Brevetoxins are natural neurotoxins that are produced by “red tide” algae. In this study, brevetoxin-1 and brevetoxin-2 were incubated with rat liver hepatocytes and rat liver microsomes, respectively. After clean-up steps, samples were analyzed by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry (LC-ES-MS). Two metabolites were found for brevetoxin-1: brevetoxin-1-M1 (MW 900 Da), formed by converting one double bond in the E or F ring into a diol; and brevetoxin-1-M2 (MW 884 Da), a hydrolysis product of brevetoxin-1 involving opening of the lactone ring. The incubation study of brevetoxin-2 found two metabolites. Brevetoxin-2-M1 (MW 912 Da) was elucidated by negative mode LC-MS/MS to be the hydrolysis product of brevetoxin-2. The second metabolite (brevetoxin-2-M2, MW 896 Da) was deduced to be brevetoxin-3. All brevetoxins have high affinities for sodium ions. Attempts to obtain informative product ions from the collision induced decomposition (CID) of [M + Na]+ brevetoxin precursor ions only resulted in uninformative sodium ion signals. In our nano-electrospray experiments, the addition of ammonium fluoride resulted in the formation of the ammonium adduct or protonated brevetoxin with a concomitant decrease of the sodium adduct peak. Product ion spectra of [M + NH4]+ and [M + H]+ were similar and provided useful structural information. The optimal values for ammonium fluoride concentration and the cone voltage were experimentally determined. In negative mode electrospray, without additives, deprotonated molecules of brevetoxins do not appear in high abundances, and thus are not well-suited for CID experiments. Several anions were tested for their abilities to form brevetoxin-anion adducts by mixing ammonium salts of these anions with brevetoxin-2 and brevetoxin-3. Under CID, [M + Cl]-, [M + Br]-, [M + OAc]-, [M + HCOO]-, [M + NO3]- adducts all produced only the respective anions in CID experiments, and thus, gave no structural information. In contrast, upon CID, both [M + F]- and [M + HCO3]- precursor adducts gave structurally-informative fragment peaks that exhibited similarities to those of [M - H]- ions; the detailed fragmentation mechanisms are discussed. In comparison, fluoride is a better choice to study brevetoxins in negative ES-MS by the anionic adduct approach.

Water extracts of saffron, a spice derived from the plant Crocus Sativus L. obtained from India and Iran, were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The components in the extracts were separated on four different solid phase extraction cartridges with four different solvents and by silica gel column. Analysis was done by GC-MS, LC-MS and UV-Vis spectroscopy. The extracts separated into three distinct bands (two bright yellow and one orange) on the silica gel column. Based on GC-MS, the extracted compounds show many structural similarities. Using both extraction techniques, several compounds were identified that were not previously reported to be in saffron. Picrocrocin, safranal, and crocins presence in the extracts were evidenced by absorbance bands at wavelengths of 250 nm, 310 nm and 440 nm, respectively, in their UV-Vis spectra. The LC-MS analysis revealed several high molecular weight compounds that were not observed by GC-MS.

A hidroxicloroquina (HCQ) é um importante fármaco quiral usado, principalmente, no tratamento de artrite reumatóide, lupus eritematoso sistêmico e malária e cujas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas são estereosseletivas. Em relação às propriedades farmacocinéticas, alguns estudos prévios indicam que o metabolismo estereosseletivo parece ser função da espécie estudada, o que implica na necessidade de métodos seletivos para a determinação de seus enantiômeros em materiais biológicos. Assim, propôs-se o desenvolvimento e a validação de métodos para análise dos enantiômeros do fármaco inalterado e de seus principais metabólitos em frações microssomais de homogeneizados de fígado de ratos e camundongos. Para tanto foram empregadas as técnicas de eletroforese capilar (CE) e de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Inicialmente foi desenvolvido um método por HPLC, em uma etapa, para a quantificação dos enantiômeros de dois metabólitos da HCQ, desetilcloroquina (DCQ) e desetilhidroxicloroquina (DHCQ) em microssomas de fígado de ratos e camundongos. A separação foi efetuada utilizando-se a coluna Chiralpak AD-RH e hexano:isopropanol (92:8, v/v) acrescido de 0,1% de dietilamina como fase móvel. O procedimento de extração líquido-líquido foi utilizado para a preparação das amostras. A metodologia desenvolvida resultou na completa resolução dos enantiômeros da HCQ, DCQ e DHCQ e pode ser considerada adequada, visto que os parâmetros de validação mostraram valores dentro dos limites exigidos na literatura. O segundo método desenvolvido permitiu a quantificação dos enantiômeros dos três metabólitos da HCQ: DCQ, DHCQ e bisdesetilcloroquina (BDCQ) em microssomas de fígado de camundongos. A separação foi efetuada utilizando-se um tubo capilar de sílica fundida e solução do eletrólito tris(hidroximetil)aminometano 100 mmol/L, ajustada a pH 9,0 com ácido fosfórico e acrescida de 1% (m/v) de β –CD - sulfatada e 30 mmol/L de β –CD - hidroxipropilada. O procedimento de extração líquido-líquido foi eficiente para remover interferentes e os parâmetros de validação mostraram valores dentro dos limites exigidos na literatura. Os métodos desenvolvidos foram aplicados no estudo in vitro do metabolismo da HCQ em frações microssomais de fígado dos animais, verificando-se que o principal