Tese de mestrado integrado. Bioengenharia. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Memoria para optar al Título de Químico / En la industria de los surfactantes es cada vez mayor el interés en la producción y aplicación de compuestos derivados de fuentes renovables, entre los cuales se pueden destacar los ésteres de sacarosa. Estos surfactantes son compuestos biodegradables de baja toxicidad, no sensibilizantes, no alergénicos, adecuados como emulsificantes, emolientes y humectantes. La utilización de diferentes tipos de surfactantes en la extracción de lípidos o como agentes solubilizantes de membranas lipídicas, involucra también el empleo de liposomas como modelos de membrana. En este contexto, es de especial relevancia conocer cómo interactúan los ésteres de sacarosa con la bicapa de vesículas o liposomas. Los liposomas o vesículas son agregados coloidales formados por una o más bicapas cerradas que incluyen en su interior una pequeña fracción del medio acuoso en el que se encuentran dispersos. Debido a sus características morfológicas y estructurales, los liposomas son utilizados comúnmente como modelos de membrana celular. Por esta razón, la obtención de sistemas que simulen el medio biológico involucra la síntesis de membranas compuestas por mezclas de fosfolípidos y colesterol. Los esteroles son esenciales a nivel regulatorio y estructural en la organización lateral de las membranas celulares. Su presencia afecta de manera importante las propiedades físicas de membranas sintéticas, observándose comportamientos que han sido asociados a la existencia de microdominios en las membranas celulares. En este trabajo se estudiaron las interacciones entre un éster de sacarosa, surfactante no iónico, y liposomas de distinto tamaño, origen y diferente actividad superficial: 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina, POPC, de origen natural y carácter zwitteriónico y cloruro de dioctadecildimetilamonio, DODAC, molécula anfipática de origen sintético y carga positiva. El éster de sacarosa seleccionado fue el β-D-fructofuranosil-6-O-miristil-α-D-glucopiranósido (MMS), monoéster de sacarosa derivado del ácido mirístico. Todos los sistemas fueron caracterizados en presencia y ausencia de diferentes proporciones de colesterol. Además, se realizaron estudios cinéticos de extracción de colesterol desde membranas para conocer como la presencia del éster de sacarosa afecta la estructuración y permeabilidad de la bicapa. También se estudió el proceso de solubilización de los distintos sistemas para evaluar el efecto de la presencia de colesterol sobre los fenómenos de saturación y solubilización de la vesícula por el éster de sacarosa seleccionado. Finalmente, se siguió el proceso de solubilización en modelos reales utilizando eritrocitos humanos. Los liposomas fueron preparados utilizando técnicas de electroformación, ultrasonicación y extrusión. Para la determinación de las propiedades físicas de la membrana se emplearon metodologías de emisión convencional y de microscopía multifotónica, utilizando como sonda fluorescente el 6-dodecanoil-2-dimetilaminonaftaleno, Laurdan, molécula sensible a los cambios de polaridad de su microentorno, por lo que permite caracterizar bicapas de sistemas microcompartimentalizados. Los resultados obtenidos permitieron descartar la influencia del radio de curvatura sobre las variaciones en la fluidez de la membrana, en las condiciones de temperatura y composición estudiadas. La presencia de colesterol en los sistemas de trabajo mostró el comportamiento esperado, rigidizando la membrana tanto en el estado líquido-cristalino como en el estado gel. En la mayor parte de las experiencias realizadas, la adición de miristil sacarosa permitió observar efectos diferentes en cada uno de los sistemas estudiados, liposomas de POPC y vesículas de DODAC. Como consecuencia, es posible inferir una ubicación distinta de la sacarosa en la interfase, que dependería fundamentalmente del tamaño de la cabeza de la molécula anfipática que conforma el microagregado / A great interest in the production and application of compounds derived from natural resources has been shown by the industry of surfactants, among them sucrose esters are outstanding. These are biodegradable compounds of low toxicity, no sensitizing, hypoallergenic and very good as emulsifiers, emollients and humectants. One of the most interesting applications of these compounds is its use in lipid extraction or as solubilizing agents of lipidic membranes. In this field, liposomes are commonly used as a comprehensive tool of many biological mechanisms, as consequence, is necessary to understand the interactions of these kind of surfactants with different bilayers. Liposomes or vesicles are colloidal aggregates conformed by one or more concentric bilayers that enclose part of the aqueous medium where they are dispersed. Due to their structural characteristics, the liposomes are commonly used mimicking cellular membranes. The obtention of systems that mimics the biological medium involve the preparation of membranes composed by mixtures of phospholipids and cholesterol. The sterols presence is essentials at the regulator and structural level in the lateral