Orientador: Marcelo de Almeida Silva / Banca: Dirceu Maximino Fernandes / Banca: Claudiana Moura dos Santos / Resumo: Pouco conhecido e explorado no Brasil, o cártamo (Carthamus tinctorius L.) é uma alternativa interessante para ser incluída em sistemas de rotação de cultura na região do cerrado. A cultura é rústica, tolerante à deficiência hídrica e ao frio, tornando-se uma opção para cultivo de safrinha, porém pouco ainda se conhece sobre a variabilidade genética das linhagens introduzidas no país. O objetivo do trabalho foi avaliar a morfologia e a fisiologia de seis linhagens de cártamo em condições de deficiência hídrica seguida de reidratação. O experimento foi realizado sob cultivo protegido em caixas contendo aproximadamente 300 L de solo. Os tratamentos foram arranjados em um delineamento de blocos ao acaso em esquema fatorial 6 x 2. O primeiro fator foi composto por seis linhagens de cártamo (IMA 02, IMA 04, IMA 10, IMA 14, IMA 16 e IMA 21), e o segundo por dois regimes hídricos (sem e com deficiência hídrica). Todas as caixas foram mantidas em capacidade de campo (CC) até os 55 dias após a semeadura (DAS), depois as plantas foram expostas ao estresse por deficiência hídrica por um período de 30 dias. No tratamento sem deficiência (-D) as plantas foram hidratadas em 100% da capacidade de campo (CC), enquanto que no tratamento com deficiência moderada (+D) as plantas foram mantidas com 50% CC. Após o período de 30 dias de deficiência hídrica, as plantas foram reidratadas por 18 dias, neste período foram realizadas avaliações de potencial hídrico foliar, teor de clorofila, conteúdo relativo de água, tolerância protoplasmática, massa seca de raízes, parte aérea e capítulos, razão raiz/parte aérea, altura de planta, número de capítulos por planta, índice de colheita, peso de mil grãos e produtividade de grãos. Há variabilidade genética entre as seis linhagens de cártamo para todas as características avaliadas. As linhagens IMA 21, IMA 10 e IMA 04 ... / Abstract: Safflower is barely known and explored in Brazil, but has been shown as an interesting alternative for inclusion in crop rotation systems in the Cerrado region. The culture is rustic, tolerant to cold and water deficiency, what make it an option for cultivation in the off-season. The objective of this work was to evaluate the morphology and physiology of six safflower lines under water deficit. The experiment was carried out in a greenhouse in pots contend approximately 300 L of soil. The treatments were arranged in a randomized block design in factorial scheme 6 x 2. The first factor was composed of six lines of safflower (IMA 02, IMA 04, IMA 10, IMA 14, IMA 16 e IMA 21), and the second was the two water regimes (without and with water deficiency). All the boxes were kept at field capacity (FC) to 55 days after seeding (DAS), after the plants were exposed to water deficiency stress for a period of 30 days. The treatment without deficiency (-D) plants were hydrated in 100 field capacity (FC), while in the treatment with deficiency (+D) plants were maintained with 50% FC. After the period of 30 days, the plants were rehydrated for 18 days, in this period were carried out evaluations of leaf water potential, chlorophyll content, relative water content, protoplasmic tolerance, dry mass of root, shoot and flowers, root/shoot ratio, plant height, number of flowers per plant, harvest index, weight of thousand grains and grain yield. There is genetic variability among the six safflower lines for all traits evaluated. The lines IMA 04, IMA 10 and IMA 21 had better recovery of morpho-physiological characteristics after the water deficit and rehydration, in that, the line IMA 14 had better values of number of chapters per plant, relative water content in leaf, and dry matter of the shoot and root; and the line IMA 10 stood out in the variables contents of chlorophyll a, b, total, carotenoids and SPAD index ... / Mestre

Orientador: Fausto Foresti / Resumo: Este trabalho apresenta os problemas relacionados à implantação de um programa de melhoramento genético das tilápias-do-Nilo (Oreochromis niloticus) a partir de linhagens importadas para o Brasil, e uma contribuição no sentido de superá-los. Uma revisão de literatura é apresentada, onde são discutidos aspectos genéticos da formação dos estoques nacionais e as dificuldades que este processos geram para o melhoramento genético, as possibilidades oferecidas pela genética molecular para superá-las, os princípios de funcionamento da seleção assistida por marcadores moleculares (MAS) de DNA e do uso dos marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), para