Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

Maspina, uma proteína supressora de tumor de 42 kDa, pertence à superfamília das serpinas (inibidores de serina protease), no entanto, seu mecanismo de ação independe da inibição de proteases. Maspina é expressa por epitélio de diferentes órgãos e apresenta regulação diferencial durante a progressão tumoral. Entre suas atividades biológicas, foram descritas a regulação da adesão celular, migração, morte, expressão gênica e resposta ao estresse oxidativo. A localização subcelular de maspina está relacionada a regulação de suas funções biológicas. Estudos clínicos recentes indicam que é a localização nuclear de maspina, ao invés de seus níveis de expressão, correlaciona-se com bons fatores prognósticos e sobrevida global em alguns tipos de câncer, incluindo câncer de mama. No entanto, pouco se sabe sobre como a localização subcelular de maspina é regulada. A maioria dos estudos sobre maspina é conduzido em linhagens de células tumorais, que apresentam uma grande variabilidade no contexto celular. Portanto, é importante usar uma linhagem celular não transformada para esta abordagem. Nesse trabalho investigamos fatores solúveis, interação célula-célula e interação célula-substrato como possíveis reguladores da localização de maspina na célula e as vias de sinalização envolvidas nesta regulação. Usando a linhagem celular epitelial mamária não transformada MCF10A como modelo, observamos por experimentos de imunofluorescência que o Fator de Crescimento Epidermal (EGF) promove a localização nuclear de maspina. EGF também altera a fosforilação da proteína conforme mostram nossos experimentos de 2D-SDS-PAGE e gel contendo Phostag. A fosforilação ocorre em resíduos de serina e a desfosforilação em resíduos de tirosina. À procura por vias de sinalização a jusante de do receptor de EGF envolvidas na regulação da localização subcelular de maspina, identificamos as vias de PI3K e Stat3 . Além disso, a adesão célula-célula parece bloquear a localização nuclear de maspina. Na tentativa de investigar funções celulares relacionadas à regulação de maspina por EGFR, identificamos proteínas que co-imunoprecipitam com maspina após o tratamento com EGF. O agrupamento funcional dessas proteínas sugere que a maspina pode estar envolvida em metabolismo de RNA, adesão celular e citoesqueleto. Desta forma, este trabalho identificou diferentes mecanismos que regulam a localização subcelular de maspina, que dependem da ativação das vias de PI3K e AKT pela via de EGFR. / Maspin, a 42 kDa tumor suppressor protein, belongs to the serpin (serine protease inhibitors) superfamily, however, its mechanism of action does not depend on protease inhibition. Maspin is expressed by epithelium of different organs and presents differential regulation during tumor progression. Among its biological activities, regulation of cell adhesion, migration, death, gene expression and oxidative stress response were described. Subcellular localization of maspin is related to the regulation of its biological functions. Recent clinical studies indicate that nuclear localization of maspin, not its expression levels, correlates with good prognostic factors and overall survival in some types of cancer, including breast cancer. However, little is known about how maspin subcellular localization is regulated. Most studies on maspin are conducted in tumor cell lines, which show great variability in cell context. Therefore, it is important to use a nontransformed cell line for this approach. Here we investigated soluble factors, cell-cell interaction and cell-substrate interaction as possible regulators of maspin subcellular localization and the signaling pathways involved. Using the MCF10A untransformed mammary epithelial cell line as a model system, we observed by immunofluorescence experiments that the Epidermal Growth Factor (EGF) promotes nuclear localization of maspin. EGF also alters the phosphorylation of the protein as observed by 2D-SDSPAGE and gel containing Phos-tag. Phosphorylation occurs on serine residues and dephosphorylation, on tyrosine residues. Looking for signaling pathways downstream of EGF receptor involved in regulation of maspin subcelular localization, we identified the PI3K and STAT3 pathways. On the other hand, cell-cell adhesion seems to block nuclear localization of maspin. In an attempt to investigate cellular functions related to regulation of maspin by EGFR, we identified proteins that co-immunoprecipitate with maspin in EGF-treated cells. The functional grouping of these proteins suggests that maspin may be involved with RNA metabolism, cell adhesion and cytoskeleton. Thus, this study identified different mechanisms that regulate subcellular localization of maspin, which depends on PI3K and STAT3 activation downstream of EGFR pathway.