organization of cellular membranes. Its presence strongly affects the physical properties of synthetic membranes, the experimentally observed behaviors have been associated to the existence of rafts in cellular membranes. In this work, the interactions between a sucrose ester, nonionic surfactant, and liposomes of different size, origin and different superficial properties were studied: 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (POPC) of natural origin and zwitterionic surface, and Dioctadecyldimethylammonium Chloride (DODAC), amphiphilic molecule of synthetic origin and positive charge. The sucrose ester selected was β-D-fructofuranosyl-6-O-miristyl-α-D-glucopyranoside (MMS), sucrose monoester derivate of miristic acid. All systems were characterized in the presence and absence of different proportions of cholesterol. Furthermore, kinetic studies of cholesterol extraction from membranes were made, in order to distinguish the effect of the presence of sucrose ester on the permeability and structure of the bilayer. Also, the solubilization process of the different systems was studied, with the aim of evaluate the effect of the cholesterol presence on the saturation and solubilization phenomena. Finally, the solubilization process was followed in real models, using human red blood cells. Liposomes were prepared using electroformation, ultrasonication and extrusion techniques. To determine the physical properties of the membrane, conventional emission and multiphotonic microscopy methodologies were employed, with 6-dodecanoyl-2-dimethylaminonaphtalene (Laurdan) as fluorescent probe, this compound is able to sense changes in the microenvironment, allowing characterize compartmentalized systems. According obtained results there is no effect of surface curvature and membrane fluidity, at the temperature and composition studied. The cholesterol presence yields the expected results making more rigid the gel and liquid crystalline phases. Both studied systems (POPC liposomes and DODAC vesicles) behave in different manner in the presence of MMS, so a dissimilar spatial arrangement of sucrose heads can be proposed for each system, being the location in principle function of the lipidic head size

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:12:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Liliane Radoll Ribeiro.pdf: 85648 bytes, checksum: 100baebe5e75ae9143311e745c1f60d3 (MD5) Previous issue date: 2008-04-28 / Genistein is the most abundant isoflavone, displaying the largest number of biological activities. Most studies on genistein have been based on its antioxidant, estrogenic, tyrosine kinase and carcinogenesis inhibitor activities. Genistein is practically insoluble in water and oil in the active form of aglicone, which presents a technical difficulty. To circumvent this problem, the encapsulation of genistein in phosphatidylcholine liposomes seems an efficient alternative for the improvement of solubility. In this work, genistein was encapsulated in phosphatidylcholine liposomes and the drugphospholipid interactions were characterized. It was demonstrated that the interaction of genistein with this lipid membrane model lead to an increased membrane rigidity caused by a tighter packing of the phospholipid bilayer. Encapsulation efficiency for genistein in liposomes reached 99%, with a maximum loading efficiency at the molar ratio of 1:3 (genistein:phosphatidylcholine), resulting in an increase of 1000 times in the water solubility of genistein. Genistein was able to protect membrane phospholipids against CuSO4 induced peroxidation. The liposomal preparation remained stable for at least 40 days, showing its potential as a nanostructured delivery system for this isoflavone for therapeutic and cosmetic applications. / A genisteína é a isoflavona mais abundante e que exibe o maior número de atividades biológicas. A maioria dos estudos sobre a genisteína tem sido realizada com base nas suas atividades antioxidante, estrogênica, inibidora da tirosina quinase e inibidora da carcinogênese. No entanto, a genisteína possui uma dificuldade tecnológica: é pouco solúvel em água e óleo, quando na forma ativa de aglicona. Para contornar esse problema, a encapsulação da genisteína em lipossomas de fosfatidilcolina parece uma alternativa eficaz para a melhora da solubilidade. No presente trabalho, a genisteína foi encapsulada em lipossomas de fosfatidilcolina e as interações entre este fármaco e o fosfolipídeo foram caracterizadas. Foi possível demonstrar que as interações fármaco-lipídeo neste modelo aumentam a rigidez da membrana lipídica devido ao maior empacotamento dos fosfolipídeos na bicamada. A eficiência de encapsulação da genisteína em lipossomas foi elevada, chegando ao índice 99 %, com encapsulação máxima na razão molar de 1:3 (genisteína:fosfolipídeo), o que promove o aumento da solubilidade da genisteína na solução aquosa em cerca de 1000 vezes. Foi demonstrado o efeito protetor antioxidante da genisteína sobre os fosfolipídeos de membrana. A preparação lipossomal permaneceu estável por pelo menos 40 dias, evidenciando seu potencial como sistema carreador para esta isoflavona em aplicações terapêuticas e cosméticas.

