O câncer de mama é a neoplasia de maior ocorrência na população feminina. É uma doença hormônio-dependente com etiologia complexa e multifatorial. O câncer de mama invasivo é uma das principais causas da morbidade e mortalidade de mulheres no mundo. O desenvolvimento e a progressão de câncer de mama estão associados com acúmulo de várias alterações genéticas e epigenéticas, que resultam na expressão gênica diferencial entre células normais e tumorais. A hipóxia pode ser considerada uma das características principais de tumores sólidos e uma força motriz para a sobrevida das células tumorais e progressão maligna. O gene supressor de tumor PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; também denominado PAR-4, prostate apoptosis response-4) tem importante papel na apoptose tanto pela via intrínseca quanto pela via extrínseca e pode ser considerado um alvo para a terapia seletiva de células tumorais uma vez que a expressão de PAR-4 aumenta a sensibilidade da maioria das células de câncer a um segundo estímulo apoptótico. Alguns estudos, incluindo os de nosso grupo, têm mostrado o envolvimento de PAR-4 em câncer de mama e seu papel como fator prognóstico e preditivo de resposta a quimioterapia. No entanto, pouco é conhecido sobre o papel funcional deste gene ou os mecanismos envolvidos na regulação da expressão de PAR-4 na glândula mamária e no processo de tumorigênese da mama. No presente trabalho investigamos os efeitos da hipóxia na expressão de PAR-4 nas linhagens celulares MCF10A, MCF7 e MDA-MB-231. Para isto, as células foram incubadas por períodos de 30 minutos, 1, 2, 6 ou 24 horas em ambiente controlado com 5 % CO2, 95% N2 e 0.2% O2. A expressão de Par-4 foi avaliada quanto aos transcritos, por PCR em Tempo Real e quanto à expressão protéica, por western blot. Observamos que a baixa concentração de oxigênio diminui a expressão do mRNA de PAR-4, em tempos de 6 e 24 horas, nas linhagens MCF10A e MCF7 e no tempo de 24h nas células MDA-MB-231. Já quando os níveis protéicos de Par-4 foram analisados não foi observada diferença significativa nessas células após exposição à condição de hipóxia. A expressão do gene NDRG1, a qual se encontra aumentada em condições de hipóxia, foi utilizada como controle. Nossos dados sugerem que a expressão dos transcritos do gene supressor de tumor PAR-4 é inibida pelos mecanismos celulares de sobrevivência celular ativados durante a hipóxia / Breast cancer has the highest incidence rate of all malignant neoplasias affecting women. It is a hormone dependent disease with complex and multifactorial etiology. Invasive breast cancer is one of the principal causes of women morbidity and mortality in the world. Breast cancer development and progression are associated with accumulation of various genetic and epigenetic alterations, which result in differential gene expression among normal and tumor cells. Hypoxia could be considered one of the principal hallmarks of solid tumors and the driving force for the tumor cell survival and malignant progression. The tumor suppressor gene PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; also known as PAR-4, prostate apoptosis response-4) has an important role in apoptosis either by intrinsic or extrinsic pathways and could be considered as a target for selective therapy of tumor cells. Some studies, including of our group, have shown the PAR-4 involvement in breast cancer and its role as prognostic and predictive factor in response to chemotherapy. However, little is known about functional role of this gene or the mechanisms involved in PAR-4 expression regulation in mammary gland and in breast tumorigenesis process. In the present study we evaluated the hypoxia effects on PAR-4 expression in MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231 cell lines. Therefore, the cells were incubated for time periods of 30 minutes, 1, 2, 6 or 24 hours under controlled environment with 5 % CO2, 95% N2 e 0.2% O2. PAR-4 expression was evaluated for transcripts, by Real Time PCR, and for protein expression, by western blot. We observed that low oxygen concentration decreases PAR-4 mRNA expression, in periods of 6 and 24 hours, in MCF10A and MCF7 cell lines and in the period of 24 hours in MDA-MB-231 cells. However, when the Par-4 protein levels were evaluated, no significant difference was observed in these cells after incubation under hypoxic conditions. NDRG1 gene expression, which is increased under hypoxia, was used as a control. Our data suggest that the expression of tumor suppressor gene PAR-4 transcripts is inhibited by cell survival mechanisms activated during hypoxia