subsidiar uma recomendação de procedimentos gerais para a formação de banco genético da espécie e condução de programas de MAS com a espécie . Os dois capítulos seguintes apresentam contribuições para este objetivo, na forma de artigo científico. A primeira delas tem objetivo de investigar o potencial genético de quatro linhagens comerciais provenientes de diferentes estoques cultivados no país, para fins de formação de plantel híbrido intraespecífico a ser utilizado em programa de melhoramento genético. O objetivo da segunda é investigar a viabilidade técnica da utilização de dois índices de forma do corpo, como fenótipos correlacionados ao rendimento de filé para programa de melhoramento genético / Abstract: This work presents the main problems related to the implantation of a genetic improvement program of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) based on imported strains to Brazil and a contribution in order to overcome them. An overview is provided on the formation of national lineages, the difficulties brought by this process to genetic improvement, the possibilities offered by molecular genetic to overcome them, the DNA markers assisted selection (MAS), and the use of RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers in this process. A series of recommendation of general procedures for the formation of genetic bank and conduction of the MAS program for such species. The two following chapters present contributions of these objectives in a scientific paper form. The first one intends to investigate the genetic potential of four commercial strains proceeding from different stocks in Brazil in order to form an intra-specific hybrid plantel used in a genetic improvement program. The second one investigates the technical viability in the application of two body form indexes as correlated phenotypes to the fillet and carcass yield in a genetic improvement program / Doutor

Orientador: Vitor Fernandes Oliveira de Miranda / Coorientador: Eduardo Custódio Gasparino / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: Maurício Bacci Junior / Resumo: O uso da sistemática molecular, nas mais variadas abordagens existentes atualmente, é de suma importância para produzir e complementar dados relativos à identificação e história evolutiva das mais diversas espécies. O emprego do DNA, aliado às ferramentas atuais baseadas em sistemática filogenética, pode ser de grande valia para a proposição de um sistema classificatório mais próximo do natural. O gênero Utricularia (Lentibulariaceae) compreende cerca de 250 espécies, das quais cerca de 90 ocorrem nos Neotrópicos e 69 no Brasil, sendo que 20 destas são endêmicas. Muitas espécies ocorrem em ampla variedade de habitats e apresentam alto grau de polimorfismo estrutural, sendo comumente identificadas de forma equivocada, mesmo por especialistas. A delimitação infragenérica também apresenta inconsistências quanto às circunscrições e relações filogenéticas dos subgêneros e seções, fato que evidencia a necessidade de estudos filogenéticos, principalmente baseados em dados moleculares. Assim fica clara a necessidade de pesquisas em sistemática para o grupo, o que poderia trazer informações diagnósticas para as delimitações interespecíficas, assim como para as relações dos táxons infragenéricos (subgêneros, seções e espécies). Sendo assim, o presente estudo teve por objetivos principais avaliar (i) a eficácia da aplicação do DNA "Barcoding" e (ii) realizar o maior estudo filogenético já proposto para Utricularia, baseado em sequências de DNA dos genomas nuclear e cloroplastidial / Abstract: The use of molecular systematics in various existing approaches is currently of paramount importance to produce and supplement data concerning the identification and evolutionary history of several species. The use of the DNA molecule, combined with the current tools based on systematics, can be of great value to the proposition of a classificatory system closer to natural. The genus Utricularia L. (Lentibulariaceae) comprises about 250 species, of which about 90 occur in the Neotropics and 69 in Brazil, and 20 of these are endemic. Many species occur in a wide variety of habitats and has a high degree of structural polymorphism, by that they are commonly mistakenly identified, even by experts. Infrageneric delimitation has also inconsistencies regarding boundaries and phylogenetic relationships of the subgenera and sections, a fact that highlights the need for phylogenetic studies based mainly on molecular data. Thus there is a clear need for systematic research for the group, which could provide diagnostic information for interspecific boundaries as well as the relationships of taxa (subgenera, sections and species). Therefore, the present study was to evaluate the main objectives (i) the effectiveness of the application of DNA barcoding and (ii) hold the largest phylogenetic study already proposed for Utricularia, based on DNA sequences of nuclear and chloroplast genomes / Mestre

