Le remodelage vasculaire est un processus pathologique responsable du développement de la maladie coronarienne, de la resténose intra-stent et de l'échec des greffes de pontage coronarien. Il se caractérise par un épaississement de la paroi des vaisseaux, dû à une prolifération excessive des cellules musculaires lisses vasculaires (CMVL) résidentes, induisant une réduction du flux sanguin dans les artères et conduits qui alimentent le cœur et augmentent le risque d'infarctus du myocarde. Ce phénotype anormal des CMVL est gouverné par la régulation réciproque des changements métaboliques (effet Warburg, synthèse accrue de lipides) et la reprogrammation épigénétique, mécanismes partagés avec les cellules cancéreuses. Dans la pathologie, les CMVL normalement quiescentes, acquièrent un phénotype synthétique caractérisé par une diminution de l'expression des marqueurs contractiles et par l'augmentation concomitante de l'expression de gènes impliqués, entre autres, dans la prolifération, la migration et la production de matrice extracellulaire, contribuant activement au remodelage vasculaire. L'enzyme nucléo-cytoplasmique ATP citrate lyase (ACLY) a récemment émergé comme un acteur majeur et une nouvelle cible thérapeutique favorisant l'effet Warburg, la synthèse de lipides et la reprogrammation épigénétique des cellules cancéreuses. ACLY génère de l'acétyl-CoA à partir du citrate dérivé des mitochondries, produit à partir du glucose et est considérée comme la source majeure d'acétyl-CoA pour la synthèse de lipides et l'acétylation globale des histones (favorisant l'expression des gènes). Son expression et son activation sont augmentées dans de nombreux cancers et associées avec un mauvais pronostic. Cependant, son implication dans le remodelage vasculaire coronarien est inconnue. Dans notre étude nous avons mis en évidence que la protéine ACLY est surexprimée et suractivée dans les CMVL d'artères coronariennes isolées de patients avec syndrome coronarien (SC) comparativement à des CMVL isolées de patients témoins. L'originalité de notre étude réside dans le fait qu'ACLY se retrouve au croisement des processus bioénergétiques et épigénétiques connus pour favoriser le profil pro-prolifératif des CMVL-SC. En effet, nous démontrons qu'en soutenant la production d'acétyl-CoA, ACLY participe au maintien de l'effet Warburg et de l'expression de gènes pro-prolifératifs via l'acétylation des histones. Dans les cellules cancéreuses, il a déjà été démontré qu'ACLY se localise à la fois dans le cytoplasme et le noyau pour réguler l'état métabolique cellulaire ainsi que l'acétylation des histones, affectant l'activité de nombreux facteurs de transcription. Ainsi, cibler l'ATP-citrate lyase en tant que régulateur critique de l'activité proliférative et métabolique des cellules peut être considéré comme un mécanisme essentiel de l'activité et de la viabilité cellulaire. Nous montrons que la réduction de l'expression d'ACLY affecte principalement un certain nombre de gènes impliqués dans la prolifération cellulaire des CMVL, dont l'expression est contrôlée par le facteur de transcription FOXM1, et est associée à une amélioration du métabolisme cellulaire et protège contre le remodelage vasculaire in vivo. Les effets de l'inhibition génétique et pharmacologique d'ACLY sur nos modèles précliniques (animaux et culture de tissu humain) suggèrent qu'ACLY représente une cible thérapeutique pour entraver l'état pro-prolifératif des CMVL contribuant au développement du remodelage vasculaire dans la maladie coronarienne et les pathologies associées (resténose intra-stent et échec des greffes coronariennes).