Orientadores: Fabíola Traina, Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T21:37:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_PauladeMelo_D.pdf: 6042513 bytes, checksum: b12134db0721f177eb0c2116e7fdf5e2 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: As neoplasias mieloproliferativas crônicas BCR-ABL1 negativas (NMP) apresentam como característica comum a ocorrência de proliferação celular exacerbada, mantendo a capacidade de diferenciação mieloide terminal. Em parcela significativa dos casos, a ativação da proliferação celular ocorre pelo aumento da atividade tirosinoquinase de proteínas específicas. Entretanto, a heterogeneidade molecular observada nos pacientes e as respostas clínicas insatisfatórias observadas em parte dos casos com os tratamentos vigentes sugerem que mecanismos adicionais, como interações proteicas não descritas e novas mutações, possam estar envolvidos na fisiopatologia destas neoplasias. Neste trabalho, objetivamos estudar as vias de ativação tirosinoquinase em policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) (subprojeto 1), e em mastocitose sistêmica (subprojeto 2). O foco principal do subprojeto 1 consistiu em avaliar, em NMP, a associação JAK2/IRS2, previamente descrita em células não hematológicas após estímulo, bem como o envolvimento de IRS2 em vias de proliferação celular e apoptose. Utilizamos modelos de linhagens celulares leucêmicas humanas com JAK2 mutado (JAK2V617F) e JAK2 selvagem (JAK2WT), submetendo-as a inibição gênica por shRNA entregue por lentivírus e ao tratamento com o inibidor seletivo de JAK1/2 ruxolitinib. As células foram então submetidas à avaliação da viabilidade celular por MTT, e da apoptose por citometria de fluxo (anexina V/PI e caspase-3) e por imunobloting (caspase-3 clivada). A expressão do mRNA de IRS2 foi avaliada por PCR em tempo real em amostras de células CD34+ de sangue periférico de 99 pacientes com diagnóstico de PV, TE e MFP, e em 28 doadores normais. Através de imunoprecipitação e microscopia confocal, observamos a associação constitutiva entre JAK2 e IRS2 nas células JAK2V617F, mas não nas células JAK2WT. Em células JAK2V617F, a inibição de IRS2 por lentivírus diminuiu significativamente a fosforilação de STAT5, reduziu a viabilidade celular, aumentou as taxas de apoptose, e potencializou os efeitos de ruxolitinib. Não houve mudanças nas taxas de viabilidade celular e apoptose nas células JAK2WT inibidas para IRS2. A expressão do mRNA de IRS2 foi significativamente maior nos pacientes com TE em relação aos doadores normais, e em pacientes com NMP portadores da mutação JAK2V617F em relação aos pacientes com JAK2WT. Estas evidências sugerem que IRS2 possa participar das vias de sinalização celular nas NMP através de interação direta com JAK2. A inibição farmacológica de IRS2, isoladamente ou em conjunto com ruxolitinib, é ferramenta potencial no tratamento de pacientes com PV, TE e MFP. No subprojeto 2, nosso objetivo consistiu em investigar mutações no gene KIT em um caso de mastocitose sistêmica familiar seguido em nosso serviço, em que mãe (caso 1) e filha (caso 2) apresentavam extensa infiltração cutânea e da medula óssea por mastócitos, bem como avaliar a sensibilidade dos mastócitos neoplásicos ao tratamento com os inibidores de tirosinoquinase (ITK) imatinibe, dasatinibe e PKC412. Através de sequenciamento por Sanger, identificamos a mutação KITK509I em células de medula óssea total, CD3+ de sangue periférico e mucosa oral de ambas pacientes. Os pais do caso 1 apresentaram KIT selvagem. O tratamento in vitro por 4, 8 ou 12 dias de células totais de medula óssea dos casos 1 e 2 com os ITK avaliados resultou em menor viabilidade celular, avaliada por MTT, e em redução da fosforilação de P70S6K com todas as drogas testadas. Entretanto, apenas o imatinibe evidenciou resposta consistente na indução de apoptose. Foi iniciado tratamento dos casos 1 e 2 com imatinibe 400mg/dia via oral. Três meses após o início, houve normalização da pele e da medula óssea; após dois anos de seguimento, as pacientes mantêm-se em remissão. Embora rara, a mutação KITK509I deve ser pesquisada em todos os casos de mastocitose sistêmica familiar. O imatinibe pode ser considerado como droga de primeira escolha nestes casos / Abstract: The BCR-ABL1 negative chronic myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by increased cellular proliferation with preserved terminal myeloid differentiation. In most cases, the activation of cell proliferation is caused by an increased tyrosine kinase activity of specific proteins. However, patients' molecular heterogeneity and the incomplete clinical responses observed in part of the cases using the current treatments suggest that additional mechanisms, such as unknown protein interactions and new mutations, can be involved in the pathophysiology of MPN. In this study, our main goal was to investigate tyrosine kinase activation pathways in polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) (subproject 1), and in systemic mastocytosis (subproject 2). The