Orientador: Maurício Dutra Zanotto / Banca: Juliana Parisotto Poletine / Banca: José Geraldo Carvalho Amaral / Resumo: Para a geração de híbridos comerciais de porte baixo visando à colheita mecanizada em condições de safra é necessário a obtenção de linhagens. O presente trabalho teve como objetivo avaliar 111 linhagens de mamona, obtidas da População FCA Planta Baixa selecionadas para porte baixo. O trabalho foi desenvolvido no município de São Manuel - SP na Fazenda Experimental São Manuel, da Faculdade de Ciências Agronômicas, no Campus de Botucatu - UNESP. Estas linhagens foram avaliadas entre os meses de outubro de 2003 a setembro de 2004 utilizando-se o delineamento experimental de blocos ao acaso, com área útil da parcela de 3,0 m2, espaçamento entre linhas 0,60 m e 0,50 m entre plantas. As 111 linhagens foram divididas em quatro experimentos: 30 linhagens em três experimentos com quatro repetições e 21 linhagens em um experimento com duas repetições. Após o completo desenvolvimento das plantas, avaliou-se a altura de 10 plantas por parcela (m) desde a superfície do solo até o ápice do racemo mais alto, bem como foram tomados dados de peso dos grãos em kg.ha -1, corrigidos por covariância para estande ideal de 10 plantas por parcela e teor de água de 10%. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância. Os quadrados médios não foram significativos a 5% de probabilidade para a característica altura de plantas, indicando que não houve variação genética para este parâmetro. Os quadrados médios das análises de variância para a característica produtividade de grãos foram significativos, indicando existir variabilidade para a característica em nível de 5% de probabilidade. Para a característica altura de plantas, a média das linhagens e amplitude de variação entre os quatro experimentos foi de 1,20 m com amplitude de 0,33 a 1,68 m ou plantas anãs a baixas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: For the generation of commercial hybrids with short height seeking to automated harvest in crop conditions, it's necessary the obtaining of lineages. The present work had as objective to evaluate 111 castor bean lineages, obtained from FCA short height plant population selected for low size. The work was developed in São Manuel municipal district, São Paulo State, in the Experimental Farm belonging to University of Agronomic Sciences, Botucatu Campus - UNESP. These lineages were appraised between October, 2003 and September, 2004, by using randomized complete blocks experimental design, with plot useful area of 3,0 m2, spacing between lines of 0,60 m and 0,50 m between plants. The 111 lineages were divided into four experiments: 30 lineages in three experiments with four replications and 21 lineages in one experiment with two replications. After plants complete development, the height of ten of them was evaluated, in each plot (m), from the soil surface to the apex of the highest bunch, as well as data of grain weight were taken, in kg ha-1, corrected by covariance for ideal stand of 10 plants per plot and water content of 10%. The obtained data were submitted to variance analysis. Medium squares were not significant to 5% of probability for the characteristic plant height, indicating that there was not genetic variation for this parameter. The medium squares from the variance analyses for the characteristic grains yield were significant, indicating the existence of genetic variability for this characteristic with 5% of probability. For the characteristic plant height, the average of the lineages and variation width among the four experiments was about 1,20 m with range from 0,33 to 1,68 m or dwarfish to short plants... (Complete abstract, click eletronic address below) / Mestre