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseDMNJ.pdf: 1396596 bytes, checksum: c40f8c60cc5a4bb8964cfe0ce5adc332 (MD5) Previous issue date: 2004-12-07 / Universidade Federal de Minas Gerais / Down syndrome (DS) is the most common congenital disease occurring in approximately 1 out of 700 live births. In addition to the full HC21 trisomy, rare individuals with clinically recognized DS have only a partial trisomy, carrying a region common to all patients dubbed as Down Syndrome Critical Region (DSCR). Several genes contained in this portion of the HC21 are probably related to the DS phenotypes. In an attempt to characterize some of the DSCR genes, heterologous expression and subcellular localization analyses were performed for the genes DCRB (DSCR4), c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 and c21orf101. Analyses of the recombinant proteins produced in Escherichia coli showed that most of them remained in the insoluble fraction. DCRB was expressed as a soluble protein in E. coli Rosetta (DE3), purified and subjected to assays for secondary structure analyses. Also, deletion and site directed mutagenesis as well as the production of polyclonal antisera against DCRB were performed. Subcellular localization analyses revealed that the proteins DCRB, c21orf45, c21orf59 and c21orf83-2 were distributed in the cytoplasm of mammalian cells and that c21orf95 and c21orf101 resided in the nucleus. Considering the lack of information concerning these proteins encoded in the DSCR our results allowed a insight into some of the proteins provably involved in Down syndrome. / A Síndrome de Down (SD) é o distúrbio genético mais freqüente em humanos, sendo detectado em média um caso a cada 700 nascimentos. Esta anomalia é decorrente principalmente da trissomia total do cromossomo 21 porém, em alguns casos, ocorre a trissomia parcial deste cromossomo o que possibilitou a definição de uma região comum a todos os portadores denominada Região Crítica da Síndrome de Down (DSCR). Nesta região encontram-se vários genes que possivelmente estão relacionados às características fenotípicas apresentadas pelos indivíduos portadores. Entre eles estão os genes estudados neste trabalho: DCRB ou DSCR4 e as ORFS c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 e c21orf101. Com o objetivo de contribuir para os estudos realizados com genes localizados na DSCR foram realizadas a expressão heteróloga em E. coli e a localização subcelular das proteínas codificadas pelos genes descritos acima. Assim, os experimentos de expressão heteróloga em E. coli demonstraram que as proteínas expressas encontram-se na forma insolúvel para a maioria das condições testadas, entretanto foi possível a expressão de uma pequena fração solúvel da c21orf45, c21orf59 e da DCRB quando utilizou-se células da linhagem Rosetta (DE3) o que permitiu que a última proteína fosse purificada em condições nativas e que ensaios iniciais de estrutura secundária fossem realizados. Experimentos de deleção e mutação sítio dirigida também foram realizados com esta proteína assim como a produção de anticorpos policlonais. Estudos da localização subcelular revelaram que quatro das proteínas analisadas (DCRB, c21orf45, c21orf59 e c21orf83-2) são citoplasmáticas enquanto que duas (c21orf95 e c21orf101) são nucleares. Considerando a escassez de informações a respeito dos genes localizados na DSCR, esses resultados vem contribuir para o conhecimento das proteínas possivelmente envolvidas com a Síndrome de Down.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPAP.pdf: 4902893 bytes, checksum: 7182a23d47adb7621d018819e69efbfe (MD5) Previous issue date: 2003-10-17 / Down Syndrome (DS) is the major cause of mental retardation with a high incidence among human beings. Main features in DS include facial and dermatological features, congenital heart defects as well as immunological, gastrointestinal and endocrine abnormalities. Among a variety of cancer, a 20 fold increased risk of developing leukemia in younger people and an increased risk of testicular cancer is noticeable in DS patients. Most DS patients carry a complete trisomy of chromosome 21, but patients carrying a partial trisomy have also been observed. Analyses of partial trisomy of chromosome 21 have helped determining the minimal regions potentially associated with DS features. The DSCR2 gene located in the so-called Down Syndrome Critical Region 2 (DCR-2) codes a 32.8-kDa leucine-rich protein comprised of 34% hydrophobic amino acid residues. Little is known about the DSCR2 protein characteristics but many assumptions have been made according to in silico predictions. In this work, we used immunocytochemical and fluorescence assays to investigate the subcellular location of the protein encoded