metabólito formado é o (-)-(R)-DHCQ, para ambas espécies estudadas. / Hydroxychloroquine (HCQ) is an important chiral drug used specially in the treatment of rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and malaria, with stereoselective pharmacokinetic and pharmacodinamic properties. Concerning these properties, some previous studies indicate that the stereoselective metabolism seems to be a function of the studied species, therefore selective methods are required for the determination of its enantiomers in biological matrix. Thus, the present work reports the development and validation of methods for the analysis of the enantiomers of HCQ and its main metabolites in microsomal fraction of rats and mice liver homogenates. Capillary electrophoresis (CE) and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used for this purpose. Initially, a one-step HPLC method was developed for the quantification of the enantiomers of two HCQ metabolites, desethylchloroquine (DCQ) and desethylhydroxychloroquine (DHCQ) in microsomal fraction of rats and mice liver homogenates. The separation was performed on a Chiralpak AD-RH column using hexane:isopropanol (92:8, v/v) plus 0.1% diethylamine as the mobile phase. Liquid-liquid extraction procedure was used for sample preparation. The developed methodology resulted in the complete resolution of HCQ, DCQ and DHCQ enantiomers and can be considered suitable because the validation parameters are in accordance with the limits established in the literature. The second developed method allowed the quantification of the enantiomers of the three HCQ metabolites, DCQ, DHCQ and bisdesethylchloroquine (BDCQ) in microsomal fraction of mice liver homogenates. The separation was performed using a fused-silica capillary tube and tris (hydroxymethyl) aminometane 100 mmol/L electrolyte solution, adjusted at pH 9.0 with phosphoric acid, containing 1% (w/v) sulfated- β -CD and 30 mmol/L hydroxypropyl- β -CD. The liquid-liquid extraction procedure was efficient to remove interferents and the validation parameters showed values within accordance to the literature. The developed methods were applied in the in vitro metabolism study of HCQ in microsomal fractions of the liver of the animals and it was verified that the main metabolite formed is (-)-(R)-DHCQ for both animal species studied.

Atualmente, a malária é considerada a principal infecção parasitária existente e apresenta distribuição mundial. Dentre as alternativas terapêuticas utilizadas, destacam-se cloroquina (CQ), mefloquina (MQ) e, recentemente, arteméter (ART). Segundo a literatura, estudos farmacocinéticos destes fármacos têm sido dificultados pela ausência de métodos adequados de análise em fluidos biológicos e, no caso dos fármacos quirais (CQ e MQ), com capacidade de determinar os enantiômeros individualmente. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o emprego da microextração em fase líquida (LPME) na preparação de amostras para a determinação destes três fármacos antimaláricos e respectivos metabólitos em plasma. O método para análise enantiosseletiva de CQ e metabólitos teve a LPME como técnica de preparação de amostras, a qual apresentou valores de recuperação no intervalo de 28-66%. Estes analitos foram separados na coluna Chirobiotic V em fase polar-orgânica, com posterior detecção por espectrometria de massas (MS), com interface de eletronebulização (ESI) no modo positivo. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 5-500 ng mL-1 para todos os analitos avaliados. A disposição cinética de CQ e do principal metabólito monodesetilcloroquina (DCQ) em ratos sugere enantiosseletividade após administração do fármaco na forma racêmica, com maiores concentrações de (+)-(S)-CQ e (-)-(R)-DCQ. O método para análise dos enantiômeros de MQ e do metabólito aquiral carboximefloquina (CMQ) também foi desenvolvido empregando LPME na preparação das amostras. A extração destes analitos foi realizada em duas etapas para eficaz recuperação dos mesmos (valores entre 35-38%). Os analitos foram separados na coluna Chirobiotic T em fase polarorgânica, com detecção por absorção no ultravioleta em 285 nm. O método apresentou linearidade no intervalo de 50-1500 e 50-3000 ng mL-1 para os enantiômeros de MQ e CMQ, respectivamente. A disposição cinética de MQ em ratos indica enantiosseletividade com maiores concentrações de (+)-(RS)- MQ após administração do fármaco na forma racêmica. A separação cromatográfica em fase reversa de ART e metabólito diidroartemisinina (DHA) foi alcançada utilizando-se coluna contendo Si-Zr-PMTDS como fase estacionária e a detecção destes analitos foi realizada empregando-se MS no modo ESI positivo. O procedimento otimizado de LPME em duas fases para extração de ART e DHA em plasma resultou em valores de recuperação de 32 e 25%, respectivamente. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 5- 1000 ng mL-1 para ambos os analitos. O estudo piloto de disposição cinética em ratos evidenciou maiores concentrações de DHA. Os resultados obtidos confirmam a viabilidade da LPME para extração destes antimaláricos e respectivos metabólitos em plasma. / Currently, malaria is the main parasitic infection and shows worldwide distribution. Among therapeutic options used, chloroquine (CQ), mefloquine (MQ) and, more recently, artemether (ART) have been standing out. According to the literature, pharmacokinetic studies of these drugs have been hampered by the lack of proper methods of analysis in biological fluids and, regarding the chiral drugs (CQ and MQ), with the ability to determine the individual enantiomers. Therefore, the aim of this work was to evaluate the utilization of liquid-phase microextraction as the sample preparation technique for the determination of these antimalarial drugs and their metabolites in plasma. The enantioselective analysis of CQ and its metabolites was carried out using LPME as technique of sample preparation, which yielded recovery rates within 28- 66%. These analytes were resolved on a Chirobiotic V column in the polarorganic mode and further detected using mass spectrometry (MS) with electrospray interface (ESI) in the positive mode. The developed method was linear in the range of 5-500 ng mL-1 for all analytes studied. The kinetic disposition of CQ and its main metabolite monodesethylchloroquine (DCQ) in rats suggests enantioselectivity following the administration of the racemic drug, with higher concentrations of (+)-(S)-CQ and (-)-(R)-DCQ. The method for the analysis of the enantiomers of MQ and its achiral metabolite carboxymefloquine (CMQ) also had LPME as technique of sample preparation. The extraction of these analytes was carried out in two-steps to obtain efficient recovery rates (values within 35-38%). The analytes were resolved on a Chirobiotic T column in polar-organic mode and ultraviolet detection was performed at 285 nm. The method was linear in the range of 50-1500 and 50-3000 ng mL-1 for the enantiomers of MQ and CMQ, respectively. The kinetic disposition of MQ in rats indicates enantioselectivity with higher concentrations of (+)-(RS)-MQ following the administration of the racemic drug. The chromatographic resolution of ART and its metabolite dihydroartemisinin (DHA) in the reversed mode was achieved utilizing a column containing Si-Zr-PMTDS as stationary phase and their detection was conducted employing MS in the positive ESI mode. The optimized two-phase LPME procedure for the extraction of ART and DHA from plasma showed recovery values of 32 and 25%, respectively. The developed method was linear over the range of 5-1000 ng mL-1 for both analytes. The pilot study of kinetic disposition in rats showed higher concentrations of DHA. The obtained results confirm the feasibility of LPME for the extraction of these antimalarial drugs and their metabolites from plasma.

O rio Itapecuru foi investigado quanto a sua atividade estrogênica por meio das técnicas de ecotoxicologia aquática e de cromatografia líquida. No município de Bacabeira, amostras de água do rio Itapecuru foram coletadas no ponto de captação do sistema de abastecimento público de água que atende cerca da metade da população de São Luís, capital do Maranhão. Elas foram utilizadas na realização de ensaios ecotoxicológicos crônicos de 21 dias com Danio rerio e Oreochromis niloticus. A VTG nestes organismos-teste foi quantificada por meio do ensaio imunoenzimático ELISA, cujos resultados indicaram a indução de VTG em machos de ambas as espécies. Portanto, a água do rio Itapecuru continha substâncias em concentração suficiente para causar alterações endócrinas no sistema sexual reprodutivo de Danio rerio e de Oreochromis niloticus. Para investigação da ocorrência de 17 β-estradiol (E2) e 17 α-etinilestradiol (EE2), foi desenvolvido um método analítico que utilizou a extração em fase sólida seguida da análise cromatográfica líquida de alta eficiência acoplada a um detector de fluorescência. O método foi validado e demonstrou-se ser seletivo, preciso (E2 = 3,08% e EE2 = 2,26%), exato (E2 = 78,05% e EE2 = 92,26%) e com recuperação adequada (E2 = 99,24% e EE2 = 99,71%). Apresentou também LD de 6,96 e 20,78 ng.L-1 e LQ de 10,36 e 29,33 ng.L-1, respectivamente para E2 e EE2. A robustez, avaliada por meio do teste de Youden, mostrou os pontos robustos e os críticos do método de análise. Nas amostras de água do rio Itapecuru coletadas posteriormente aos testes ecotoxicológicos, encontrou-se EE2, sendo 13,48 ng.L-1 em uma e abaixo do LQ na outra. O estrógeno E2 não foi encontrado em quaisquer das amostras. / The Itapecuru river (Maranhão, Brazil) was investigated regarding its estrogenic activity by means of aquatic ecotoxicology and liquid chromatography. At Bacabeira, water samples were collected at the river Itapecuru uptake point of the public water supply system that serves about half the population of Sao Luis, Brazil. Using them, we performed 21 days chronic ecotoxicological tests using Danio rerio and Oreochromis niloticus. In these test organisms, VTG was quantified by means of enzyme-linked immunosorbent assay ELISA, whose results indicated the induction of VTG in males of both species. Therefore, the Itapecuru river water had substances in concentration sufficient to cause endocrine disruption in the reproductive system of Danio rerio and Oreochromis niloticus. To investigate the occurrence of 17β-estradiol (E2) and 17α-ethinylestradiol (EE2) in that same river, we developed an analytical method using solid phase extraction followed by high performance liquid chromatography coupled to a fluorescence detector. The method was validated and shown to be selective, precise (E2 = 3.08% and EE2 = 2.26%), exact (E2 = 78.05% and EE2 = 92.26%) and with suitable recovery (E2 = 99.24% and EE2 = 99.71%). LOD of 6.96 and 20.78 ng.L-1 and LOQ of 10.36 and 29.33 ng.L-1 were found, respectively to E2 and EE2. The robustness was assessed by Youden test and highlighted the robust and the critical points of the chromatographic method. In two of the water samples analyzed from Itapecuru River, EE2 was found, one of it with 13.48 ng.L-1 and the another below the LOQ. E2 was not detected in any of the samples.