Orientador: José Roberto Sartori / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar peso vivo, rendimento de carcaça e pernas e aspectos morfológicos dos tipos de fibras musculares esqueléticas do músculo flexor longo do hálux, em machos e fêmeas de quatro linhagens de frangos de corte, criados nos sistemas confinado e semi-confinado. O delineamento experimental foi inteiramente casualisado com esquema fatorial 4x2x2, ou seja, quatro linhagens (Ross-308, Pescoço Pelado Label Rouge, Caipirinha e Paraíso Pedrês), dois sistemas de criação (confinamento e semi-confinamento) e dois sexos, com duas repetições por tratamento, sendo que cada ave retirada ao acaso aos 56 dias de idade foi considerada uma unidade experimental, totalizando 64 aves. A maior massa muscular das aves selecionadas para alta taxa de crescimento está relacionada ao aumento na área dos três tipos de fibras musculares (SO, FOG e FG). Machos apresentaram maior massa muscular e musculatura mais glicolítica que as fêmeas. O sistema de criação semi-confinado alterou a composição de fibras musculares esqueléticas dos machos, tornando-a mais oxidativa, porém tal efeito não foi observado nas fêmeas. / Abstract: The aim of this research was to evaluate body weight, carcass and legs yields and the types of skeletal muscle fibers of the flexor hallucis longus muscle using histochemical and morphologic aspects, in four strains of broilers reared in the confined and semi-confined system. The experiment was conducted in factorial design 4x2x2, four strains (Ross-308, Naked Neck Label Rouge, Caipirinha and Paraiso Pedrês), two production systems (confinement and semi-confinement) and two sex, with two replicates each treatment, considering each bird randomly at 56 of age an experimental unit, totalizing 64 birds. The biggest muscle mass of the birds selected for high tax of growth is related to the increase in the area of the three types of skeletal muscle fibers (SO, FOG and FG). Males show greater muscle mass and glycolityc muscle than the females. The semi-confined system modified the skeletal muscle fiber composition of the males, becoming it oxidative, however such effect was not observed in the females. / Mestre

Orientador: Wellerson Rodrigo Scarano / Resumo: The mono-n-butyl phthalate (MBP) is the active metabolite of di-n-butyl phthalate (DBP), a plasticizer commonly used for industrial products, including medical devices, flexible plastics and cosmetics, has been described as an endocrine disruptor with estrogenic and anti-androgenic function, depending on the dose and the exposure period, particularly by interfering with the development of the male reproductive system. It is believed that some of the effects of endocrine disruptors are mediated by the non-classical estrogen G protein-coupled receptor - GPER1 (GPR30). In view of the worldwide problems regarding to degradation of plastics and their dispersion in the environment, and earlier evidences showed that phthalates have effects on the development and maturation of the prostate increasing the incidence of inflammatory and dysplastic lesions in rodents, this study aimed to evaluate the effect of MBP on androgen dependent prostate cancer cells (LNCaP) by modulating the activity of GPER1 (through its antagonist, G15). The LNCaP cells, maintained in RPMI culture, were expanded and treated in an incubator with 5% CO2 humid atmosphere at 37 ° C. The MBP dose to be used was 10 uM, selected from the following MTT cytotoxicity test (3- [4.5-dimethylthiazol-2yl] -2,5-diphenyl tetrazolina bromide). Thus were established the following treatment protocols: control: RPMI + 0.03% DMSO; MBP: 10 uM of MBP diluted in DMSO (0.03%) + RPMI; G15: 8 uM of G15 diluted in DMSO (0.03%) + RPMI; M+G... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: O mono-n-butil-ftalato (MBP), metabólito ativo do di-n-butil-ftalato (DBP), plastificante usualmente utilizado em produtos industrializados, incluindo dispositivos médicos, plásticos flexíveis e cosméticos, tem sido descrito como um desregulador endócrino com função estrogênica e anti-androgênica dependendo da dose e do período de exposição, interferindo principalmente com o desenvolvimento do sistema genital masculino. Acredita-se que os efeitos de alguns desreguladores endócrinos sejam mediados pelo receptor estrogênico não clássico acoplado à proteína G - GPER1 (GPR30). Tendo em vista a problemática mundial com relação à degradação dos materiais plásticos e sua dispersão no meio ambiente e diante de evidências que mostraram que os ftalatos exercem efeitos sobre o desenvolvimento e maturação da próstata aumentando a incidência de lesões inflamatórias e displásicas em roedores, este estudo teve por objetivo avaliar a ação do MBP sobre células cancerígenas prostáticas dependentes de andrógeno (LNCaP), modulando a atividade do GPER1 (através de seu antagonista, G15). As células da linhagem LNCaP, mantidas em meio de cultura RPMI, foram expandidas e tratadas em estufa com 5% de CO2 e atmosfera úmida a 37ºC. A dose de MBP a ser utilizada foi de 10 µM, selecionada após o teste de citotoxicidade do MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2yl]-2,5-difenil brometo de tetrazolina). Dessa forma foram constituídos os seguintes protocolos de tratamento: Controle: RPMI + DMSO 0,03%; MBP: 10 µM de M... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O núcleo é uma estrutura organizada e possui verdadeiras organelas nucleares. Entre elas, estão os nucléolos e os corpúsculos de Cajal (CBs). Estes compartimentos nucleares são estruturas dinâmicas, mantidos pela associação de macromoléculas envolvidas na expressão gênica que interagem entre si delimitando-as. A principal proteína encontrada nos CBs é a p-80-coilin e, portanto, o principal epítopo capaz de marcar essas estruturas. Suas funções específicas ainda tem sido alvo de estudo. Existe uma proteína em comum a ambas as estruturas, a fibrilarina que participa no processamento de rRNA. Estes corpúsculos já foram descritos na periferia dos nucléolos ou mesmo fisicamente ligados a ele. Acredita-se que os corpúsculos de Cajal participem da síntese de rRNA, maturação, transporte e associação das subunidades ribossômicas.Diante esta relação, este trabalho visa estudar a inter-relação entre estas estruturas em células normais e as respectivas linhagens de células tumorais em cultura antes e após tratamentos com actinomicina D. Esta droga se usada em baixas concentrações, bloqueia a transcrição dos genes que foram decodificados pela RNA polimerase I e II, e -amanitin, por sua vez bloqueia a transcrição de genes decodificado pela RNA polimerase II . Além disso, também visa investigar uma relação entre a proliferação das linhagens estudadas e freqüência dos corpúsculos de Cajal nas células controle e tratadas. O microscópio confocal de varredura a laser permitiu o estudo dessas estruturas em preparações imunofluorescência fornecendo uma análise tridimensional destas estruturas quando utilizados anticorpos específicos. Linhagens de células que apresentaram um crescimento mais lento foram aquelas que tinham uma maior freqüência de corpúsculos por núcleo. Por outro lado, aquelas que apresentaram um crescimento mais intenso, foram aquelas que apresentaram maior variação no número de corpúsculos por núcleo. Após o tratamento com inibidores de síntese de RNA, tanto os corpúsculos de Cajal quanto os nucléolos, apresentaram alterações morfológicas, às vezes apresentando um grande acúmulo na região dos corpúsculos ou desorganizando os nucléolos. Mudanças no tamanho e forma também puderam ser destacadas. / The nucleus is a structure that has sub-compartments which can be called nuclear organelles. Among them, may be cited the nucleoli and the Cajal bodies (CBs). These nuclear compartments are dynamic structures, maintained by association and stock of macromolecules involved in gene expression. The main protein found in the CB is a p-80-coilin and therefore the main epitope able to label these structures. Their functions are still to be clarified. There is a protein in common to the nucleolus and Cajal bodies, the fibrillarin that takes part in the processing of rRNA. The CBs can be found at the periphery of the nucleoli or even physically connected to them. It is believed that the CBs may have role in the synthesis of rRNA and maturation, transport and association of ribosome subunits. In view of this relationship between Cajal bodies and nucleoli, this work aims to study the interrelationship between these structures in normal cells and their respective tumor cell line in culture before and after treatments with actinomycin D, which in low concentrations, blocks the transcription of genes that were decoded by the RNA polymerase I and II and -amanitin, which is responsible for blocking the transcription of genes decoded by the RNA polymerase II and find out a relationship between cell proliferation and Cajal bodies frequencies in control and treated cells. The confocal microscope of laser scanning enabled the study of these structures in preparations immunofluorescent providing a three-dimensional analysis of these structures when used specific antibodies before and after treatment. Cell lines that shown low cell grow, appears to have lass CB/ nucleus in the other hand, cell lines that have fastest grow shown nuclei with more Cajal bodies frequencies and more variation in the number of Cajal/nucleus After treatment with inhibitors, both Cajal bodies as nucleoli, made quite clear morphological changes, sometimes giving large accumulation of proteins in organelles and sometimes appeared disorganized in the nucleoplasm. Changes in the size and shape were also highlighted. The tumor cell lines also showed changes compared to their normal cell type.