by the DSCR2 gene in transfected cells. It was previously suggested that DSCR2 was located in the plasma membrane as an integral protein. Interestingly, we observed this protein in the endoplasmic reticulum of cells. We also studied whether the location of DSCR2 truncated forms had different subcellular distribution and our observations indicate that it is probably not inserted in inner membranes once the fragments lacking the predicted transmembrane helices remained in the ER. We suggest that DSCR2 is located in the cytoplasmic side of endoplasmic reticulum by indirect interaction with the ER membrane or with another protein. / A Síndrome de Down (SD) é a aneuploidia mais freqüente e a principal causa de retardo mental na população humana. Os portadores apresentam, além das características faciais e dermatológicas típicas, cardiopatias e anomalias imunológicas, gastrointestinais e endócrinas. Há também um risco de desenvolvimento de leucemia 20 vezes maior que o normal em crianças portadoras da síndrome. Embora essa anomalia seja principalmente resultante da trissomia do cromossomo 21, há casos em que apenas uma região deste aparece em triplicata. Esses casos permitiram mapear uma região crítica comum a todos os portadores da síndrome. O gene DSCR2, localizado na Região Crítica da Síndrome de Down 2 (DCR-2), codifica uma proteína de 32,8 kDa rica em leucina e composta de uma alta porcentagem de resíduos hidrofóbicos. Experimentalmente, pouco se sabe sobre as características desta proteína, mas muitas possibilidades foram levantadas baseadas em sua seqüência de aminoácidos. Neste trabalho, foi estudada a localização subcelular da proteína DSCR2 em células de mamíferos. Estudos anteriores propuseram que a DSCR2 atuaria como uma proteína integral da membrana plasmática. Entretanto, em experimentos com células de mamíferos, nós observamos a proteína DSCR2 no retículo endoplasmático das células. Formas truncadas, construídas com o intuito de entender esta distribuição celular da DSCR2, apresentaram o mesmo padrão de fluorescência da proteína íntegra. Este resultado nos levou a concluir que esta proteína não está inserida na membrana do retículo endoplasmático, uma vez que a ausência dos domínios transmembranas preditos não alterou a sua distribuição subcelular. Desta forma, nós sugerimos que a DSCR2 se localiza associada ao retículo endoplasmático não como uma proteína integral de membrana, mas por algum tipo de interação indireta com a membrana ou com outras proteínas.

Orientador: Marcelo Menossi Teixeira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T15:42:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vicentini_Renato_D.pdf: 5901500 bytes, checksum: 7c8fe505e4c1675900f96c6643895d32 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As células de plantas são altamente organizadas e muitos processos biológicos estão associados com estruturas subcelulares específicas. A localização subcelular é uma característica chave das proteínas, visto que está relacionada com a função biológica. A determinação da localização subcelular usando a predição é uma estratégia altamente desejável, principalmente porque as abordagens experimentais demandam um tempo considerável. Com o objetivo de desenvolver um método para melhorar a predição de localização subcelular, diversos algoritmos foram integrados visando à exploração ótima do potencial de cada um. O desempenho com 90% de exatidão deste novo método foi claramente superior a todos os métodos utilizados em sua criação. Usando esta estratégia foi realizada a primeira análise em larga escala da localização subcelular do proteoma de cana-de-açúcar (com 11.882 proteínas preditas), sendo encontrado que a maioria das proteínas estão localizadas em quatro compartimentos: núcleo (44%), citoplasma (19%), mitocôndria (12%), e extracelular (11%). Adicionalmente foi observado que cerca de 19% das proteínas são localizadas em múltiplos compartimentos. Outros resultados foram capazes de identificar um conjunto de proteínas de cana-de-açúcar que podem apresentar duplo direcionamento pelo uso de variações na extremidade amino. Utilizando expressão transiente em células da epiderme de cebola, foi investigada a localização subcelular de 96 proteínas de cana com fusão a proteína GFP. As construções contendo fusão amino- e carboxi-terminal dos genes foram expressas, e a localização das proteínas de fusão foi detectada por microscopia de fluorescência. É relatado também a caracterização do gene ScBAK1, um receptor do tipo quinase com repetições ricas em leucina, que apresenta similaridade de seqüência com o gene brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. Foi mostrado que transcritos desse gene se acumulam em níveis muito mais altos nas células da