As copaíferas fazem parte de um importante gênero de plantas que produzem um exsudato denominado como oleorresina, que é constituído por uma mistura de sesquiterpenos e diterpenos ácidos. A medicina popular utiliza a oleorresina de diferentes espécies de Copaifera com diversas indicações, tais como: ação anti-inflamatória, antimicrobiana, cicatrizante, antitumoral, entre outras. Desta forma, numerosos pesquisadores têm investigado a composição química e as atividades biológicas e toxicológicas deste produto natural, a fim de reconhecer os benefícios e a segurança deste produto. Todavia, estudos da composição química e das atividades biológicas dos constituintes das folhas são escassos. Assim, neste projeto buscou-se investigar a composição química de diferentes extratos de folhas e de oleorresinas de copaíferas coletadas na flora brasileira, bem como produtos comerciais (óleo de copaíba) propondo e aplicando métodos analíticos em cromatografia para determinação dos principais constituintes das amostras. Dez amostras de folhas e oleorresinas autênticas de diferentes espécies foram coletadas no norte e sudeste do Brasil (C. langsdorffi Desf., C. duckei Dwyer, C. reticulata Ducke, C. multijuga Hayne, C. paupera (Herzog) Dwyer, C. pubiflora Benth, C. lucens Dwyer, C. oblogifolia Mart, C. trapezifolia Hayne, e Copaifera sp.) e mais seis amostras comerciais foram adquiridas. Os compostos voláteis foram separados da oleorresina bruta utilizando-se o aparelho de Clevenger. Os padrões cromatográficos foram isolados utilizando-se diferemntes modalidades cromatográficas. As oleorresinas de C. multijulga e C. langsdorffii apresentaram os maiores teores de óleo volátil das amostras com 92 e 72%, respectivamente. Três diterpenos foram isolados da oleorresina de C. duckei: os ácidos ent-poliáltico, ent-diidroagático e ent-agático-15-metil éster. Uma análise qualitativa foi otimizada usando microextração em fase sólida seguido de análise em CG-EM, a qual revelou a presença em comum do ?-copaeno, ?-elemeno, ?-cariofileno e ?-bergamoteno em todas as amostras de oleorresina analisadas. Dois métodos analíticos utilizando CLUE-EM/EM e CG-DIC foram desenvolvidos, otimizados e validados para análise de nove diterpenos ácidos e quatro sesquiterpenos, os quais apresentaram adequada seletividade/especificidade, faixa de trabalho, limite de detecção, limite de quantificação, precisão e exatidão. Todavia, em ambos os métodos há necessidade de controle rigoroso das condições analíticas dos sistemas cromatográficos. Os resultados obtidos aplicando os dois métodos indicaram a presença frequente do ?-cariofileno e dos ácidos ent-copálico e ent-caurenoico como as substâncias mais encontradas em oleorresinas de copaíferas autênticas e comerciais. A análise qualitativa empregando CLUE-EM indicou a presença dos ácidos di-O-metil-3,5-di-O-galoilquínico (AGQ-8), 5\',5\'\'-di-O-metil-4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-9), 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico (AGQ-16), afzelina e quercitrina nos extratos das folhas de nove amostras de copaíferas. Os métodos analíticos desenvolvidos são confiáveis para as análises dos componentes fixos e voláteis e os resultados obtidos neste trabalho confirmam a variabilidade da composição química das oleorresinas desse gênero vegetal. / Copaifera plants are part of an important genus that produces an exsudate called oleoresin, which consists of a mixture of sesquiterpenes and acid diterpenes. Folk medicine uses the oleoresin of different Copaifera species for different health problems, such as: anti-inflammatory, antimicrobial, wound healing and antitumor, among others. Thus, numerous researchers have investigated the chemical composition, biological and toxicological activities of this natural product in order to recognize its benefits and safety. However, investigation of chemical composition and biological activities of leaf contituents are scarce. In this project we aimed to investigate the chemical composition of different leaf extracts and Copaifera oleoresins collected in the Brazilian flora and acquired in the market (copaíba oil) by proposing and applying chromatographic analytical methods to determine their main constituents. Ten samples of leaves and authentic oleoresins of different species were collected in northern and southeastern parts of Brazil (C. langsdorffi Desf., C. duckei Dwyer, C. reticulata Ducke, C. multijuga Hayne, C. paupera (Herzog) Dwyer, C. pubiflora Benth, C. lucens Dwyer, C. oblogifolia Mart, C. trapezifolia Hayne, e Copaifera sp.) and six commercial samples were purchased. The volatile fraction of the crude oleoresin was obtained by using Clevenger apparatus, and the chromatographic standards were isolated by using different chromatographic techniques. The oleoresins of C. langsdorffii and C. multijuga displayed the highest volatile oil contents. Three diterpenes were isolated from C. duckei oleoresin: ent-polialthic, ent-dihydroagathic and ent-agathic-15-metil ester acids. A qualitative analysis was optimized using solid phase micro-extraction followed by GC-MS analysis, which revealed the presence of ?-copaene, ?-elemene, ?-caryophyllene and ?