focus of subproject 1 consisted in the investigation of JAK2/IRS2 association in MPN, already described in non-hematological cells following extrinsic stimulus, and in evaluating IRS2 function in MPN cell proliferation and apoptosis. JAK2 wild-type (JAK2WT) and JAK mutated (JAK2V617F) human leukemia cell lines were transduced with lentivirus-mediated shRNA targeting IRS2, and treated with vehicle (DMSO) or with the selective JAK1/2 inhibitor ruxolitinib. Cells were then submitted to evaluation of cell viability (MTT) and apoptosis (anexin V/PI and caspase-3 by flow cytometry, and cleaved caspase-3 by immunoblotting). IRS2 mRNA expression was evaluated by real time quantitative PCR in CD34+ peripheral blood cells of 99 patients with PV, ET and PMF, and in 28 healthy donors. Through immunoprecipitation/immunobloting and confocal microscopy, we observed the constitutive JAK2/IRS2 association in JAK2V617F cells, but not in JAK2WT cell lines. In JAK2V617F, IRS2 silencing significantly decreased phospho-STAT5, reduced cell viability, induced apoptosis, and potentiated the effects of ruxolitinib treatment. No differences in cell viability and apoptosis ratios were observed in IRS2 silenced JAK2WT cells. IRS2 mRNA expression was significantly higher in ET patients when compared to healthy donors, and in patients harboring JAK2V617F mutation in relation to JAK2WT. These evidence suggest that IRS2 participate in MPN cell signaling pathways through its interaction with JAK2. IRS2 pharmacological inhibition, alone or in combination with ruxolitinib, may be a potential tool in the treatment of PV, ET and PMF patients. In subproject 2, our main goal was to seek for KIT mutations in a case of systemic familial mastocytosis, followed in our outpatient clinics, in which the mother (case 1) and the daughter (case 2) had extensive skin and bone marrow infiltration by mast cells. Also, we aimed to evaluate in vitro sensitivity of neoplastic mast cells to the treatment with the tyrosine kinase inhibitors (TKI) imatinibe, dasatinibe and PKC412. Using Sanger sequencing analysis, we identified the KITK509I mutation in total bone marrow, peripheral blood CD3+ and oral mucosa cells in both patients. The parents of case 1 had wild type KIT. The in vitro treatment of total bone marrow cells of cases 1 and 2 with TKI for 4, 8 and 12 days resulted in reduced cell viability, as evaluated by MTT, and in reduced phosphorylation of P70S6K for all tested drugs. However, only imatinibe consistently induced apoptosis in both cases. Patients were started on imatinibe 400mg orally per day. Three months following imatinibe treatment, there was a complete reversion of skin and bone marrow mast cells infiltration; after two years of follow-up, cases 1 and 2 remain in complete remission of the systemic mastocytosis. Although rare, KITK509I mutation should be investigated in all cases of familial systemic mastocytosis. Imatinibe is a good first choice for the treatment of these cases / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Diversas linhagens de células de carrapatos já foram estabelecidas em outras regiões do mundo para isolamento de patógenos. O objetivo deste estudo é obter cultivos de células de Rhipicephalus sanguineus para testar o crescimento de alguns bioagentes. O primeiro capítulo trata do estabelecimento da linhagem celular e o segundo, do uso da linhagem como substrato para infecção de patógenos. Ovos de R. sanguineus foram preparados em meio L-15B e mantidos à 30 °C. Quando as células se tornaram confluentes, as culturas foram propagadas e criopreservadas. O descongelamento foi bem sucedido a partir da terceira passagem e a identidade celular foi confirmada por sequenciamento utilizando o fragmento 16S rDNA mitocondrial. As células foram infectadas com Erhlichia canis, Leishmania infantum chagasi e Trypanosoma cruzi, sendo eficientes somente para E. canis. / Several lines of embryonic cells of ticks already been established in other regions of the world, and are used to isolate and propagate pathogens. The aim of this study, is to obtain cell cultures from Rhipicephalus sanguineus to test the growth of some bioagents.The first addressing consists of the establishment of the cells and the second, using the cell lineage as a substrate for the pathogens infection. The egg masses of R. sanguineus were prepared in L-15B medium and cultures were maintained at 30 °C. When a confluent cellular monolayer was obtained, the cultures were passaged and frozen. Defrosting of cryopreserved cultures from the third passage was successful. Cell identity was confirmed by sequencing using 16S rDNA gene fragment. Cells were infected with Erhlichia canis, Leishmania infantum chagasi and Trypanosoma cruzi. Only for E. canis the cells of R. sanguineus were effective as a substrate for growth of this pathogen.