Hoje há um grande interesse em componentes da dieta, como os polifenóis do chá verde, os quais podem exercer efeitos de proteção contra várias doenças neurológicas, incluindo Alzheimer, isquemia e acidente vascular cerebral. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da (-) epicatequina 3-galato (ECG), um dos principais antioxidantes do chá verde, em células da linhagem C6. Avaliamos morfologia e integridade celular, captação de glutamato e secreção de S100B e o efeito sobre a genotoxicidade induzida por H2O2, na presença de 0,1; 1 e 10 μM de ECG. Após 6 h de incubação, houve alteração morfológica somente com 10 μM de ECG. Entretanto, após 24 h, todas as concentrações de ECG induziram formação de processos ao redor do corpo celular. Houve perda da integridade celular (~ 6%) somente após 24 h, apenas na presença de 10 μM de ECG. Houve diminuição (~36%) na captação de glutamato após 1 h com 1 e 10 μM de ECG. Após 6 h, houve aumento na captação de glutamato (~70%) a partir de 0,1 μM. Também se observou aumento significativo na secreção de S100B com 1 μM de ECG (~ 36%) e com 10 μM (69%) após 1 h, enquanto após 6 h, todas concentrações induziram um aumento na secreção de S100B (~60%). Curiosamente, na presença de 10 μM de ECG houve efeito genotóxico, dependente do tempo de exposição. Já com doses mais baixas (0,1 e 1 μM), a ECG foi capaz de prevenir completamente a genotoxicidade induzida pelo H2O2. Em suma, demonstramos que a ECG pode modular captação de glutamato e secreção de S100B. Além disso, pode exercer efeitos genoprotetores ou genotóxicos em células C6, dependendo da concentração e do tempo de incubação. Estes resultados sugerem que a ECG pode contribuir para o papel neuroprotetor das células gliais e contrapor-se a patologias neurológicas associadas ao estresse oxidativo. / There is a current interest in dietary compounds, such as green tea polyphenols, that can favor protection against a variety of brain disorders, including Alzheimer’s disease, ischemia and stroke. The objective of the present study was to investigate the effects of (-)-epicatechin-3-gallate (ECG), one of three major green tea antioxidants, on C6 lineage cells. We evaluated cell morphology and integrity; specific astrocyte activities; glutamate uptake; S100B secretion and the effect on genotoxicity induced by H2O2 in the presence of 0.1, 1 and 10 μM ECG. During 6 h of incubation, cell morphology was altered only at 10 μM ECG; After 24 h, cells become stellate (process-bearing cells), in the presence of all concentrations of ECG. Loss of cell integrity (~ 6%) was observed after 24 h with 10 μM ECG. ECG (1–10 μM) induced a decrease (~ 36%) in glutamate uptake after 1 h, however, after 6 h, occurred a sustained increase in glutamate uptake (~ 70%) from 0.1 μM. A significant increase in S100B secretion was observed at 1 μM ECG (36%) and 10 μM ECG (69%) after 1 h, in contrast to 6 h, when all doses induced a significant increase (~ 60%). Interestingly, ECG 10 μM showed genotoxic effects depending on time of incubation. In contrast, smaller doses of ECG (0.1 and 1 μM) were able to almost completelly prevent genotoxicity induced by H2O2. In summary, this study demonstrates that ECG can induce a significant improvement in glutamate uptake and S100B secretion. Also, ECG can exert genoprotective or genotoxic effects in C6 cells depending on concentration and time of incubation. These results suggest that ECG could contribute to the neuroprotective role of astroglial cells to counteract brain pathologies associated with oxidative stress.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Juan Lucas Argueso Gomes de Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:31:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_FabianadeMelo_M.pdf: 10932684 bytes, checksum: c31d50d399af1063941a0d931eee8101 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O etanol de cana-de-açúcar brasileiro ocupa um lugar de destaque entre as alternativas energéticas disponíveis atualmente. No processo fermentativo de produção de etanol é utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae, com destaque para a linhagem industrial PE-2, utilizada por cerca de 30% das usinas brasileiras, o que representa 10% da produção mundial. Essa linhagem associa uma alta eficiência na produção de etanol com uma excelente capacidade de adaptação ao ambiente altamente hostil e competitivo das dornas de fermentação. O nosso grupo de pesquisa realizou previamente uma caracterização genética e molecular detalhada de uma linhagem diplóide derivada diretamente de PE-2 (JAY270), o que forneceu inúmeras possibilidades para a manipulação genética dessa levedura com o objetivo de desenvolver linhagens mais produtivas. No entanto, alguns estudos observaram a ocorrência