El virus C (GBV-C) o virus de la hepatitis G (HGV) está relacionado con el virus de la hepatitis C (HCV) ya que tiene una organización genómica y una homología en la secuencia muy próxima pero, sin embargo, no parece causar hepatitis ni ningún otro tipo de patología. En los últimos años, se han publicado numerosos trabajos en los que se asocia la co-infección del GBV-C/HGV y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) con una menor progresión de la enfermedad causada por el virus VIH así como con una mayor supervivencia de los pacientes una vez que el SIDA se ha desarrollado. Basándonos en un modelo de co-infección, existen diversas teorías de cómo el virus de la hepatitis G puede influir en la enfermedad del VIH, se cree que puede inducir las quemoquinas, regular negativamente los co-receptores del VIH, así como provocar otros efectos indefinidos en los linfocitos huésped. Pero el mecanismo responsable del efecto beneficioso que el GBV-C/HGV tiene sobre el curso de la infección causada por VIH no está todavía definido. Teniendo en cuenta el posible uso de los péptidos sintéticos, el objetivo de la actual tesis doctoral es llevar a cabo la selección de péptidos de la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV con potencial capacidad de inhibición del péptido de fusión del VIH-1, mediante la síntesis múltiple en paralelo de secuencias peptídicas lineales que cubren la totalidad de la estructura primaria de esta proteína y su posterior evaluación mediante ensayos biofísicos. Con ello se pretende plantear la utilización de péptidos sintéticos del GBV-C/HGV en el diseño de inhibidores de la entrada del VIH en la célula huésped. Se pretende así tratar de comprender mejor el efecto de la presencia de anticuerpos anti-GBV-C/HGV en la progresión de la enfermedad causada por la infección del VIH y de profundizar en el conocimiento actual acerca de la interacción entre estos dos virus. Se realiza la síntesis en fase sólida de 58 péptidos correspondientes a la proteína de envoltura E1 del GBV-C/HGV y mediante el ensayo de liberación de contenidos vesiculares se seleccionan 5 péptidos capaces de inhibir la capacidad del péptido de fusión (PF) del VIH-1 de formar poros en las membranas. Se realizan estudios detallados de los péptidos y de la inhibición del proceso de fusión, inducido por el péptido de fusión del VIH-1, por parte de secuencias del GBV-C/HGV. Para ello se realizan estudios de citotoxicidad, ensayos de hemólisis, estudio de la estructura mediante dicroísmo circular, ensayos de agregación de liposomas inducida por los péptidos y ensayos de transferencia de energía por resonancia. Por otra parte se realizan ensayos utilizando monocapas de extensión como modelos de membrana mediante la técnica de Langmuir-Blodgett, y se calculan las concentraciones superficial de exceso y las de saturación, información que servirá para conocer la capacidad de los péptidos para formar monocapas estables en la interfase aire/agua. Los diferentes ensayos muestran una interacción de los péptidos de la proteína E1 con el péptido de fusión del VIH-1, dando lugar a una inhibición de la actividad que el péptido de fusión del VIH-1 tiene sobre las membranas lipídicas. Esto sugiere que estos péptidos pueden ser candidatos para ser utilizados en futuras terapias antivirales. / "BIOPHYSICAL STUDIES OF SYNTHETIC PEPTIDES OF THE ENVELOPE PROTEIN E1 OF GBV-C/HGV AND ITS RELATIONSHIP WITH HIV" The virus C (GBV-C) or hepatitis G virus (HGV) is related to hepatitis C virus (HCV) because it has similar genome organization and sequence homology; however, it does not seem to cause hepatitis or any other pathology. In recent years, there have been several studies in which the GBV-C/HGV and human immunodeficiency virus (HIV) co-infection is associated with less progression of the disease