L’asthme allergique est caractérisé par une inflammation, un remodelage bronchique et une hyperréactivité bronchique (HRB). L’infiltration de fibrocytes, précurseurs des cellules musculaires lisses (CML) et exprimant le CD34, participe à l’hyperplasie du muscle lisse, cause potentielle de l’HRB. Cependant, l’expression du CD34 sur les CML ainsi que son rôle dans leur contraction et la réactivité du système respiratoire (SR) n’ont jamais été étudiés. L’objectif principal de ce projet était d’étudier le rôle du CD34 sur la contractilité des CML et la réactivité du SR dans l’asthme. Une perte de réactivité a été observée chez les souris Cd34-/- dans un modèle d’asthme. Celle-ci n’est pas reliée à une différence de la capacité contractile des CML en l’absence du CD34. Elle semble plutôt influencée par une altération des éléments non-contractiles tels que la production de mucines. Bref, cette étude a permis d’étudier l’importance de l’expression du CD34 dans le développement de l’HRB. / Allergic asthma is a chronic pulmonary disorder characterized by airway inflammation, airway remodeling and airway hyperresponsiveness (AHR). Hyperplasia of smooth muscle cells (SMCs) (potential mechanism of AHR) is influenced by CD34+ fibrocytes, which are known as smooth muscle precursors. However, CD34 expression on SMCs and its role on SMCs contractility have never been studied. The principal aim of this thesis was to study the role of CD34 on SMCs contractility and airway reactivity in the context of allergic asthma. In a mouse model of allergic asthma, a loss of airway reactivity was observed in sensitized Cd34-/- mice, which was not caused by alterations in the contractile capacity of SMCs. Instead, non-contractile elements (such as mucin production) seemed to be involved in this phenotype. Briefly, this study shows the importance of CD34 expression in the development of AHR associated with asthma.

Durant le développement et la progression d'un cancer, l'activation locale des protéines de la cascade de coagulation module la croissance et la migration des cellules tumorales et stromales (muscle lisse et endothélium vasculaire). L'objectif principal de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes de progression tumorale dépendants du facteur tissulaire (TF) et ce, à l'aide de lignées cellulaires tumorales qui surexpriment le TF et le TF tronqué de sa queue cytoplasmique (TFAC). Les tumeurs formées in vivo avec les cellules transfectées avec le TF ou le TFAC sont plus petites comparées au groupe témoin, alors que des sphéroïdes formés in vitro avec ces mêmes cellules sont plus gros. Aussi, les expériences réalisées avec les tumeurs formées in vivo et in vitro à partir de ces cellules ont montré que la surexpression du TF, avec ou sans sa queue cytoplasmique, permet la maturation des vaisseaux sanguins associés à la tumeur par le recrutement de cellules musculaires lisses (CML). Des essais de migration ont montré que l'activité protéolytique du TF stimule la migration des CML.

Les cellules musculaires lisses (CML) jouent un rôle primordial dans la bronchoconstriction, l'hyper-réactivité, l'inflammation et le remodelage structural bronchique associés à l'asthme. L'augmentation de la masse de muscle lisse et l'altération de sa fonction contractile par modulation phénotypique, tant in vivo qu'in vitro, sont des facteurs étudiés dans le cadre de cette thèse de doctorat. Une première étude démontre qu'un échantillon de 6 biopsies bronchiques présente une excellente qualité pour les études morphologiques et pour la culture cellulaire et que 76,5% des biopsies prélevées chez des sujets asthmatiques légers et normaux comportent des faisceaux de muscle lisse. Une seconde étude documente le phénotype pleinement différencié des CML in vivo sur des coupes de biopsies bronchiques par l'expression de vimentine, de desmine, d'a-smooth muscle-actine, de calponine, de smooth muscle-myosine et de smootheline. L'isolement et la culture de CML à partir d'un échantillon de 10-12 biopsies bronchiques a été tentée, soit par des cycles consécutifs de digestion enzymatique ou par explants tissulaires. Lorsque comparé aux CML in vivo, le phénotype des cellules bronchiques obtenues par l'une ou l'autre des méthodes d'isolement est très variable et ne nous permet pas d'affirmer hors de tout doute que les cellules isolées sont des CML. Les autres cellules structurales pouvant contaminer les cultures, la plasticité phénotypique des CML et la petitesse du matériel de départ rendent la tâche ardue. Finalement, une dernière étude réalisée à l'aide d'un modèle animal d'asthme allergique, décrit le remodelage structural et phénotypique du muscle lisse trachéal et bronchique. Une augmentation de la masse et de la prolifération du muscle lisse, une perte de l'expression de protéines contractiles (myosine totale, SM-B et myosin light chain kinase) et une diminution de la génération de force sont observées à court terme suivant une série de provocations allergéniques. Ces divers facteurs sont de retour au niveau des valeurs contrôles après une semaine, suggérant que ces changements sont transitoires. Par son implication dans le remodelage structural de la muqueuse bronchique et dans la bronchoconstriction chez les sujets asthmatiques, le muscle lisse est une structure d'une importance prépondérante dans la physiopathologie de l'asthme.

