tecnol?gicas que ainda o tornam pouco competitivo, como a produ??o de enzimas que quebrem a celulose em glicose, as celulases, e a ado??o de um processo de pr?-tratamento eficiente e de baixo custo capaz de diminuir o grau de intera??o que existe nas fibras vegetais. No presente trabalho, Trichoderma reesei ATCC 2768 foi cultivada em meio submerso para produ??o de celulases utilizando como substratos res?duos lignocelul?sicos, baga?o do ped?nculo de caju e baga?o de coco, sem tratamento e tratados com NaOH 1M e por explos?o a alta press?o. Os experimentos de produ??o das enzimas foram realizados em meio submerso e conduzidos em incubador rotat?rio (temperatura de 27?C, velocidade de agita??o de 150 rpm e pH inicial do meio de 4,8). Os resultados mostraram que T. reesei ATCC 2768 apresentou maior produ??o de celulases em meio contendo baga?o do ped?nculo de caju tratado com NaOH 1M (2,160 UI/mL de CMCase e 0,215 UI/mL de FPase), onde o consumo de celulose em forma de a??cares redutores totais foi de 98,38%, quando comparado com o mesmo tratado por explos?o a alta press?o (0,853 UI/mL de CMCase e 0,172 UI/mL de Fpase), apresentando um consumo de 47,39% de ART s. Os resultados mostraram ainda que a produ??o de celulase ? menor em meio contendo baga?o de coco tratado com NaOH 1M (0,480 UI/mL de CMcase e 0,073 UI/mL de FPase), chegando-se a 49,5% de ART s consumidos. O baga?o do ped?nculo de caju sem tratamento apresentou uma atividade bem inferior (0,535 UI/mL de CMCase e 0,152 UI/mL de FPase) quando comparado aos baga?os com tratamento e o baga?o de coco n?o-tratado n?o apresentou atividade enzim?tica. A concentra??o m?xima de c?lulas foi maior quando se utilizou como substrato os baga?os do ped?nculo de caju e casca de coco tratados alcalinamente, 2,92 g/L e 1,97 g/L, respectivamente, do que aqueles tratados por explos?o a alta press?o, 1,93 g/L e 1,17 g/L. Conclui-se que o ped?nculo de caju ? um potencial indutor ? s?ntese de enzimas celulol?ticas, apresentando-se melhor que o baga?o de coco bem como o tratamento melhora bastante o processo de s?ntese das enzimas.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:08:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fabiano Bisinella Scheufele.pdf: 1716907 bytes, checksum: fee6288858ac3d92f0d2e7f9f8d02ba2 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lignocellulosic biomass has high yields of cellulose which can be hydrolyzed to fermentable carbohydrates. Global generation of agro-industrial wastes grows simultaneously with the sector development resulting at the accumulation of lignocellulosic residues leading environmental pollution and loss of potential materials for the bioconversion to a wide range of high added value products, such as biofuels. Recently, the search of renewable sources of energy has grown, due to the depleting of fossil fuels, increasing the possibility at the conversion of the lignocellulosic biomass via hydrolytic enzymes. The aim of this work was evaluate cellulases production by lignocellulolytic fungi from the Amazonic biome aiming at the bioconversion of the agro-industrial residues. Submerged and solid-state fermentations were performed to select the microorganism with superior cellulase productive capacity. The influence of parameters such as pH, surfactant induction (Tween 80), aeration and agitation, besides the alkaline oxidative treatment of the sugarcane bagasse. Statistical design were carried out to estimate the influence of the moisture and the initial pH at cellulases production by solid-state fermentation. Trichoderma sp. and Aspergillus niger performed the best production of enzymes, where the highest yields of total cellulase were obtained by agitated submerged fermentation with sugarcane bagasse pretreated with H2O2 (1%) reaching 0.265 U.mL-1 (12.915 U.g-1) by Trichoderma sp. at the sugarcane bagasse, and 0.155 U.mL-1 (7.549 U.g-1) by Aspergillus niger. Through solid state fermentations with the pretreated sugarcane bagasse the influence of initial pH and the moisture were evaluated by statistical design. In the case of the Trichoderma sp. both parameters were significant at the cellulase production, as well as the synergistic interaction, within the confidence interval of 95%, yielding 0.167 U.mL-1 (2.695 U.g-1), at the pH 7.0 and 1:9 solid-liquid ratio. For Aspergillus niger only pH was significant and the cellulase content obtained was 0.098 U.mL-1 (1.695 U.g-1) at pH 7.0. Finally, a cellulase produced by Trichoderma sp. at solid state fermentation and a commercial enzyme were used at enzymatic hydrolysis tests. The parameters hydrolysis time, enzyme dilution, concentration of Tween 80 and solid-liquid ratio of sugarcane bagasse were evaluated. The significant variables were then optimized by a central composite rotational design. The strain of Trichoderma sp. from the Amazon biome showed potential at the cellulase production and the treated sugarcane bagasse was a fine substrate for the enzymatic production. / A biomassa lignocelulósica contêm altos teores de celulose e outros polissacarídeos em sua constituição química, podendo ser hidrolisados em açúcares fermentescíveis. A geração de resíduos agroindustriais anual tem crescido resultando no acúmulo de resíduos que contribuem para a poluição do meio ambiente e na perda de materiais que possuem potencial na bioconversão a produtos de alto valor agregado, como por exemplo, biocombustíveis. Recentemente, há a necessidade de fontes energéticas de origem renovável, devido à diminuição dos combustíveis fósseis, viabilizando a conversão das biomassas lignocelulósicas via enzimas hidrolíticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de enzimas celulases por fungos lignocelulolíticos provenientes do bioma amazônico visando a bioconversão de resíduos agroindustriais. Diferentes fermentações foram realizadas, tanto em meio submerso quanto em estado sólido, através das quais selecionou-se os micro-organismos com melhor capacidade produtiva de celulases. Estudou-se a influência de parâmetros como pH, utilização de surfactante como indutor (Tween 80), aeração e agitação, além do tratamento alcalino oxidativo do bagaço de cana. Os micro-organismos que apresentaram melhor desempenho na produção das enzimas foram o Trichoderma sp. e o Aspergillus niger, sendo que os maiores níveis de celulase total foram obtidos por fermentação submersa nos ensaios agitados com bagaço de cana pré-tratado com H2O2 (1%), com 0,265 U.mL-1 (12,915 U.g-1) pelo Trichoderma sp., e 0,155 U.mL-1 (7,549 U.g-1) com Aspergillus niger. A partir de fermentações em estado sólido com o bagaço de cana pré-tratado avaliou-se a influência dos parâmetros pH inicial e umidade por planejamentos experimentais, verificando-se que para o Trichoderma sp. ambos os parâmetros, bem como a interação sinergética entre si, foram significativos dentro do intervalo de confiança de 95%, obtendo-se 0,167 U.mL-1 (2,695 U.g-1) no pH 7,0 e relação sólido-líquido 1:9. No caso do Aspergillus niger apenas o pH foi significativo e o teor de celulase obtido foi de 0,098 U.mL-1 (1,695 U.g-1) para um pH 7,0. Finalmente, a partir de uma celulase produzida por fermentação em estado sólido do Trichoderma sp. e uma enzima comercial foi realizada a avaliação da influência dos parâmetros tempo de hidrólise, diluição da enzima, concentração de Tween 80 e razão sólido-líquido do bagaço de cana sobre a hidrólise do mesmo. As variáveis significativas foram, posteriormente, otimizadas por um delineamento composto central rotacional. A cepa Trichoderma sp. proveniente do bioma amazônico apresentou potencial na produção de celulases e o o bagaço de cana submetido ao tratamento alcalino oxidativo apresentou-se como um bom substrato para a produção enzimática.