-bergamotene in all investigated oleoresins. Two analytical methods using UPLC-MS/MS and GC-FID were developed, optimized and validated for the analysis of nine acid diterpenes and four sesquiterpenes, which gave adequate selectivity/specificity, range, limit of detection, limit of quantification, precision and accuracy. However, in both methods there is a need for rigorous control of the analytical conditions. The results generated by the two methods indicated the frequent presence of ?-caryophyllene, ent-copalic and ent-kaurenoic acids as the compounds frequently found in authentic and commercial Copaifera oleoresins. Qualitative analysis of leaf extracts using UPLC-MS/MS indicated the presence of 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-8), 5\',5\'\'-di-O-methyl-4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-9), 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid (GQA-16), afzelin and quercetrin in all studied species. The analytical developed methods are reliable for the analyses of both fixed and volatile compounds of the oleoresins. The obtained results confirm the variability among the composition of the Copaifera oleoresins.

Técnicas modernas de preparo de amostra têm sido utilizadas na determinação de diferentes classes de compostos em diversos tipos de matrizes. Essas técnicas podem ser divididas em dois grandes grupos, as baseadas em solvente e as baseadas sorvente, foco do trabalho. Dentre os materiais sorventes mais estudados atualmente, os derivados de grafeno têm se destacado devido a suas propriedades físico-químicas favoráveis para realizar sorção com uma grande variedade de compostos de interesse. Por isso, no presente trabalho são apresentadas possibilidades de utilização de materiais baseados em grafeno nas seguintes técnicas de preparo de amostras: microextração por sorvente empacotado (MEPS), extração \"\"on-line\"\" e extração sortiva em barra de agitação (SBSE). Para a técnica MEPS, foi realizado a síntese de óxido de grafeno e grafeno suportados por ligação covalente em aminopripil sílica. Esses materiais foram empregados como sorventes para determinação de parabenos em amostras de água. O método desenvolvido apresentou limites de quantificação (LOQ) que variaram de <a name=\"_Hlk498351551\">0,2 a 0,3 &mu;g/L, coeficientes de variação (CV) &lt; 19,2% e exatidão de 82,3 a 119,2%. Os materiais utilizados na técnica MEPS também foram utilizados para empacotar colunas de extração \"on-line\" e realizar uma comparação entre as fases sintetizadas. O método de extração \"on-line\" apresentou LOQ de 0,5 &mu;g/L, exatidão de 88,2 à 107,2 e CV &lt; 16%. A comparação entre as colunas de extração empacotadas com o grafeno e seu óxido suportados na aminopropil sílica mostrou que o grafeno suportado na sílica apresenta maior retenção para os parabenos mais apolares. Com relação ao desenvolvimento de barras de SBSE revestidas com grafeno, o método desenvolvido empregando as barras de SBSE apresentou valores de LOQ que variaram de 2 à 8 &mu;g/L, exatidão de 81,9 à 126,3% e CV &lt; 30%. Além disso, avaliou-se o uso do grafeno e óxido de grafeno ligado a sílica com grupamentos amino variando algumas condições de síntese e testando esses materiais para analitos das classes das triazinas, sulfonamidas e anti-inflamatórios não esteroidais. Também são apresentados testes iniciais realizados para um novo modo de extração proposto, similar a técnica SBSE, avaliando a extração de parabenos e anti-inflamatórios não esteroidais. / Modern sample preparation techniques have been applied to the determination of different compounds class in several matrices. These techniques might be divided into two groups, solvent and sorbent based, the last being the goal of this work. Nowadays, among the most studied materials the graphene based ones has been highlighted due to its physical chemical properties favorable to sorption process of a variety of interested compounds. The present work shows possibilities to employ graphene based materials in the follow sample preparation techniques: microextraction by packed sorbent (MEPS), \"on-line\" extraction, and stir bar sorptive extraction (SBSE). For MEPS, the materials graphene oxide and graphene supported on aminopropyl silica through covalent bounds were synthesized. These materials were employed as sorbent to determine parabens in water samples. The developed method showed limits of quantification (LOQ) ranging from 0,2 a 0,3 &mu;g/L, coefficients of variation (CV) &lt; 19,2% and accuracy ranging from 82,3 à 119,2%. The synthetized materials used in MEPS were also used and compared to an \"on-line\" method employing an extraction column packed with them. The \"on-line\" method showed LOQ of 0,5 &mu;g/L, accuracy ranging from 88,2 to 107,2 and CV &lt; 16%. The comparison between packed column with graphene and graphene oxide supported on aminopropyl silica showed that graphene had a higher retention for parabens with high Log Kow. The method developed with SBSE bars coated with graphene showed LOQ ranging from 2 to 8 &mu;g/L, accuracy ranging from 81,9 to 126,3% and CV &lt; 30%. Moreover, the employment of graphene oxide and graphene synthetized by changing some synthesis conditions and testing these materials to extract triazines, sulfonamides, and non-steroidal anti-inflammatory drugs was also evaluated. In addition, are presented the preliminary tests regarding to a new extraction mode, similar to SBSE. These tests were done for parabens and non-steroidal anti-inflammatory drugs.