bainha do feixe vascular do que nas células do mesófilo, e que a fusão ScBAK1-GFP é localizada na membrana plasmática. Essa distribuição espacial e esse padrão de expressão indicam que a ScBAK1 pode estar potencialmente envolvida em cascatas de sinalização celular intermediadas por altos níveis de açúcar na folha. Ainda considerando estudos de localização subcelular, é conhecido que seqüências de nucleotídeos que flanqueiam o códon de início da tradução afetam a eficiência traducional dos mRNA, e podem indicar a presença de sítios de inicio de tradução (TIS) alternativos. O multi-direcionamento pode ser um reflexo da variabilidade traducional destas outras formas da proteína. Neste estudo foi desenvolvido um método computacional para investigar o uso de TISs alternativos na síntese de novas variantes protéicas que podem apresentar localização subcelular diferente. Visando contribuir para o nosso entendimento da complexidade do genoma da cana-de-açúcar, foi empregada uma análise em larga escala dos TIS nesta espécie. Também é demonstrado que os transcritos com expressão induzida apresentam um forte TIS quando comparados com os reprimidos, e que os transcritos constitutivos possuem uma alta freqüência de TIS alternativos. O mesmo ocorre para os genes com altas taxas evolutivas, e transcritos específicos de folhas e entrenós, levantando a hipótese de que esses genes possam codificar diferentes polipeptídeos / Abstract: Plant cells are highly organized and many biological processes are associated with specialized subcellular structures. Subcellular localization is a key feature of proteins, since it is related to biological function. The determination of subcellular localization using computational prediction is a highly desirable strategy because experimental approaches are time-consuming. In order to develop a method for the enhanced prediction of subcellular localization, the outputs of some prediction tools were integrated so as to optimally exploit the potential of each one. The prediction performance (with 90%of accuracy) of this new method was clearly superior to all the methods used to create the predictor. Using this method, the first in silico genome-wide subcellular localization analysis was performed for sugarcane (with 11,882 predicted proteins). It was found that most of the proteins are localized to four compartments: nucleus (44%), cytosol (19%), mitochondria (12%), and secretory destination (11%). It is also shown that about 19%of the proteins are localized to multiple compartments, and that a potential set of sugarcane proteins can show dual targeting by use of N-truncated form of proteins. The subcellular localization of 96 sugarcane proteins fused with GFP were evaluated using transient expression in onion epidermal cells. Constructs containing the Nand C-terminal fusion of genes encoding both endogen and GFP proteins were transiently expressed, and the localization of the fusion proteins were detected by fluorescent microscopy. It was reported the characterization of ScBAK1, a sugarcane leucine-rich repeat receptor-like kinase, with sequence similarity to brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. We have found that ScBAK1 transcripts accumulated at higher levels in bundle-sheath than in mesophyll cells. ScBAK1-GFP fusions were localized to the plasma membrane. This spatial distribution and expression pattern indicates that ScBAK1 might be potentially involved in cellular signaling cascades mediated by high levels of sugar in this organ. The nucleotide sequence flanking the translation initiation codon affects the translational efficiency of eukaryotic mRNAs, and may indicate the presence of an alternative translation initiation site (TIS) to produce proteins with different properties. Multi-targeting may reflect the translational variability of these other protein forms. In this study it was also developed a computational method to investigate the usage of alternative TISs for the synthesis of new protein variants that might have different subcellular localization. To contribute to our understanding of the genome complexity of sugarcane, we undertook a genome wide TIS analysis in sugarcane data. It is demonstrated that up-regulated transcripts show a stronger TIS when compared with the down-regulated, and that ubiquitous transcripts have a high frequency of alternative TIS in the next downstream AUG codon. The same occurs for fast-evolving genes, and leaf and internodes specific transcripts, that may encode different polypeptides by N-terminal polymorphism / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeMoraes_VanessaCristineSousa_D.pdf: 4935241 bytes, checksum: ce8c385da6e3872d30f08426c629d34d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O alargamento