caused by HIV as well as improved survival of patients after AIDS has developed. Based on a model of co-infection, there are several theories of how the hepatitis G virus can affect HIV disease: it could induce chemokines, negatively regulate the HIV co-receptors and cause other undefined effects in the host cell. But the mechanism responsible for the beneficial effect that GBV-C/HGV has over the course of infection by HIV is not yet defined. Taking into account the possible use of synthetic peptides, the aim of the present thesis is to carry out the selection of peptides from the envelope protein E1 of GBV-C/HGV with potential ability to inhibit the HIV-1fusion peptide. The aim is to better understand the effect of the presence of antibodies anti-GBV-C/HGV in the progression of AIDS and to study the interaction between these two viruses. The solid phase synthesis of 58 peptides corresponding to the envelope protein E1 of GBV-C/HGV was made and 5 peptides capable of inhibiting the ability of the fusion peptide (FP) of HIV-1 to form pores in membranes were selected by means of the leakage of vesicular contents assay. Detailed studies of the E1 peptides and their ability to inhibit the fusion process induced by the fusion peptide of HIV-1 were done. Monolayers and liposomes were used as model membranes. The different tests show an interaction of the E1 peptides with the HIV-1fusion peptide, resulting in an inhibition of the activity that the fusion peptide has on lipid membranes. This suggests that these peptides could be good candidates for future antiviral therapies.

S'ha estudiat el desenvolupament de fotosensibilitzadors i la seva formulació en teràpia fotodinàmica. S'han caracteritzat les propietats fotofísiques dels fotosensibilitzadors porficènics. S'han proposat diferents estratègies tals com la introducció de grups carboxilat en la perifèria o ions de metalls pesants en el nucli, per millorar el disseny de nous fotosensibilitzadors basats en el macrocicle porficènic. Entre ells, el temocè (m-THPPo), el porficè anàleg a la temoporfina, mostra excel•lents propietats fotofísiques, fotoestabilitat i alta eficàcia fotodinàmica. A causa de la seva alta hidrofobicitat, s'ha desenvolupat una formulació liposomal per a l'administració in vitro i in vivo del temocè. m-THPPo/DPPC/DMPG (1:67.5:7.5 relació molar) té alta eficiència d'encapsulació mantenint les seves propietats tant fotofísiques com a biològiques. El temocè liposomal va exhibir l'eficàcia fotodinàmica in vitro més alta per molècula internalitzada, sent un sistema d'administració de fàrmacs eficaç per a una estratègia in vivo dirigida a les cèl•lules tumorals. El temocè encapsulat en micel•les de Cremophor EL va mostrar una mínima internalització cel•lular. Consistentment, la formulació micel•lar va mostrar millor la resposta in vivo quan s'utilitza en un règim vascular. Amb la finalitat de minimitzar la internalització del fotosensibilitzador en les cèl•lules normals, es van proposar liposomes decorats amb lligands folat. Aquesta estratègia resulta en una internalització dues vegades major dels liposomes dirigits al receptor folat respecte a la corresponent formulació no específica. Finalment, han estat explorats nous models cel•lulars in vitro per a l'optimització dels processos amb oxigen singlet. Els cultius cel•lulars en 3D reprodueixen l'heterogeneïtat d'oxigen i fotosensibilitzador que està present en els teixits reals, proporcionant informació molt útil per interpretar i predir el resultat de la teràpia fotodinàmica. També s'ha demostrat la capacitat de desactivació de l'oxigen singlet d'antioxidants en un model ex vivo de pell porcina. / Se ha estudiado el desarrollo de fotosensibilizadores y su formulación en terapia fotodinámica. Se han caracterizado las propiedades fotofísicas de los fotosensibilizadores