de variação cariotípica nessa linhagem durante o processo fermentativo, o que pode representar uma barreira para a manipulação dessa levedura. Sendo assim, é extremamente importante estudar o comportamento do genoma dessa linhagem durante a produção de etanol. Este projeto de Mestrado teve como objetivo principal a determinação do mecanismo de recombinação genética responsável pela geração de rearranjos cromossômicos na linhagem JAY270 durante a produção de etanol. Foi realizado um experimento de fermentação em escala semi-industrial iniciado com um inóculo puro de JAY270, com duração de 50 dias. A partir de amostras coletadas ao final do processo foram obtidos isolados que foram analisados através de PFGE (Gel de Eletroforese em Campo Pulsado) para identificação de derivados de JAY270 portadores de variação cariotípica. Dos derivados analisados, 36% possuíam algum tipo de rearranjo cromossômico em relação à linhagem inicial, dos quais 11 foram selecionados (FDY1-FDY11) para análises detalhadas. As sequências genômicas de dois derivados haplóides de JAY270 possibilitaram o desenvolvimento de 9 marcadores moleculares para genotipar regiões heterozigotas de JAY270 com o objetivo de identificar eventos de recombinação genética. Os 11 isolados selecionados foram analisados com esses marcadores e, exceto por um deles, todos continuavam heterozigotos em todas as regiões genotipadas. Dois mecanismos de recombinação genética podem ser responsáveis pela geração dos rearranjos, recombinação mitótica, que ocorre em pontos isolados e recombinação meiótica, que envolve todo o genoma simultaneamente em um único ciclo celular. A possibilidade dos rearranjos terem sido gerados por recombinação meiótica foi excluída, visto que a probabilidade dos 10 isolados continuarem heterozigotos em todas as regiões analisadas após um evento de meiose seguido de cruzamento é extremamente baixa (entre 10-24 e 10-14). Sendo assim, concluiu-se que os rearranjos cromossômicos foram gerados durante o crescimento vegetativo, e que, portanto, o mecanismo de recombinação genética responsável pela geração dos mesmos é a recombinação mitótica. Os 11 isolados também foram analisados através de CGH-array, que possibilitou a comparação de sua dosagem gênica com a da linhagem JAY270, que lhes deu origem. Com essa metodologia foi possível detectar eventos de recombinação mitótica que resultaram em perda de heterozigosidade nas extremidades de alguns cromossomos. / Abstract: Brazilian sugar cane ethanol stands out among the energetic alternatives available nowadays. In the fermentation process to produce ethanol it is used the yeast Saccharomyces cerevisiae. One of the most widely adopted strains is the industrial isolate PE-2, currently used by ~30% of Brazilian distilleries, generating ~10% of the world's ethanol supply. This strain combines a high performance in ethanol fermentation and an excellent adaptation to the hostile environment in the fermentation vats. Our research group previously carried out a thorough genetic characterization of an isolate of the PE-2 strain, known as JAY270. This analysis offers several opportunities for the improvement and modification of this strain. However, some studies observed the occurrence of karyotypic variation in this strain during the fermentation process, what can represent a barrier to the genetic manipulation of this yeast. Therefore, it is extremely important to study the genome behavior of this yeast during the ethanol production process. The main objective of this Master's Project was to determinate the genetic recombination mechanism responsible for generating chromosomal rearrangements in JAY270 during the ethanol production. A fermentation experiment in semi-industrial scale was carried out with a pure initial inoculum of JAY270. After 50 days, samples were collected and used to obtain single colony isolates. This isolates were analyzed through PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) to the identification of JAY270 derivatives carrying karyotypic variation. Of the analyzed derivatives, 36% had at least one chromosomal rearrangement. 