do aqueduto vestibular (EVA) é uma malformação da orelha interna que pode ser identificado por tomografia computadorizada ou ressonância magnética. O EVA é um dos principais sinais clínicos da Síndrome de Pendred (PDS), uma doença genética com padrão de herança autossômico recessivo causada na maioria dos casos por mutações no gene SLC26A4. Além de EVA, o bócio e defeito na organificação do iodeto na tireóide são achados clínicos típicos da PDS. Por sua vez, mutações no gene SLC26A4 têm também sido observadas em indivíduos com surdez não sindrômica associada ao EVA. Recentemente os genes FOXI1 e KCNJ10 também foram implicados na PDS. O gene FOXI1 é um fator de transcrição do gene SLC26A4. Medições electrofisiológicas mostraram que a alteração da pendrina, proteína codificada pelo gene SLC26A4, em modelos animais levava indivíduos à surdez pela falta do potencial endococlear devido à perda de expressão de canais potássio. Sendo atribuído ao gene KCNJ10 a função de manutenção do potencial endococlear. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de mutações nos genes SLC26A4, FOXI1 e KCNJ10 em 60 indivíduos brasileiros portadores de perda auditiva sensorioneural, associada ou não a alterações no aqueduto vestibular. Foram encontradas 14 diferentes alterações no gene SLC26A4, das quais 3 ainda não haviam sido descritas na literatura (P142L, G149R e C282Y) e 4 já haviam sido descritas, porém ainda não haviam sido caracterizadas funcionalmente (T193I, Q413R, L445W e R776C). Dessa forma, foi realizada a análise funcional e a co-localização celular da proteína Pendrina com estas 7 variações alélicas. Não foi encontrada nenhuma evidência de contribuição digênica relacionada ao gene FOXI1 e/ou KCNJ10, uma vez que nenhum paciente desta casuística com alteração no gene SLC26A4 apresentou mutações nesses genes. Além disso, no grupo composto por 30 indivíduos surdos que não apresentam EVA, ficou evidente que o rastreamento do gene SLC26A4 não foi suficiente para explicar a perda auditiva nesses pacientes, uma vez que foram encontradas apenas alterações em um alelo do gene. Por outro lado, no grupo formado por 30 indivíduos surdos que apresentam EVA, o rastreamento do gene SLC26A4 possibilitou o esclarecimento do diagnóstico etiológico da perda auditiva em 5 pacientes que apresentaram mutações nos dois alelos do gene SLC26A4 / Abstract: Enlargement of the vestibular aqueduct (EVA) is a malformation of the inner ear that can be identified by computed tomography or magnetic resonance imaging. EVA is the main feature of Pendred syndrome (PDS), a genetic disease with autosomal recessive inheritance pattern, in most cases caused by mutations in the SLC26A4 gene. Besides EVA, goiter and defective organification of iodide in the thyroid are other typical clinical signs of PDS. In turn, SLC26A4 gene mutations have been also observed in patients with non-syndromic deafness associated with EVA. Recently the genes FOXI1 and KCNJ10 were also implicated in the PDS. The FOXI1 gene is a transcription factor of SLC26A4 gene. Electrophysiological measurements in animal models showed that the mutated pendrin, the protein encoded by the SLC26A4 gene, led individuals to deafness by the lack of endocochlear potential due to loss of expression of potassium channels. Being assigned to the KCNJ10 gene the maintenance of endocochlear potential. Thus, the present study aimed to evaluate the occurrence of mutations in SLC26A4, and KCNJ10 FOXI1 genes in 60 Brazilian patients with sensorineural hearing loss, with or without changes in the vestibular aqueduct. We found 14 different mutations in SLC26A4 gene, of which 3 had not yet been described in the literature (P142L, G149R and C282Y) and 4 had already been described, but had not been characterized functionally yet (T193I, Q413R, L445W and R776C). Thus, we performed the functional analysis and cellular co-localization of Pendrin protein with these 7 allelic variants. We found no evidence of digenic contribution related to FOXI1 and/or KCNJ10 genes, since no patient in with mutations in SLC26A4 gene showed mutations in these genes. In addition, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with no EVA was not sufficient to explain the hearing loss in these patients, since mutations were found only in one allele of the gene. On the other hand, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with EVA allowed the elucidation of the etiology of hearing loss in 5 patients with mutations in both alleles of this gene / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