porficénicos. Se han propuesto diferentes estrategias tales como la introducción de grupos carboxilato en la periferia o iones de metales pesados en el núcleo, para mejorar el diseño de nuevos fotosensibilizadores basados en el macrociclo porficénico. Entre ellos, el temoceno (m-THPPo), el porficeno análogo a la temoporfina, muestra excelentes propiedades fotofísicas, fotoestabilidad y alta eficacia fotodinámica. Debido a su alta hidrofobicidad, se ha desarrollado una formulación liposomal para la administración in vitro e in vivo del temoceno. m-THPPo/DPPC/DMPG (1:67.5:7.5 relación molar) tiene alta eficiencia de encapsulación manteniendo sus propiedades tanto fotofísicas como biológicas. El temoceno liposomal exhibió la eficacia fotodinámica in vitro más alta por molécula internalizada, siendo un sistema de administración de fármacos eficaz para una estrategia in vivo dirigida a las células tumorales. El temoceno encapsulado en micelas de Cremophor EL mostró una mínima internalización celular. Consistentemente, la formulación micelar mostró mejor la respuesta in vivo cuando se utiliza en un régimen vascular. Con el fin de minimizar la internalización del fotosensibilizador en las células normales, se propusieron liposomas decorados con ligandos folato. Esta estrategia resulta en una internalización dos veces mayor de los liposomas dirigidos al receptor folato respecto a la correspondiente formulación no específica. Por último, han sido explorados nuevos modelos celulares in vitro para la optimización de los procesos con oxígeno singlete. Los cultivos celulares en 3D reproducen la heterogeneidad de oxígeno y fotosensibilizador que está presente en los tejidos reales, proporcionando información muy útil para interpretar y predecir el resultado de la terapia fotodinámica. También se ha demostrado la capacidad de desactivación del oxígeno singlete de antioxidantes en un modelo ex vivo de piel porcina. / The photosensitizer and formulation development in photodynamic therapy have been studied. They have been characterized the photophysical properties of new porphycene-based photosensitizers. Different strategies such as the introduction of carboxylate groups in the periphery or heavy metal ions in the core have been proposed for improving the design of novel photosensitizers based on the porphycene macrocycle. Among them, temocene (m-THPPo), the porphycene analogue to temoporfin, shows excellent photophysical properties, superior photostability and high photodynamic efficiency. Owing to its high hydrophobicity, a liposomal formulation has been developed for in vitro and in vivo administration of temocene. m-THPPo/DPPC/DMPG (1:67.5:7.5 molar ratio) yielded high encapsulation efficiency maintaining its photophysical and biological properties. Liposomal temocene exhibited the highest in vitro killing efficacy per uptaken molecule and they were an efficient drug delivery system for in vivo tumor cell targeting strategy. Temocene encapsulated in Cremophor EL micelles showed minimal cell internalization. Consistently, micellar formulation showed the best in vivo response when used in a vascular regime. In order to minimize the internalization of the photosensitizer in normal cells, liposomes decorated with folic acid ligands were proposed. This strategy leads to a 2-fold higher uptake of folate-targeted liposomes than the corresponding non-targeted formulation. Finally, new in vitro cellular models for a better optimization of singlet oxygen-involved processes were explored. 3D cellular cultures reproduced the oxygen and photosensitizer heterogeneity found in real tissues, providing useful information to interpret and predict the photodynamic therapy outcome. The singlet oxygen quenching ability of antioxidants in ex vivo porcine skin model has also been demonstrated.