Les études des voies métaboliques de l'acide arachidonique ont permis de démontrer l'implication de plusieurs dérivés de ce lipide (leucotriènes et prostaglandines) dans certaines pathologies telles que l'asthme. Les époxy-éicosanoïdes (EET) ont été décrits comme ayant des effets anti-inflammatoires et broncho-relaxants importants et ils représentent une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Plusieurs groupes de recherches ont permis d'élucider les mécanismes d'action par lesquels les EET ont leurs effets bénéfiques. Cependant, les connaissances sur cette voie spécifique ne sont pas complètes puisqu'à ce jour, nous ne savons pas quels stimuli endogènes modulent la synthèse et la dégradation de ces lipides. En raison de leurs effets hyperpolarisants sur les cellules musculaires lisses, principalement par l'activation des courants K[indice supérieur +], les EET ont été proposés à titre de facteur hyperpolarisant dérivé de l'épithélium (EpDHF). Il a également été démontré que la synthèse d'autres EpDHF, tels que le NO et la PGI?, est induite par l'action de la Bradykinine. Notre hypothèse de recherche était donc que les effets de la Bradykinine au niveau des bronchioles humaines sont en partie causés par la synthèse endogène des époxy-éicosanoïdes. Le but du projet était, d'une part de démontrer la relation potentielle entre l'action de la BK et la synthèse des EET et, d'autre part de mettre au point un nouveau modèle d'hyperréactivité bronchique pour mieux caractériser les effets des EET. De façon spécifique, les objectifs étaient de : 1) comparer les effets relaxant de la BK à ceux du 14,15-EET sur des bronchioles humaines en présence ou non d'inhibiteurs spécifiques, 2) quantifier l'effet de la réduction de la biodisponibilité des EET sur les effets électrophysiologiques de la BK au niveau des cellules musculaires lisses et épithéliales, 3) caractériser l'effet d'un prétraitement à l'IL-1? ou à l'IL-13 sur la réactivité bronchique à différents agents pharmacologiques et 4) déterminer l'effet d'un prétraitement à la 15(R)-épi-Lipoxine A? sur l'hyperréactivité bronchique induite au TNF?. Les résultats obtenus nous indiquent que la BK et le 14,15-EET induisent le même cours et le même niveau de relaxation. De plus, l'utilisation d'inhibiteurs qui interagissent avec la biodisponibilité et les effets des EET réduisent significativement les effets relaxants et hyperpolarisants de la BK. Tous ces résultats nous indiquent qu'il existerait une relation entre l'action de la BK et la synthèse d'EET endogènes au niveau de bronchioles humaines. Les données que nous avons obtenues indiquent que l'IL-13, mais pas l'IL-1?, suite à un prétraitement de 48h induit un statut d'hyperréactivité bronchique à différents agents pharmacologiques. Nous avons démontré qu'un prétraitement à la Lipoxine A? permet d’abolir l'hyperréactivité bronchique induite par le TNF?. La modulation de la biodisponibilité des lipides anti-inflammatoires endogènes, tels que les EET ou la Lipoxine A?, s'avère une option potentielle dans le traitement de l'asthme. [symboles non conformes]

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’augmentation de la fréquence des pathologies vasculaires va créer ces prochaines années, des besoins importants en substituts vasculaires de petits calibres. L’idéal, à ce jour, reste l’utilisation de vaisseaux autologues réduisant les risques infectieux et immunologiques mais d’usage limité ce qui est à l’origine de l’ingénierie cellulaire. L’identification des progéniteurs vasculaires est d’un intérêt majeur dans ce domaine. Ces cellules d’origine autologues sont douées d’une grande capacité de prolifération et d’un potentiel de différenciation en cellules vasculaires (cellules endothéliales (CE) et cellules musculaires lisses (CML)) mais la difficulté réside dans le choix du recouvrement de la surface du support de culture qui favorise leur adhésion et prolifération Dans ce travail, nous avons choisi les films multicouches de polyélectrolytes et mesuré leur impact sur le comportement de ces cellules progénitrices en fonction de différentes conditions de culture (normoxie ou hypoxie). Nous avons montré dans un premier temps, que ces films multicouches de polyélectrolytes permettaient d’accélérer la différenciation de ces cellules en CE matures. Nous avons également montré que ces mêmes cellules cultivées en hypoxie étaient capables de se différencier en cellules contractiles stables dans le temps, présentant un phénotype comparable à celui des CML matures. L’association de ces résultats additionnés aux avantages apportés par des feuillets détachables est à la base de la construction d’un substitut vasculaire autologue de petit calibre, composé de CE et de CML issues d’un même pool de cellules, mais cultivées dans des conditions différentes. / The increase of vascular pathologies is going to create these next years, important needs in vascular substitutes of small calibres. The gold standard, this day, remains the use of autologous vessels reducing the infectious and immunological risks, but of limited custom, which is at the origin of tissue engineering. The identification of vascular progenitor cells is of major interest in vascular engineering. These autologous cells present a high capacity of proliferation and a potential of differentiation in vascular cells (endothelial cells (EC) and smooth muscle cells (SMC)) but the difficulty lies in the choice of the coated surface of culture which facilitates their adhesion and proliferation. In this work, we chose polyelectrolytes multilayer films and measured their impact on these vascular progenitor cells in various conditions of culture (normoxia or hypoxia). We showed at first, that these polyelectrolytes multilayer films allowed to accelerate the differentiation of these cells into matures EC. We also showed that these same cells cultivated under hypoxic conditions were able to differentiate into stable and contractile cells, presenting a phenotype comparable to the mature SMC. The association of these results added to the advantages brought by detachable sheet is the basis of the construction of an autologous small calibre vascular substitute consisting of EC and SMC differentiated from the same pool of cells, but cultivated in different conditions.

L'hypothèse que l'hypertension peut conférer un état d'hypercoagulabilité découle des principales complications liées à l'hypertension, l'infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Notre objectif était de déterminer si l'hypertension spontanée confère des changements dans les protéines de la coagulation et de la capacité de production de thrombine dans le sang et la paroi vasculaire. Nous avons utilisé le modèle de rats spontanément hypertendus (SHR) par rapport aux rats Wistar. La génération de thrombine est plus faible dans le plasma riche en plaquettes et plasma sans plaquettes de SHR par rapport à Wistar. Ceci est lié aux faibles concentrations en facteur tissulaire (TF) et en prothrombine, ainsi qu?un taux plus élevé de TFPI dans le plasma des SHR. En revanche, l'ajout d'anneaux d'aorte thoracique de SHR à un pool de plasma Wistar a donné lieu à une augmentation plus importante dans la génération de thrombine par rapport à l'ajout d'anneaux équivalent du Wistar. Alors qu'aucune différence n'a été observée pour les cellules endothéliales, la formation de thrombine était plus élevée à la surface de culture CML aortiques des SHR que des Wistar. L'exposition des phospholipides chargés négativement est plus élevée sur les anneaux et les CML des SHR que les Wistar. Les activités TF et TFPI étaient plus élevés chez les CML des SHR. Ces résultats montrent une opposition de génération de thrombine à la surface de la paroi artérielle et dans le plasma des rats SHR par rapport aux rats Wistar. Le phénotype thrombotique plus élevé de la paroi vasculaire SHR est dû à la capacité du CML à soutenir la génération de thrombine. Ces résultats suggèrent que le remodelage de la membrane phospholipidique et la synthèse de molécules pro-coagulantes induites par hypertension dans les CML sont des substrats pour une formation de thrombine accrue dans la paroi vasculaire / The hypothesis that hypertension may confer a hypercoagulable state arises from the main complications associated with hypertension, stroke and myocardial infarction. Our objective was to determine whether spontaneous hypertension confers changes in the coagulation proteins and the thrombin generating capacity in blood and the vascular wall. We used the model of spontaneously hypertensive rats (SHR) compared with Wistar rats. Thrombin generation was lower in platelet-rich plasma and platelet-free plasma from SHR compared to Wistar. This was related to lower tissue factor (TF) and prothrombin as well as higher TFPI levels in SHR plasma. In contrast, the addition of thoracic aorta rings of SHR to a Wistar plasma pool resulted in a higher increase in thrombin generation compared to the addition of equivalent rings from Wistar. Whereas no difference was observed for endothelial cells, thrombin formation was higher at the surface of cultured SHR aortic SMCs than from Wistar. Exposure of negatively-charged phospholipids was higher on SHR than on Wistar rings as well as on SMCs. TF and TFPI activities were higher in SHR SMCs. These results show opposite thrombin generating capacity of plasma and vessel walls in SHR compared to Wistar. The higher prothrombotic phenotype of the SHR vessel wall was due to the ability of SMCs to support thrombin generation. These findings suggest that the hypertension-induced membrane phospholipid reorganization and synthesis of procoagulant molecules in SMCs provide substrates for increased thrombin formation within the vessel wall

Une des propriétés majeures de la thrombine est le caractère pléiotropique de ses effets physiologiques et pathologiques à la fois dans le compartiment sanguin et tissulaire de la paroi. La voie de signalisation RhoA est activée par la fixation de la thrombine aux récepteurs PARs et cette voie est un régulateur principal de la mécanotransduction et de la plasticité cellulaire. Le facteur d’échange de RhoA, Arhgef1, est impliqué dans le développement de l’hypertension dépendante de l’angiotensine II et dans l’athérothrombose. Notre hypothèse est que le contrôle de la signalisation intracellulaire de RhoA par