Os estudos em reprodução e desenvolvimento das plantas, especialmente voltados ao pistilo, são de grande interesse agronômico, econômico e científico. Em nosso laboratório, recentemente, foi identificado e caracterizado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), um inibidor do ciclo celular que atua de forma tecido específica no pistilo de Nicotiana tabacum L. e Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). Foi identificada a proteína NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase 2) como parceira de interação de NtSCI1 (N . tabacum SCI1), em um ensaio de pull-down (STRINI, 2014). A literatura aponta que os inibidores de ciclo celular regulam o ciclo através da inibição de CDK, o que sugere que NtSCI1 possa regular o ciclo celular através da inibição de NtCDKG;2. O presente estudo mostra análises detalhadas da localização de GFP-NtCDKG;2 em células epiteliais de N. benthamiana. Verificou-se que a proteína NtCDKG;2 está presente no nucleoplasma e também co-localiza em speckles nucleares. Em cultura de células BY2 expressando GFP-NtCDKG;2 de forma estável, foi observado que, durante a metáfase e anáfase, a proteína NtCDKG;2 está junto ao fuso acromático. Adicionalmente, ensaios de BiFC (Bi-molecular Fluorescence Complementation) realizados neste trabalho mostram que a interação entre as proteínas NtCDKG;2 e NtSCI1 ocorre em uma região localizada na periferia nucleolar, durante a interfase. Também foram identificadas possíveis isoformas de NtCDKG;2. A possibilidade da ocorrência de isoformas sugere que, de maneira análoga à sua homóloga em humanos, as isoformas resultantes de NtCDKG;2 possam atuar em diferentes processos. Em busca de parceiros de interação de NtCDKG;2, para identificar em que vias esta proteína atua, foi realizado um screening de uma biblioteca de cDNAs de estigmas e estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido em leveduras (Y2H). Através desse ensaio, foram identificados diversos parceiros envolvidos com transcrição e processamento de RNA. Dentre as proteínas identificadas, cuja interação foi confirmada neste trabalho, destaca-se a proteína NtCDKF;1, uma proteína que fosforila o CTD da RNA Polimerase II e, dessa forma, auxilia a transcrição e o splicing cotranscricional (HAJHEIDARI et al., 2012). O presente trabalho mostra também a interação entre NtCDKG;2 e a proteína NtCBP1, uma proteína que possui um papel importante na regulação inicial da transcrição de proteínas mediadoras do crescimento do tubo polínico (LI et al., 2015). xx Adicionalmente, o screening de Y2H possibilitou a identificação da interação entre NtCDKG;2 e NtRanBP1, uma proteína chave na formação do fuso acromático que, em humanos, interage com uma isoforma homóloga a NtCDKG;2, a CDK11p46 (MIKOLAJCZYK et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011). Análises in silico realizadas com a sequência de aminoácidos de NtCDKG;2 apontaram motivos de interação com proteína do tipo F-Box, ciclina, CDK, fosfatase, 14-3-3, BRCA1 e indicaram o local provável de interação do complexo CDK-Ciclina com o respectivo inibidor. Foi testada e comprovada a interação entre NtCDKG;2 e a 14-3-3D, por Y2H, uma parceira de NtSCI1. Outra lacuna que precisava ser preenchida é referente à regulação da expressão de NtSCI1. Com este intuito, foram realizadas análises in silico para identificar elementos cis-regulatórios na sequência genômica de NtSCI1. Essas análises indicaram a presença de importantes elementos cis-regulatórios relacionados à identidade meristemática (como WUSCHEL e AINTEGUMENTA), identidade do carpelo (AGAMOUS, BELL) e progressão do ciclo celular (E2F e CDC5). Algumas considerações podem ser feitas associando os resultados obtidos a estudos feitos paralelamente em nosso laboratório: 1) Compilando a localização de NtCDKG;2 em splicing speckles e sua interação com os diferentes parceiros de interação relacionados à transcrição e splicing, sugere-se que NtCDKG;2 também atue nos processos transcricionais e de splicing. 2) Considerando a localização subcelular de NtCDKG;2 durante as diferentes fases do ciclo celular, às análises in silico dessa proteína que identificaram sua possível interação com BRCA1, além da interação confirmada com a proteína NtRanBP1, é possível sugerir que NtCDKG;2 atue, direta ou indiretamente, na organização do fuso acromático de plantas. 3) Propõem-se que NtSCI1 regule a proliferação celular no pistilo através da interação com NtCDKG;2 que se dá no nucléolo das células. Dessa forma, NtSCI1 prenderia NtCDKG;2 no nucléolo e inibiria sua atuação, como na organização do fuso acromático, o que acarretaria inibição da divisão celular. 