Cultura de células de carrapatos, é uma ferramenta importante, para isolar e estudar os agentes de doenças transmissíveis. Amblyomma sculptum é o principal vetor de Rickettsia rickettsii, o agente da febre maculosa. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar as células deste carrapato, além de testar seu potencial uso, como substrato para o crescimento e isolamento de patógenos. A partir de massas de ovos de A. sculptum, culturas primárias foram, preparadas em meio L-15B, subcultivadas ao atingirem a confluência necessária e criopreservadas em diversas passagens. A boa recuperação celular estabeleceu a linhagem IBU/ASE-16, a qual foi testada para, Rickettsia spp, Trypanosoma theileri e Leishmania infantum chagasi, obtendo-se bons resultados. A citometria de fluxo analisou a expressão de marcadores de células-tronco, proliferação, diferenciação e regulação do ciclo celular, nas IBU/ASE-16. O Δψm mostrou atividade das mitocôndrias e ausência de células inativas. A microscopia confocal, localizou estruturas celulares marcadas com fluorocromos, enquanto que a MEV,mostrou, junções intercelulares, matriz extracelular e redes neuronais. O teste de tumorigênese em camundongos Balb/c nu/nu, não resultou em crescimento de tumores. / Cell cultures of ticks are important tools to isolate and study agents of transmissible diseases. Amblyomma sculptum is the main vector of Rickettsia rickettsii, the agent for spotted fever. The aim of this study was to establish and characterize the cells of this tick, and test their potential use as a substrate for the growth and isolation of pathogens. From a egg masses of A. sculptum, primary cultures were prepared in L-15B medium, subcultured as they reached the necessary convergence and cryopreserved in several passages. The good cell recovery established IBU/ASE-16 lineage, which was tested for Rickettsia spp, Trypanosoma theileri and Leishmania infantum chagasi, yielding good results. Flow cytometry analyzed the expression of stem cell markers, proliferation, differentiation and regulation of the cell cycle, in the IBU/ASE-16 lineage. The Δψm showed activity of mitochondria and absence of inactive cells. Confocal microscopy located cell structures marked with fluorochromes, while MEV showed intercellular junctions, extracellular matrix and neural networks. Tumorigenesis tests in Balb/c nu/nu mice resulted in no tumor growth.

Linhagens endogâmicas (F@1,0) são usualmente utilizadas para a produção de híbridos de milho. Devido a elevada depressão por endogamia no milho, as linhagens endogâmicas apresentam baixa produtividade, encarecendo o custo das sementes de híbridos simples e tornando-os inacessíveis para grande parte dos agricultores dos países em desenvolvimento. Uma alternativa para contornar o problema seria utilizar linhagens parcialmente endogâmicas (0,0 < F < 1,0), selecionadas para capacidade de combinação e uniformidade. Relatos de literatura mostram que (a) híbridos simples de linhagens S3 (F=0,875) devem apresentar performances superiores as de híbridos triplos e duplos de linhagens endogâmicas; (b) a correlação genética entre híbridos simples de linhagens S3 e de linhagens endogâmicas (F@1,0) é elevada (r=0,94); e (c) a produtividade de linhagens S3 é em média 20% superior a de linhagens endogâmicas. Entretanto, a maior dificuldade em se produzir híbridos simples de linhagens parcialmente endogâmicas refere-se à manutenção destas, por apresentarem variabilidade genética. Devido a isto, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade de se produzir e utilizar híbridos simples de linhagens parcialmente endogâmicas S3. Para isso, oito linhagens S3 da população BR-105 e dez linhagens da população BR-106, as quais estão alocadas em grupos heteróticos distintos, selecionadas para capacidade de combinação e uniformidade, originais e mantidas por intercruzamentos e seleção moderada por cinco gerações, foram utilizadas. Durante as gerações de manutenção, pelo menos 50 plantas foram usadas. Estas linhagens e cruzamentos destas com dois testadores de grupos heteróticos diferentes, foram avaliados em quatro ambientes no ano agrícola de 1999/2000. Além disso, as linhagens originais e mantidas foram genotipadas utilizando o marcador molecular AFLP para estimar a similaridade genética entre elas. Os resultados obtidos mostraram que, excetuando-se uma linhagem da população BR-105 em que provavelmente ocorreu contaminação, apenas dois caracteres nas linhagens per se e apenas um caráter nos cruzamentos apresentaram alterações positivas e significativas, de treze caracteres avaliados. Entretanto estas alterações são muito pequenas para serem detectadas visualmente. Os resultados das similaridades genéticas entre as linhagens originais e mantidas, mostraram valores elevados, sendo que o limite superior do intervalo de confiança para a maioria das linhagens atingiu o valor 1,0, indicando que a manutenção das linhagens da forma como foi conduzida as suas integridades genéticas foram mantidas. Estes resultados permitiram concluir que seria viável a