Tinidazol, 1-[2-(ethylsulphonyl)ethyl]-2-methyl-5-nitroimidazole, é um membro da classe dos nitroimidazóis que apresenta atividade amebicida, giardicida, tricomonicida e anaeróbica. O objetivo deste estudo foi avaliar a bioequivalência de duas marcas comerciais de comprimidos contendo 500 mg de tinidazol em voluntários sadios. O ensaio de bioequivalência entre o produto teste (Amplium® - FARMASA) e o produto referência (Pletil® - Pharmacia do Brasil Ltda) foi do tipo randomizado, cruzado e aberto. O medicamento foi administrado em dose única de 500 mg de tinidazol a 24 voluntários sadios. Amostras de sangue foram coletadas até 72 horas após a administração e analisadas através de método de cromatografia líquida de alta eficiência validado com detecção UV. As curvas médias de decaimento plasmatico obtidas para o produto teste (Amplium® - FARMASA) e para o produto referência (Pletil® - Pharmacia do Brasil Ltda) foram semelhantes, da mesma forma que os parâmetros farmacocinéticos Cmax (referência: 11,34 µg/mL; teste: 11,11 µg/mL), t<SUB.max (referência: 1,67 h; teste: 1,71 h), AUC0-t (referência: 201,92 µgxh/mL; teste: 198,15 µgxh/mL), AUC0-&#8734; (referência: 208,25 µg/mL; teste: 203,80 µgxh/mL) e t(½)el (referência = 14,05 h; teste = 13,91 h). A análise multivariada realizada através da análise de variância (ANOVA), para avaliação dos efeitos produto, grupo e período, revelou a ausência destes efeitos no estudo, indicando que o delineamento do estudo foi apropriado. Os valores do intervalo de confiança 90% para a razão de Cmax (93.9 % - 102.6 %), AUC0-t (94.9 % - 101.1 %) e AUC0-&#8734; (94.6 % -100.8 %) encontram-se entre 80 - 125 %, intervalo proposto pelo FDA e ANVISA. A comparação estatística dos parâmetros AUCo-t , AUC0-&#8734; e Cmax indicam claramente não haver diferença significativa entre os dois produtos contendo 500 mg de tinidazol. Baseado nos resultados farmacocinéticos e estatísticos deste, pode-se concluir que os dois produtos são bioequivalentes e podem ser considerados intercambiáveis na terapêutica. / Tinidazole, 1-[2-(ethylsulphonyl)ethyl]-2-methyl-5-nitroimidazole, is a member of the 5-nitroimidazole class of antimicrobial agents with amoebicidal, giardicidal, trichomonicidal and anaerobic activity. The purpose of this study was to evaluate the bioequivalence of two brands of tinidazole 500mg tablets in healthy human volunteers. The procedure of bioequivalence between the test product (Amplium® - FARMASA) and reference product (Pletil® - Pharmacia do Brasil Ltda) was a randomized, crossover and open study. The medication was administered in a single dose of 500 mg of tinidazole to 24 healthy volunteers. Blood samples were collected until 72 hours after administration and analised using a validated high-performance liquid chromatographic method with UV detection. The average plasmatic decay curves obtained for the test product (Amplium® - FARMASA) and reference product (Pletil® - Pharmacia do Brasil Ltda) were similar, in the same way as were the pharmacokinetic parameters Cmax (reference: 11.34 µg/mL; test: 11.11 µg/mL), tmax (reference: 1.67 h; test: 1.71 h), AUC0-t (reference: 201.92 µgxh/mL; test: 198.15 µgxh/mL), AUC0-&#8734; (reference: 208.25 µg/mL; test: 203.80 µgxh/mL) and t(½)el (reference = 14.05 hours, test = 13.91 hours). The multivariate analysis accomplished through analysis of variance (ANOVA), for assessment of product, group and period effects, revealed the absence of any of these effects in the present study, indicating that the crossover design was properly performed. j The 90% confidence intervals for the ratio of Cmax (93.9 % - 102.6 %), AUC0-t (94.9 % - 101.1 %) and AUC0-&#8734; (94.6 % - 100.8 %) values for the test and reference products are within the 80 - 125 % interval proposed by FDA and ANVISA. Statistical comparison of AUC0-t , AUC0-&#8734; and Cmax clearly indicated no significant difference between the two brands of tinidazole 500 mg tablets. Based on the pharmacokinetic and statistical results of this study, we can conclude that the two products are bioequivalent, and can be considered interchangeable in medical practice.