Arhgef1 est un élément régulateur de la coagulation plasmatique et pourrait participer aux modifications phénotypiques des plaquettes et des cellules vasculaires et ainsi contribuer à l’augmentation de la génération de thrombine tissulaire. Les objectifs ont été de caractériser la génération de thrombine et la fonction plaquettaire depuis leur activation jusqu’à leurs implications dans un modèle de thrombose tissulaire et d’étudier le rôle prothrombotique des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) chez des souris Arhgef1 -/-. Résultats : Les souris Arhgef1-/- ont une numération plaquettaire normale mais présentent une diminution significative de l’activation plaquettaire, de la génération de thrombine en sang total et en présence de plaquettes (mais pas en plasma pauvre en plaquettes) et de l’adhérence plaquettaire par rapport aux souris contrôles. Ces modifications se traduisent, in vivo, par un plus grand nombre d’arrêts transitoires de l’écoulement sanguin dans le modèle de saignement à la queue et un allongement du temps de survenue du thrombus occlusif carotidien en réponse au FeCl3 chez les souris Arhgef1 -/- comparées aux contrôles. Les CMLVs des souris Arhgef1 -/- génèrent moins de thrombine à leur surface et ont une prolifération diminuée par rapport aux CMLVs des souris contrôles. En conclusion, les résultats démontrent le rôle d’Arhgef1 dans les fonctions plaquettaires et dans la régulation du phénotype des CMLVs. Le mécanisme principal fait intervenir la Rho GTPase dans l’adhésion plaquettaire et la génération de thrombine à la surface CMLVs qui contrôlent la formation du thrombus. Ces résultats suggèrent que ce facteur d’échange est capable d’amplifier la thrombose artérielle et pourrait être impliqué via les récepteurs à la thrombine dans le couplage thrombine tissulaire-rigidité cellulaire via les plaquettes et les CMLVs dans les pathologies vasculaires. / One of the major properties of thrombin is the pleiotropic character of its physiological and pathological effects in both the blood and the tissue compartment of the vessel wall. The RhoA signaling pathway is activated by the binding of thrombin to the PARs receptors and this pathway is a major regulator of mechanotransduction and cellular plasticity. The RhoA exchange factor, Arhgef1, is involved in the development of angiotensin II-dependent hypertension and in atherothrombosis. Our hypothesis is that the control of intracellular RhoA signaling by Arhgef1 is a regulatory element of plasma coagulation and could participate in phenotypic modifications of platelets and vascular cells and thus contribute to the increase of tissue thrombin generation. The objectives were to characterize thrombin generation and platelet function from their activation to their implications in a model of tissue thrombosis, and to study the prothrombotic role of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in Arhgef1 -/- mice. Results: Arhgef1 -/- mice had a normal platelet count but showed a significant decrease in platelet activation, thrombin generation in whole blood and in the presence of platelets (but not in platelet poor plasma) and platelet adhesion compared to control mice. These modifications result, in vivo, by a greater number of transitory stopping of the blood flow in the tail bleeding model and an increase in the time of occurrence of the carotid occlusive thrombus in response to FeCl3 in Arhgef1 -/- mice compared to controls. The VSMCs of Arhgef1 -/- mice generate less thrombin at their surface and have decreased proliferation compared to VSMCs of the control mice. In conclusion, the results demonstrate the role of Arhgef1 in platelet function and in the regulating of the phenotype of VSMCs. The main mechanism involves Rho GTPase in platelet adhesion and in thrombin generation at the VSMC surface that control thrombus formation. These results suggest that this exchange factor is able to amplify aterial thrombosis and could be involved via thrombin receptors in tissue thrombin-cell stiffness coupling via platelets and VSMCs in vascular pathologies.