utilização de linhagens parcialmente endogâmicas S3 para a produção comercial de híbridos simples de milho. / Inbred lines (F@1.0) are usually used for the production of maize single-crosses. Because of the high inbreeding depression in maize, the inbred lines are lower yielding, which causes the seed prices to be costly and then inaccessible for most of the farmers in the developing countries. One way to circumvent the problem would be the use of partly inbred lines (0.0< F<1.0) selected for combining ability and for uniformity within the lines. Reported results have shown that: (a) theoretically, single-crosses from S3 lines (F=0.875) are expected to have superior performance than that of three-way and double-crosses; (b) the genetic correlation of single-crosses from S3 lines and from their inbred lines (F@1.0) counterparts is fairly high (r=0.94); and (c) S3 lines are on the average 20% higher yielding than highly inbred lines. However, the main difficulty in the production of single-cross from partly inbred lines is the maintenance of their genetic integrity because of the variability within them. Therefore, the ob-jective of this research was to study the feasibility of the development and the production of single-crosses from S3 lines. The genetic material included eight original S3 lines from the BR-105 population, and ten original S3 lines from the BR-106 population, selected for combining ability and for uniformity within them, and their counterparts maintained by sib-mating and mild selection for five generations. During the generations of maintenance at least 50 plants per line were used. The populations BR-105 and BR-106 have been assigned to distinct heterotic groups. The original, the maintained lines and their crosses with testers from different heterotic groups were evaluated in four environments in the growing season of 1999/2000. Also, the S3 lines were genotyped with the AFLP molecular marker in order to estimate the genetic similar-ity between the original and their maintained counterparts. The results showed that out of the 13 traits evaluated only two traits in the lines per se, and only one trait in the crosses changed significantly from the original lines to the maintained counterparts. However those changes are too low to be visually detected. The estimates of the genetic similarities between the original and their maintained counterparts S3 lines were high, and the upper bound of the confidence interval for most of the lines reach the limit value, i.e., 1.0. These results showed that the ap-proach uses for the maintenance of the S3 lines was effective and thus the genetic integrity of the lines were maintained. The results of this research could allow one to expect that would be feasible the use of partly inbred S3 lines for the commercial production of maize single-crosses.

Os gliomas apresentam comportamento amplamente infiltrativo e a invasão para o tecido cerebral sadio adjacente ao tumor o tornam um grande desafio para intervenções clínicas agressivas. Estudos recentes dos mecanismos de invasão de gliomas sugerem que as metaloproteinases (MMPs) desempenham papel crítico neste processo. As MMPs são super-expressas em quase todos os tumores humanos e vastos dados pré-clínicos as apontam como contribuintes do desenvolvimento maligno; portanto, a inibição de atividade de MMPs poderia ser adotada como uma estratégia de terapêutica anti-câncer. A atividade inibitória de MMP-2 e MMP-9 do extrato liofilizado da raiz de P. umbellata foi avaliada em estudos prévios de nosso laboratório por Ropke e colaboradores. Assim, esta dissertação teve como objetivo, primeiramente, explorar a citotoxicidade do extrato de P. umbellata e posteriormente, a avaliar o efeito do 4-neroridilcatecol (o princípio ativo isolado do extrato) quanto à citotoxicidade e potencial de inibição de MMPs durante o processo de invasão de duas linhagens de glioma humano, caracterizadas pelos diferentes níveis de invasividade. Os resultados revelam os índices de citotoxicidade do extrato bruto da raiz de P. umbellata e do composto 4-NC presente nesse extrato. Ensaios de invasão tumoral in vitro em concentrações não citotóxicas mostraram que há forte inibição desse processo pelo composto. Interessantemente, o 4-NC não alterou significativamente a atividade e expressões gênicas e protéicas de MMPs envolvidas na invasão deste tipo de tumor, nem de seus reguladores. O ensaio de fragmentação do DNA nos indica que a morte das células é, em parte, devido à apoptose, além da participação do processo autofágico. Ensaios analisando a expressão de proteínas e genes envolvidos na via de autofagia mostraram que há indução deste processo pelo composto estudado. Quando este processo é inibido farmacologicamente há incremento na morte celular causada pelo 4-NC. Considerando que em câncer, a autofagia é um processo essencial na modulação da resistência a quimioterápicos, descrevemos aqui, que 4-NC, a exemplo de seu poder citotóxico em melanomas, atua no processo invasivo de gliomas e induz morte celular além de desencadear o processo autofágico. / Gliomas present extensive invasive behavior and the invasion to healthy adjacent neural tissue makes this type of tumor a great challenge for aggressive clinical intervention. Recent studies concerning glioma invasion mechanisms suggest that metalloproteinases (MMPs) have a critical role in this process. MMPs are overexpressed in almost all types of human tumors and many pre-clinical data point to them as functional enhancers to malignant development; then, the inhibition of MMP activity could be adopted as an anti-cancer therapeutic strategy. P. umbellate root extract inhibitory activity over MMPs-2 and 9 was previously evaluated in studies from our group by Ropke et al. Thus, this dissertation has as an objective to evaluate the cytotoxic effect of 4-nerolidylcatechol (a compound purified from the P. umbellate extract), and its potential for MMP inhibition during the invasive process of two human glioma cell lines, characterized for their different invasive levels. Our results show the cytotoxic levels of the crude extract from the root of P. umbellate and from the 4-NC isolated from the extract. In vitro tumor invasion assay in non-cytotoxic drug concentrations indicate a strong inhibition of this process by the compound. Interestingly, 4-NC did not significantly alter enzyme activity, genetic or proteic expression of the MMPs involved in glioma invasion, or its regulators. The DNA fragmentation assay shows that cells die, in part, due to apoptosis, but autophagy pathway is also involved in cell death. Assays showing expression of proteins and genes involved in the autophagy pathway showed an increase of this process by the compound studied. Pharmacological inhibition of this process leads to an increase in cell death caused by 4-NC. Considering that in cancer, autophagy plays an essential role in the modulation of chemoresistance, we describe here that 4-NC, as described previously for melanomas, acts on glioma invasive process, induces cell death and is capable of up-regulating autophagic process.

Mieloma Múltiplo é a segunda doença com maior prevalência nas doenças malignidades hematológica, incurável com média de sobrevivência de 3-5 anos. MM é uma malignidade das células do plasma caracterizada pela destruição e reabsorção óssea e supressão da formação do osso. A quimiocina SDF-1 (CXCL12) e seu receptor CXCR4 têm um importante papel direcional na migração, homing das células do plasma em mieloma múltiplo e mobilização das células de MM para fora da medula óssea. A talidomida tem sido usada com êxito no tratamento de pacientes com mieloma múltiplo. Neste estudo verificamos o efeito da talidomida na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo e em linhagem de células de mieloma múltiplo humano (RPMI-8226) tratados e sem tratamento de talidomida. Nossos resultamos mostraram uma expressão heterogênea na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 nos pacientes com mieloma múltiplo estudado (n= 79). Entretanto, pacientes com mieloma múltiplo tratados com talidomida mostraram uma baixa expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXC4 quando comparados com pacientes recém diagnosticados para mieloma múltiplo e pacientes com mieloma múltiplo tratados com outros medicamentos. Nossos resultados sugerem que o tratamento com talidomida induz uma baixa regulação na expressão no ligante SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo / Multiple Myeloma (MM) is a second most prevalent hematological malignancy and remains incurable with a median survival of 3-5 years. MM is a plasma cell malignancy characterized by devastating bone destruction due to the enhanced bone resorption and suppressed bone formation. The chemokine stromal-derived factor-1 (SDF-1) and its receptor CXCR4 play an important role in directional migration, homing of plasma cells in multiple myeloma (MM) and mobilization of MM cells out of the bone marrow. The drug thalidomide has been successfully used in the treatment of patients with MM. In this study, we assessed the effect of thalidomide on SDF-1 and CXCR4 expression in MM patients and human myeloma-derived cell line, RPMI 8226 treated with or without thalidomide. A heterogeneous expression pattern of chemokines SDF-1 and CXCR4 receptor were observed for all MM patients studied. However, patients treated with thalidomide showed a significantly decrease in expression of SDF-1 and CXCR4 as compared to newly diagnosed MM patients and MM patients treated with other drugs. RPMI 8226 cell line treated with 10, 20 and 100µM thalidomide also demonstrated decrease in SDF-1 and CXCR4 expression as compared with cell control (RPMI-8226 without thalidomide). Ours results indicate that thalidomide therapy induces down-regulation of CXCR4 and its ligand SDF-1 in multiple myeloma