11 of these derivatives were chosen to perform detailed analyses and were called FDY1-FDY11. The genome sequences of two haploid derivatives of JAY270 were used to develop 9 molecular markers to genotype heterozygous regions of JAY270 to identify genetic recombination events. The 11 isolates were analyzed with these markers and, except by one of them, all isolates were heterozygous in all genotyped regions. Two genetic recombination mechanisms can be responsible for generating the rearrangements, mitotic recombination, which occurs in isolate points of the genome, and meiotic recombination, that simultaneously affects all the genome in one single cellular cycle. The probability of the 10 isolates stay heterozygous in all genotyped regions after one event of meiosis followed by mating is extremely low (between 10-24 e 10-14). This result showed that these rearrangements couldn't be generated through meiotic recombination. Therefore, it was possible to conclude that the chromosomal rearrangements were generated during vegetative growth through mitotic recombination. The 11 isolates also were analyzed through CGH-array to compare their gene dosage with the strain JAY270. With this methodology it was possible to detect mitotic recombination events that resulted in loss of heterozygosity in peripheral regions of some chromosomes. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Anderson Ferreira da Cunha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:17:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Missawa_SilviaKazue_D.pdf: 3036073 bytes, checksum: d9aad0052b5f34581b2bf95098a6d911 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A crescente necessidade da substituição de fontes de energia derivadas do petróleo por fontes renováveis de energia impulsionou pesquisas em todo o mundo. O etanol se enquadra fortemente como candidato para substituir combustíveis como, por exemplo, a gasolina. A produção de etanol brasileiro ocorre pela fermentação de açucares proveniente do caldo de cana, realizada por leveduras, fundamentalmente da espécie Saccharomyces cerevisiae. No processo fermentativo para a produção de etanol combustível no Brasil, a separação das leveduras após o esgotamento do açúcar é realizado por centrífugas de alta capacidade, o que torna o sistema complexo e dispendioso. Neste trabalho, linhagens de leveduras de laboratório e industriais foram transformadas por engenharia genética de modo que as leveduras reconhecessem o esgotamento da glicose do meio separando-se naturalmente e rapidamente. Para isso, plasmídeos e posteriormente, cassetes integrativos, foram construídos utilizando-se promotores, sensíveis a presença de glicose no meio, regulando a expressão de genes da floculação. Estes promovem a formação de agregados celulares que se separam do meio por decantação. Além disso, está relatado na literatura que mutantes respiratórios produzem uma maior quantidade de etanol. Então foi feita a deleção, em leveduras industriais, do gene PET191, cujo produto participa na montagem do citocromo c, que por sua vez é essencial para o funcionamento da cadeia respiratória nestes microorganismos. As leveduras deletadas apresentaram um aumento no rendimento da produção de etanol; na linhagem industrial JAY292, esse aumento foi de 4%. Isto pode refletir ao final de um ano, um aumento de 980 milhões de litros. Os resultados obtidos contribuem para o desenvolvimento tecnológico e industrial desta área estratégica para o país / Abstract: The increased need for replacing energy sources from fossil oil to renewable sources has prompted research initiatives throughout the world. Bioethanol is a highly competitive candidate to replace fuels such as gasoline. The production of Brazilian ethanol occurs by the fermentation of sugars from sugar cane juice by the yeast Saccharomyces cerevisiae. The industrial fermentation process used to produce ethanol fuel in Brazil includes a separation step by high-capacity centrifugation of the yeast cells after the exhaustion of the sugar, which makes the system complex and costly. In this work, laboratory and industrial yeast strains were transformed by genetic engineering techniques so that they are able to recognize the depletion of glucose from the medium and quickly separate by sedimentation, without the need of centrifugation. In order to reach this goal, plasmids and integrative cassettes were constructed using promoters sensitive to the presence of glucose in the environment regulating the expression of the genes that control flocculation. This genetic device promotes the formation of cellular aggregates that are separated from the medium by sedimentation only when glucose is depleted. Furthermore, it is reported in the literature that respiratory mutants produce a higher quantity of ethanol. Consequently, the PET191 gene was deleted in an industrial yeast strain; the gene product pet191 participates in the assembly of cytochome c, which is an essential component of the respiratory chain in these microorganisms. The deleted industrial strain JAY292 showed an increased production of ethanol by 4%. This percentage can be translated in an increase of more than 980 million liters of ethanol produced per year. These results are of great technological and industrial importance, and may contribute to the development of this strategic area for the country / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular