O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada pela deposição de imunocomplexos nos tecidos. O clareamento de imunocomplexos está comprometido no LES, contribuindo para a patogênese da nefrite lúpica. Os receptores Fcg (FcgR) participam do clareamento dos imunocomplexos contendo IgG, pois se ligam à porção Fc desta molécula. O FcgRIIa é um receptor que tem dois alelos co-dominantemente expressos, o R131 e o H131, os quais diferem na sua eficiência em se ligar a subclasses de IgG. Células que expressam o homozigoto FcgRIIa-H/H131 são as únicas que se ligam eficientemente a imunocomplexos contendo IgG2, enquanto as que expressam FcgRIIa-R/R131 o fazem de forma menos eficaz. Este polimorfismo tem sido descrito como fator de risco para nefrite lúpica, embora ainda haja controvérsias. O propósito do nosso estudo foi o de analisar, em uma população de nefrite lúpica e em outra de glomerulopatias primárias, a associação entre o genótipo FcgRIIa-R/R131 e a gravidade da doença renal na sua instalação (definida pelo momento da biópsia renal) e ao final do seguimento, bem como possíveis relações com aspectos histológicos renais. A genotipagem do receptor FcgRIIa foi realizada em 76 pacientes com nefrite lúpica e 63 com glomerulopatias primárias através da extração do DNA genômico, seguido de reação de polimerização em cadeia (PCR) e nested PCR, utilizando-se primers específicos. Os pacientes foram avaliados por parâmetros clínicos e laboratoriais. Setenta e um pacientes com nefrite lúpica realizaram biópsia renal, enquanto 5 que já se encontravam em hemodiálise não a realizaram. Pacientes com glomerulonefrite membranoproliferativa, nefropatia da IgA e glomerulonefrite proliferativa mesangial foram agrupados como glomerulopatias proliferativas enquanto os com glomeruloesclerose segmentar e focal, glomerulopatia de lesões mínimas ou glomerulonefrite membranosa foram agrupados como glomerulopatias não proliferativas. O homozigoto FcgRIIa-R/R131 foi mais prevalente no grupo com nefrite lúpica (42,1% de R/R131 e 14,5% de H/H131) em relação ao grupo com glomerulopatias primárias (23,8% de R/R131 e 23,8% de H/H131), dado este estatisticamente significativo (p<0.05). Houve segregação do genótipo FcgRIIa- R/R131 nos pacientes com nefrite lúpica quando comparados aos com glomerulopatias não proliferativas, mas não quando comparados aos com glomerulopatias proliferativas (p<0.05). Não houve diferença na distribuição genotípica do receptor FcgRIIa em relação a classe histológica de nefrite lúpica, tampouco em relação aos que evoluíram ou não para insuficiência renal (Pcr = 1,4mg/dl ao final do seguimento). Um aumento na frequência do genótipo FcgRIIa- R/R131 foi encontrado nos pacientes com nefrite lúpica apresentando níveis mais elevados de FAN (FAN>1/100) e consumo de complemento C3 (p<0,05), mas não naqueles com presença de anticorpos anti-dsDNA ou anti-fosfolípide (p>0,05). Estes achados sugerem que uma distribuição anormal dos genótipos do receptor FcgRIIa com predomínio do homozigoto R/R131 é um fator importante que pode influenciar o desenvolvimento de nefrite lúpica e de glomerulopatias proliferativas. O genótipo FcgRIIa-R/R131 também está relacionado com maior atividade lúpica (FAN>1/100 e consumo de C3) em pacientes brasileiros. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by tissue deposition of immune complexes. Immune complex clearance is impaired in SLE, contributing to the pathogenesis of lupus nephritis. Fcg receptors (FcgR) participate in the clearance of the immune complexes containing immunoglobulin G, because they bind the Fc domain of this molecule. The FcgRIIa receptor has two co dominant alleles, R131 and H131. They differ in their efficiency to bind IgG subclasses. Cells expressing the homozygote FcgRIIa-H/H131 are the only ones, which bind efficiently immune complexes containing IgG2, whereas those expressing FcgRIIa-R/R131 do not. This polymorphism has been described as a risk factor for lupus nephritis. However, reports are still controversial. This study aims to establish the role of FcgRIIa polymorphism in the severity and prognosis of lupus nephritis compared to primary glomerulopathies, and whether it is related to histological findings or not. In 76 patients with lupus nephritis and 63 patients with primary glomerulopathies, genotyping of the FcgRIIa receptor was performed with standard PCR, followed by nested PCR using specific primers. The same patients were assessed according to clinical and laboratory patterns. Seventy-one patients with lupus nephritis underwent biopsy, while five did not since they were already under dialysis. Patients diagnosed as membranoproliferative glomerulonephritis, IgA glomerulonephritis and mesangial proliferative glomerulonephritis were grouped as proliferative glomerulopathies, while those with focal segmental glomerulosclerosis, membranous glomerulonephritis and minimal change disease were grouped as nonproliferative glomerulopathies. The homozygous FcgRIIa-R/R131 was more prevalent in lupus nephritis (42,1% being R/R131 and 14,5% H/H131) than in glomerulopathies (23,8% being R/R131 and 23,8% H/H131). These data were statistically significant (p<0.05). A segregation of the FcgRIIa-R/R131 genotype was found in patients with lupus nephritis compared to nonproliferative glomerulopathies, but not when compared to proliferative glomerulopathies (p<0.05). No relation was found between genotype distribution and histological class or renal insufficiency (end-study serum creatinine = 1.4 mg/dl). The genotype R/R131 was more prevalent in lupus nephritis patients presenting complement 3 (C3) consumption and higher antinuclear factor (ANF) titers, but not in those with antidouble- stranded DNA or antiphospholipid antibodies (p>0.05). We concluded that a skewed distribution of the FcgRIIa genotypes with R/R131 predominance may contribute to the development of lupus nephritis and proliferative glomerulopathy. In Brazilian patients, this polymorphism is also related to more intense lupus activity (ANF > 1/100 and C3 consumption).

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INTRODUÇÃO: A nefrite lúpica é uma complicação frequente e de alta morbimortalidade do lúpus eritematoso sistêmico (LES). A evolução para insuficiência renal crônica terminal varia entre 8 e 15% dos casos, após um período de 5 anos. A fase inicial da nefrite se deve a uma atividade imunológica exacerbada que leva a sequelas renais, como a fibrose intersticial, sinéquias glomerulares, e glomeruloesclerose. Uma vez instalada, vários fatores aceleram a velocidade de progressão da insuficiência renal, como a presença de proteinúria residual, hipertensão arterial sistêmica e a etnia do paciente. Estudos recentes mostraram que a presença de polimorfismos do MYH9 são altamente prevalentes em pacientes com GESF (glomeruloesclerose focal e segmentar), nefropatia do HIV e em pacientes com doença renal crônica não diabética. Os polimorfismos do MYH9 mais relacionados com essas doenças são os do haplótipo E1, causados pelos polimorfismos rs4821480, rs2032487, rs4821481 e rs3752462, presentes principalmente na população negra e de hispano-americanos. No Brasil não há estudos sobre a prevalência desse gene. MÉTODOS: Nosso estudo analisou retrospectivamente 196 pacientes com nefrite lúpica, acompanhadas no ambulatório de glomerulopatias do Hospital das Clínicas da USP. Foram recuperados os dados clínicos e laboratoriais dos pacientes de janeiro de 1999 a dezembro de 2010. Foi feita análise dos polimorfismos do haplótipo E1 do gene do MYH9 (rs4821480, rs2032487, rs4821481 e rs3752462) e correlacionados com suas características clínicas e laboratoriais, apresentando como desfecho a duplicação da creatinina ou a evolução para doença renal crônica terminal. RESULTADOS: O tempo de seguimento médio dos pacientes foi de 6,1 anos, com a creatinina inicial média de 1,6 g/dL e proteinúria média de 3,9 g/dia. Dezenove pacientes não recuperaram função renal, mantendo-se em diálise. Dos 177 pacientes restantes 43 (24%) apresentaram o desfecho de duplicação (DC) da creatinina, ou necessidade de diálise (DRCT). Pacientes progressores eram tinham maior SLEDAI renal (10 vs 8,9 p=0,04), maior índice de cronicidade renal à biópsia (5 vs 2, p<0,001) e maior frequência de reativações da doença renal (flare renal) (82,9% x 53,8%, p=0,002), assim menores índices de remissão completa ou parcial (p<0,0001). Os 4 polimorfismos se segregam em conjunto, ou seja, como um haplótipo, pelo modelo de Hardy-Weinberg. Analisando separadamente cada polimorfismo, apenas o rs3752462, apresenta associação com o desfecho DC/DRCT, na análise por genótipo (CC/CT/TT, p=0,03) e quando feita análise TT/CT vs CC (p=0,02). Não houve relação dos polimorfismos com a etnia negra ou parda. Pacientes com haplótipo E1 eram progressores em 28% dos casos, conferindo um OR de 1,79 (IC 1,02 a 3,0) de DC/DRC. DISCUSSÃO: A presença do haplótipo E1 têm alta prevalência em pacientes portadores de nefrite lúpica no Brasil, sendo fator de risco para progressão da doença renal crônica / BACKGROUND: Lupus nephritis (LN) is a frequent complication with high morbidity and mortality of systemic lupus erythematosus (SLE). Chronic renal failure is observed in 8 to 15% of the patients after 5 years of follow up. LN is an inflammatory disease after a systemic autoimmune activation. Once inflammation is shutdown several renal and nonrenal factors, such as residual proteinuria, hypertension and ethnicity of the patient, may emerge and impose to the kidney a chronic phenotype (interstitial fibrosis, glomerular adhesions and glomerulosclerosis. Recently E1 haplotype (rs4821480, rs2032487, rs4821481 and rs3752462 polymorphisms) of the MYH9 gene was associated to progressive kidney diseases in patients with FSGS (focal segmental glomerulosclerosis), HIV nephropathy and non-diabetic chronic kidney disease, in african american and spanic american patients. In Brazil there is no data on this subject. METHODS: Retrospective analysis of 196 patients with LN followed in our outpatient glomerular disease ward were enrolled glomerulopathies. Patients clinical data from January 1999 to December 2010 were retrieved and MYH9 rs4821480, rs2032487, rs4821481 and rs3752462 polymorphisms were genotyped. Outcome was defined as doubling of serum creatinine, or end stage renal disease (ESRD). RESULTS: The mean follow-up of patients was 6.1 years, with an initial mean creatinine of 1.6 g/dL and mean proteinuria 3.9 g/day. On enrollment nineteen patients were on dialysis and did not recover renal function, they were withdraw from analyses of progressive kidney disease. On follow up, from 177 remaining patients, 43 (24%) showed the composite outcome: dialysis, or doubling creatinine. Progressors had higher renal SLEDAI (10 vs 8.9, p = 0.04), higher chronicity index at biopsy (5 vs 2, p <0.001) and more frequently renal flares (82, 9% vs. 53.8%, p=0.002), as well as lower rates of complete or partial remission (p <0.0001). The four polymorphisms segregate as a haplotype, according the Hardy-Weinberg model. Analysing each polymorphism, only TT/CT genotype from rs3752462 polymorphism was associated with the outcome of DC/ESRD (p = 0.02). E1 haplotype were associated with progression with an OR of 1.79 (CI 1.02 to 3.0). DISCUSSION: The presence of the E1 haplotype is associated with worse prognosis of chronic renal failure in lupus nephritis patients

INTRODUÇÃO: A nefrite lúpica é uma complicação frequente e de alta morbimortalidade do lúpus eritematoso sistêmico (LES). A evolução para insuficiência renal crônica terminal varia entre 8 e 15% dos casos, após um período de 5 anos. A fase inicial da nefrite se deve a uma atividade imunológica exacerbada que leva a sequelas renais, como a fibrose intersticial, sinéquias glomerulares, e glomeruloesclerose. Uma vez instalada, vários fatores aceleram a velocidade de progressão da insuficiência renal, como a presença de proteinúria residual, hipertensão arterial sistêmica e a etnia do paciente. Estudos recentes mostraram que a presença de polimorfismos do MYH9 são altamente prevalentes em pacientes com GESF (glomeruloesclerose focal e