O objetivo do projeto foi desenvolver linhagens celulares para um anticorpo terapêutico anti-hTNF&#945; e comprovar sua funcionalidade. Os genes anti-hTNF&#945; foram clonados em células CHO para seleção da população estável mista, demonstrando expressão de anticorpo com reconhecimento de hTNF&#945; em estrutura tridimensional. A população de transfectantes de maior produtividade específica foi escolhida para geração de linhagem monoclonal utilizando a tecnologia robótica ClonePix FL. Não houve diferença estatística entre o anti-hTNF&#945; purificado e o produto de referência na cinética de ligação ao TNF&#945; e reconhecimento diferencial por Fc&#947;Rs em ensaios por SPR O ensaio de atividade funcional mostrou que o anti-TNF&#945; desenvolvido pôde neutralizar a citotoxicidade induzida em células L929 e inibir a expressão de ELAM-1 em HUVEC. Os resultados finais permitiram identificar os três melhores clones, estáveis por 60 gerações. A comparabilidade entre o anti-TNF&#945; desenvolvido e a referência permite admiti-lo como não inferior, um dos requisitos para o desenvolvimento de biossimilar. / The aim of the project was to develop a therapeutic anti-hTNF&#945; antibody and evaluate its functionality. The anti-hTNF&#945; synthezised genes were cloned into CHO cells and stable pools were selected, producing antibodies able to hTNF&#945; three-dimensional structure recognition. The stable pools displaying higher antibody yields were the source for the generation of monoclonal lineage by ClonePix FL robotic technology. The clones selection proceeded using different criteria as cell density, specific productivity, fed-batch performance, kinetics measured by surface plasmonic resonance, hTNF&#945; binding through ELISA, western-blotting and SPR, Fc&#947;Rs binding by SPR. Besides, a small number of clones was tested in functional assays by the impairment of cytotoxicity of hTNF&#945; over L929 cells and the inhibition of ELAM-1 expression by HUVEC. The long term stability testing allowed to finally select 3 top clones, not inferior to adalimumab reference by the above criteria.

Modelos humanizados de porco são muito importantes para pesquisa biomédica e desenvolvimento de novas drogas e tratamentos. Além de ser um melhor modelo para doenças humanas do que animais de menor porte devido sua maior semelhança fisiológica, anatômica, de metabolismo e tempo de vida, o modelo suíno ainda permite suprimento ilimitado de órgãos para transplante. Apesar dessas vantagens, a expressão gênica inconsistente de animais transgênicos tornam a criação e avaliação desses animais muito dispendiosas, imprevisível e não permite a comparação de resultados de animais diferentes de maneira apropriada. Nesse estudo descrevemos uma nova técnica utilizando o promoter endógeno para a geração de um protocolo de substituição de genes com padrão clonal (transplante clonal de genes) sem clonagem de células, preservando a expressão genética e sua regulação intactas. Esse protocolo é reprodutível e pode ser aplicado para mais de um alvo genético, permitindo geração rápida de linhas transgênicas de animais (14-20 dias) com potencial de se tornar o novo padrão para geração de animais transgênicos de grande porte Suínos / Humanized pig models are very important for biomedical research, and drugs and treatment development. Not only it is a better model for diseases than smaller animals because of its closer physiology, anatomy, metabolism and life span, it also may provide unlimited organs for transplantation. In spite of all this advantages, inconsistent gene expression in transgenic animals make its generation and evaluation expensive, unpredictable and do not allow proper outcome comparison between different animals. In this report we describe a reproducible technique utilizing the endogenous promoter for generation of a clonal pattern gene replacement protocol (clonal gene transplant) without cell cloning, maintaining the normal gene expression and its regulation. This protocol is reproducible and applicable to more than one gene target, allowing fast generation of transgenic animals cell lines (as low as 14-20 days) and could become the new standard for transgenic large animal generation

A obtenção de híbridos de milho está relacionada com o aumento de produtividade dessa cultura. Para isso, normalmente são realizados cruzamentos entre linhagens de diferentes grupos heteróticos, que são determinados pelos melhoristas de forma que seja maximizada a divergência entre eles. A escolha dos genitores a serem cruzados pode ser facilitada pelo uso de cruzamentos dialélicos. Os modelos usados para a análise dos dialélicos permitem a estimação de parâmetros úteis para a seleção dos genitores e o estabelecimento de grupos heteróticos, sendo que os efeitos genéticos normalmente podem ser considerados como aleatórios. A forma tradicional de análise inclui tais efeitos na matriz de incidência dos efeitos fixos e emprega o método dos mínimos quadrados ordinários, o que impossibilita a análise usando a metodologia dos modelos mistos. Os objetivos deste trabalho foram comparar os resultados das análises dialélicas obtidas considerando o modelo fixo e o modelo misto e avaliar a eficiência do melhor preditor linear não viesado (BLUP) para predição de cruzamentos não realizados entre linhagens