4) Devido aos motivos cis-regulatórios encontrados na sequência genômica de NtSCI1 e o efeito que a proteína possui desde as fases iniciais do desenvolvimento do pistilo, sugere-se que a expressão desse gene seja regulada por elementos diretamente envolvidos no controle do término do meristema floral e nas vias de desenvolvimento de órgãos florais. / Studies on plant reproduction and development, specifically those related to the pistil, are of great agronomic, economic and scientific interest. In our laboratory, we recently identified and characterized SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), an inhibitor of the cell cycle which acts tissuespecifically in the pistil of Nicotiana tabacum L. and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). The NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase G; 2) protein was identified as an interaction partner of NtSCI1 (N. tabacum SCI1) in a pulldown assay (STRINI, 2014). The literature suggests that cell cycle inhibitors control the cycle through the inhibition of CDKs, indicating that NtSCI1 might control cell cycle by inhibiting NtCDKG;2. This study shows detailed analysis of GFP-NtCDKG;2 localization in leaf cells of N. benthamiana. The analysis shows that NtCDKG;2 is present in the nucleoplasm and also co-localizes with nuclear speckles. In BY2 cell culture stably expressing GFP-NtCDKG;2, it was observed that NtCDKG;2 is at the achromatic spindle during metaphase and anaphase. Additionally, BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) assays performed in this study have shown that the interaction of NtCDKG;2 and NtSCI1 occurs in the nucleolar periphery during interphase. Putative isoforms of NtCDKG;2 were also identified. The possible occurrence of these isoforms suggests that, in a similar way to its human homologue, NtCDKG;2 putative isoforms could act in different processes. To identify in which processes this protein could act, a search for NtCDKG;2 interaction partners was performed through the screening of a N. tabacum stigma and style cDNA library in the yeast two-hybrid (Y2H) system. Several partners identified through this assay have roles in RNA transcription and processing. Among the identified partners with interaction confirmed during this work, stands out the NtCDKF;1 protein, a CDK that phosphorylates the RNA polymerase II CTD, and thus, supports transcription and co-transcriptional splicing (HAJHEIDARI et al., 2012). This study also shows the interaction of NtCDKG;2 with NtCBP1, a protein which has an important role in the transcriptional regulation of genes encoding proteins mediating pollen tube growth (LI et al., 2015). Furthermore, the Y2H screening allowed the identification of the interaction of NtCDKG;2 with NtRanBP1, a key protein in the formation of the achromatic spindle which, in humans, interacts with the CDK11p46 isoform (MIKOLAJCZYK xxii et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011), a homologue of NtCDKG;2. In silico analysis of the amino acid sequence of NtCDKG;2 revealed motifs of predicted interaction with F-box proteins, cyclins, CDKs, phosphatases, 14-3-3s, BRCA1, and also pointed the region where the CDK-cyclin complex might interact with its respective inhibitor. The interaction of NtCDKG;2 with 14-3-3D, a known partner of NtSCI1, was tested and confirmed by Y2H. Another gap that needed to be filled is related to the regulation of NtSCI1 expression. To address this issue, in silico analysis to identify cis-regulatory elements was performed in NtSCI1 genomic region. These analyses revealed the presence of important cis-regulatory elements related to meristem identity (such as WUSCHEL and AINTEGUMENTA), carpel identity (AGAMOUS, BELL), and cell cycle progression (E2F and CDC5). Taken together results from this study and parallel studies performed in our laboratory, a few remarks can be made: 1) Taken the localization of NtCDKG;2 in splicing speckles, and its interaction with different proteins involved in transcription and splicing, it is suggested that NtCDKG;2 also has roles on these processes; 2) Considering the subcellular localization of NtCDKG;2 during the different cell cycle phases, the in silico analysis of this protein that predicts its interaction with BRCA1, and the confirmed interaction with NtRanBP1 protein, it is possible to suggest that NtCDKG;2 has a direct or indirect role in the organization of the achromatic spindle in plants; 3) It is proposed that NtSCI1 regulates cell proliferation in the pistil through its interaction with NtCDKG;2, which occurs in the nucleolus. Thus, NtSCI1 could hold NtCDKG;2 in the nucleolus, inhibiting its actions, such as in the organization of the achromatic spindle, resulting in cell division arrest. 4) Due to the cis-regulatory elements found in the genomic sequence of NtSCI1, and the effect of this protein since the initial stages of pistil development, it is suggested that its expression is regulated by elements directly involved in the control of the floral meristem termination and pathways of floral organ development.