A monitorização terapêutica tem sido descrita como valioso recurso clínico, na individualização do regime de dosagem, de acordo com a concentração do fármaco e/ou de seus produtos de biotransformação, em amostras de plasma ou soro, coletadas com base no contexto clínico e nos princípios da farmacocinética. Em razão da complexidade dos fluidos biológicos e da baixa concentração dos fármacos nestas matrizes, a etapa de preparo de amostra, extração, pré-concentração dos analitos e eliminação dos interferentes, têm sido requerida para o desenvolvimento de métodos cromatográficos com alta sensibilidade e seletividade analítica. A extração sortiva em barra de agitação (SBSE), recente técnica de preparo de amostra, baseia-se no equilíbrio de sorção do analito entre as fases: extratora (polidimetilsiloxano) e amostra aquosa. A fase extratora PDMS é a única disponível no mercado, o que tem limitado a sensibilidade e a seletividade analítica da técnica SBSE. O uso de polipirrol (PPY) como fase extratora está relacionado às diferentes interações de seus grupos funcionais (hidrofóbica, &#61552;-&#61552;, com o grupo funcional polar, troca iônica, ácido-básica, dipolo-dipolo e dipolo induzido-dipolo.) com os analitos. Neste trabalho, uma nova fase extratora SBSE, com o revestimento misto PDMS/PPY foi avaliada para análises de antidepressivos em amostras de plasma, por cromatografia líquida de alta eficiência. A otimização das variáveis SBSE: tempo e temperatura de extração, tempo de dessorção e pH da matriz biológica, baseada no equilíbrio de sorção dos analitos entre as fases: polimérica (PDMS/PPY) e fluido biológico, permitiu a determinação dos analitos em concentrações plasmáticas que contemplam o intervalo terapêutico. A presença de estrutura porosa (PPY) e não porosa (PDMS) na superfície polimérica da barra extratora SBSE-PDMS/PPY foi confirmada através de análises por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). De acordo, com os resultados obtidos nas análises de MEV e nas análises (individuais e simultâneas) de amostras de plasma enriquecidas com os analitos, os mecanismos de retenção dos fármacos junto à superfície PDMS/PPY ocorreram através dos processos de adsorção (PPY) e absorção (PDMS). A validação analítica foi realizada segundo as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. O método padronizado apresentou linearidade no intervalo de concentração plasmática que variou dos limites de quantificação a 500 ng mL-1, coeficientes de determinação maiores que 0,994, precisão inter ensaios com coeficientes de variação menores que 15% e exatidão de 96% a 106%. Os valores de limites de quantificação obtidos são congruentes com a menor concentração plasmática do intervalo terapêutico preconizado. O método SBSE-PDMS/PPY padronizado e validado foi utilizado para determinações dos antidepressivos, sertralina, duloxetina e fluoxetina em amostras de plasma de pacientes, em terapia com estes fármacos. Desta forma, o método SBSE-PDMS/PPY poderá ser empregado para fins de monitorização terapêutica. / Therapeutic drug monitoring has been described a valuable clinical resource for the customization of the dosage regimen, in accordance with the drug concentration and/or its biotransformation products, in of plasma or serum samples, collected on the basis of clinical context and pharmacokinetics principles. Due the complexity of biological fluids and the low concentration of the drug in these matrices, an stage of sample preparation, extraction, pre-concentration of the analytes and elimination of the interferents has been required for the development of chromatographic methods with high sensitivity and analytical selectivity. Stir bar sorptive extraction (SBSE), a recent sample preparation technique, is based on the sorption equilibrium of the analytes between the polydimethylsiloxane (PDMS) and aqueous phases. PDMS is the only commercially available extraction phase (SBSE), which has limited the analytical sensitivity and the selectivity of the SBSE technique. The use of polypyrrole (PPY) as extraction phase is related to the different interactions of its functional groups (&#61552;-&#61552; interactions, polar groups interactions, acid-base, dipole-dipole, dipole-induced-dipole) and the analytes. In this work, a new SBSE extraction phase, with a PDMS/PPY coating was evaluated for the analysis of antidepressants in plasma samples by High Performance Liquid Chromatography. The optimization of the SBSE variables extraction time and temperature, dessorption time and pH of the biological matrix based on the sorption equilibrium of the analytes between the polymeric (PDMS/PPY) and biological fluid phases, allowed determination of the analytes in plasmatic concentrations that correspond to the therapeutic interval. The presence of a porous structure (PPY) as well as no none, porous (PDMS), on the polymeric surface of SBSE-PDMS/PPY was confirmed by Scanning Electron Microscopy (SEM) analyses. In agreement with the results obtained by SEM analyses and individual and simultaneous analyses of the plasma samples spiked with the analytes, the mechanisms of drugs retention on the surface of PDMS/PPY occur through adsorption (PPY) and absorption (PDMS). Analytical validation was carried through according to the norms of the National Agency of Sanitary Vigilance. The standardized method presented linearity in the plasmatic interval concentrations that varied from the limits of quantification to 500 ng mL-1, the determination coefficients were higher than 0.994, inter precision assays with coefficients of variation lower than 15%, and accuracy from 96% to 106%. The quantification value limits were in agreement with the lowest plasmatic concentration of the established therapeutical interval. The standardized and validated SBSE-PDMS/PPY method was used for determination of sertraline, duloxetine and fluoxetine in plasma patient samples under therapy with these drugs. Thus, the SBSE-PDMS/PPY method could be used for therapeutic drug monitoring.