de milho, utilizando informações de marcadores moleculares RFLP para a estimação da matriz de parentesco. Foram considerados dados de 80 híbridos interpopulacionais e 20 testemunhas comerciais, avaliados em um látice 10 x 10 em três locais. Esses híbridos foram obtidos pelo cruzamento entre 8 linhagens do grupo heterótico BR-105 e 10 do grupo BR-106, as quais foram genotipadas com marcador RFLP. A análise dialélica foi realizada segundo a metodologia que considera o modelo genético como fixo e usa o método dos mínimos quadrados ordinários, e também usando a metodologia de modelos mistos, assumindo que a capacidade geral de combinação (CGC) dos dois grupos heteróticos e a capacidade específica de combinação (CEC) representam efeitos aleatórios. Além disso, foi avaliada a predição de híbridos simples não realizados, com base na matriz de covariâncias genéticas entre o híbrido não realizado e os híbridos preditores, usando as informações do marcador RFLP. Como todos os híbridos foram obtidos, foi simulada a retirada de cada um deles do conjunto, sendo sua performance predita a partir dos 79 restantes. Os resultados mostraram que, na comparação entre as análises dialélicas obtidas com as duas metodologias, embora os valores da CGC das linhagens da população BR-106 e da CEC tenham baixa correlação entre as duas metodologias (r=-0,11 e r=-0,06, respectivamente), a classificação dos híbridos mais produtivos sofre poucas alterações (r=0,99) e não causa dificuldades na seleção. A eficiência do BLUP para predição de cruzamentos não realizados entre linhagens de milho, utilizando informações de marcadores moleculares para a estimação da matriz de parentesco, mostrou a existência de moderada correlação entre os valores dos BLUP’s da produção de grãos e os valores preditos a partir dos híbridos observados restantes (r=0,35), o que indica que essa metodologia tem capacidade em predizer a estimativa de valores não observados, porém com alguma imprecisão. Os mesmos resultados foram observados entre as capacidades específicas de combinação observadas e as preditas (r=0,30). Conclui-se que a metodologia de modelos mistos pode ser usada, desde que com ressalvas, dada as correlações moderadas. / The obtainment of maize single crosses is related with increasing in productivity. To do so, inbred lines derived of different heterotic groups are crossed. These groups are established in such a way that the genetic divergences among them are maximized. Using diallel crosses can facilitate the choice of the inbred lines to be crossed. The models used to perform these analyses allow estimating genetic parameters that are useful in the selection of parental lines and in determining the heterotic groups. In these models, generally, the genetic effects are considered as random. However, these analyses are usually performed considering these effects in the matrix of fixed effects, and obtaining the parameter estimates according to the ordinary least squares method, making impossible using mixed linear models theory. The aims of this research were to compare the results of diallel analyses obtained by using fixed and mixed models, and evaluate the efficiency of the best linear unbiased predictor (BLUP) in predicting non-realized single crosses. Eighty interpopulation hybrids and twenty commercial checks were evaluated in a 10 x 10 lattice design with two replications located in three environments. These single crosses were obtained by crossing eight and ten inbred lines from BR-105 and BR-106 heterotic groups, respectively. These eighteen lines were genotyped by using RFLP molecular markers and then the coefficient of parentage among them was estimated. The genetic parameters general (GCA) and specific (SCA) combining abilities were estimated through diallel analyses, considering the linear model as fixed and using the ordinary least squares as the estimation method. Besides, GCA and SCA were predicted using BLUP and assuming the genetic effects as random. Besides, the prediction of non-realized single crosses was evaluated. To do so, each one of the 80 realized hybrids was predicted based on information of the others 79 single crosses and using the genetic variance-covariance matrix estimated using RFLP information. According to the results, it was found poor correlation between estimatives and predictions obtained considering the model as fixed or mixed, for GCA within BR-106 population (r=-0.11) and for SCA (r=-0.06). However, the ranking of the single crosses for productivity did not change (r=0.99) and did not make selection process more difficult. The efficiency of BLUP in predicting unrealized single crosses was moderated since the correlation between observed and predicted values was r=0.35, indicating some imprecision in these predictions. Similar results were obtained when comparing observed and predicted SCAs (r=0.30). It was possible to conclude that BLUP can be useful in diallel analyses and in prediction of single crosses, but some caution have to be account since the correlations presented moderate values.