A análise de fármacos e outras moléculas relacionadas em fluidos biológicos é essencial no âmbito farmacêutico. Atualmente, a demanda por análises rápidas e mais complexas impulsiona a química analítica para o desenvolvimento de soluções inovadoras. A cromatografia líquida multidimensional com acoplamento de colunas para injeção direta de fluidos biológicos tem ganhado atenção nos últimos anos. Ao mesmo tempo, o acoplamento entre cromatografia líquida e espectrometria de massas proporcionou marcante desenvolvimento científico na área biomédica e bioquímica. Esta tese apresenta os diversos estágios na redução da escala em sistemas de column switching utilizando colunas RAM, para a análise de fármacos em fluidos biológicos. Na escala convencional, com colunas de 4,6 mm de diâmetro interno, desenvolveu-se um sistema para a análise de fluoxetina em plasma. A metodologia desenvolvida foi adequadamente validada para aplicação na monitorização terapêutica, com tempo de análise de 20 minutos (incluído o preparo de amostras) e consumo de apenas 100 µL de amostra. Avaliou-se a escala microbore (2,1 mm), a qual apresentou excelente potencialidade para o acoplamento com a espectrometria de massas utilizando ionização por electrospray. Na primeira etapa em escala capilar, com colunas de 520 µm de diâmetro interno, desenvolveu-se um sistema para análise de fluoxetina em plasma. Esse sistema proporcionou análises em 25 minutos, também aplicáveis à monitorização terapêutica, consumindo poucos microlitros de amostra. Finalmente, foi desenvolvido um sistema de column switching capilar com colunas na ordem de 200 µm. Esse sistema foi acoplado à espectrometria de massas em tandem proporcionando, inovadoramente, análises altamente sensíveis e simultâneas, com baixo consumo de amostras. Um grupo de cinco antidepressivos e o albendazol, com seus produtos de biotransformação, tiveram suas análises validadas em menos de 8 minutos, consumindo menos de um microlitro de amostra. Esse sistema capilar contrasta com os sistemas convencionais comumente utilizados, os quais consomem entre centenas e milhares de vezes mais amostra para atingir a mesma detectabilidade. / Analysis of drugs and other related molecules in biofluids is essential in the pharmaceutical field. Nowadays, the development of innovative solutions in analytical chemistry has been pushed by the needs for speed and more complex analysis. Lately, multidimensional liquid chromatography using column switching for direct injection of biofluids has gained attention. At the same time, liquid chromatography hyphenated with mass spectrometry provided remarkable scientific development in biomedical and biochemical area. This thesis presents the scale reduction steps in RAM column switching, for drug analysis in biofluids. In the conventional scale, using 4.6 mm i.d. columns, a system was developed, providing fluoxetine analysis in plasma. The developed method resulted in a 20 min long run, including the sample preparation step, which consumed 100 µL of sample. The method was adequately validated, being applicable to therapeutic drug monitoring. The microbore scale (2.1 mm) was evaluated, presenting great potentiality for coupling with electrospray-mass spectrometry. In the first capillary scale step, using 520 µm columns, a system was developed for fluoxetine analysis. Fluoxetine analysis was achieved in 25 min, within the application range for therapeutic drug monitoring, and consuming few microliters of sample. Finally, a RAM capillary column switching system employing columns on the order of 200 µm was developed, in an innovative way. This system was coupled with a tandem mass spectrometer, rendering sensitive and simultaneous analysis with reduced sample volume. The analysis of one group containing five antidepressants, as well as the analysis of albendazol and its metabolites was validated. These analyses took only 8 minutes and consumed less than one microliter of sample. In contrast with conventional systems, this system consumes about hundreds or thousands times less sample, with the same detectability.