segmentar), nefropatia do HIV e em pacientes com doença renal crônica não diabética. Os polimorfismos do MYH9 mais relacionados com essas doenças são os do haplótipo E1, causados pelos polimorfismos rs4821480, rs2032487, rs4821481 e rs3752462, presentes principalmente na população negra e de hispano-americanos. No Brasil não há estudos sobre a prevalência desse gene. MÉTODOS: Nosso estudo analisou retrospectivamente 196 pacientes com nefrite lúpica, acompanhadas no ambulatório de glomerulopatias do Hospital das Clínicas da USP. Foram recuperados os dados clínicos e laboratoriais dos pacientes de janeiro de 1999 a dezembro de 2010. Foi feita análise dos polimorfismos do haplótipo E1 do gene do MYH9 (rs4821480, rs2032487, rs4821481 e rs3752462) e correlacionados com suas características clínicas e laboratoriais, apresentando como desfecho a duplicação da creatinina ou a evolução para doença renal crônica terminal. RESULTADOS: O tempo de seguimento médio dos pacientes foi de 6,1 anos, com a creatinina inicial média de 1,6 g/dL e proteinúria média de 3,9 g/dia. Dezenove pacientes não recuperaram função renal, mantendo-se em diálise. Dos 177 pacientes restantes 43 (24%) apresentaram o desfecho de duplicação (DC) da creatinina, ou necessidade de diálise (DRCT). Pacientes progressores eram tinham maior SLEDAI renal (10 vs 8,9 p=0,04), maior índice de cronicidade renal à biópsia (5 vs 2, p<0,001) e maior frequência de reativações da doença renal (flare renal) (82,9% x 53,8%, p=0,002), assim menores índices de remissão completa ou parcial (p<0,0001). Os 4 polimorfismos se segregam em conjunto, ou seja, como um haplótipo, pelo modelo de Hardy-Weinberg. Analisando separadamente cada polimorfismo, apenas o rs3752462, apresenta associação com o desfecho DC/DRCT, na análise por genótipo (CC/CT/TT, p=0,03) e quando feita análise TT/CT vs CC (p=0,02). Não houve relação dos polimorfismos com a etnia negra ou parda. Pacientes com haplótipo E1 eram progressores em 28% dos casos, conferindo um OR de 1,79 (IC 1,02 a 3,0) de DC/DRC. DISCUSSÃO: A presença do haplótipo E1 têm alta prevalência em pacientes portadores de nefrite lúpica no Brasil, sendo fator de risco para progressão da doença renal crônica / BACKGROUND: Lupus nephritis (LN) is a frequent complication with high morbidity and mortality of systemic lupus erythematosus (SLE). Chronic renal failure is observed in 8 to 15% of the patients after 5 years of follow up. LN is an inflammatory disease after a systemic autoimmune activation. Once inflammation is shutdown several renal and nonrenal factors, such as residual proteinuria, hypertension and ethnicity of the patient, may emerge and impose to the kidney a chronic phenotype (interstitial fibrosis, glomerular adhesions and glomerulosclerosis. Recently E1 haplotype (rs4821480, rs2032487, rs4821481 and rs3752462 polymorphisms) of the MYH9 gene was associated to progressive kidney diseases in patients with FSGS (focal segmental glomerulosclerosis), HIV nephropathy and non-diabetic chronic kidney disease, in african american and spanic american patients. In Brazil there is no data on this subject. METHODS: Retrospective analysis of 196 patients with LN followed in our outpatient glomerular disease ward were enrolled glomerulopathies. Patients clinical data from January 1999 to December 2010 were retrieved and MYH9 rs4821480, rs2032487, rs4821481 and rs3752462 polymorphisms were genotyped. Outcome was defined as doubling of serum creatinine, or end stage renal disease (ESRD). RESULTS: The mean follow-up of patients was 6.1 years, with an initial mean creatinine of 1.6 g/dL and mean proteinuria 3.9 g/day. On enrollment nineteen patients were on dialysis and did not recover renal function, they were withdraw from analyses of progressive kidney disease. On follow up, from 177 remaining patients, 43 (24%) showed the composite outcome: dialysis, or doubling creatinine. Progressors had higher renal SLEDAI (10 vs 8.9, p = 0.04), higher chronicity index at biopsy (5 vs 2, p <0.001) and more frequently renal flares (82, 9% vs. 53.8%, p=0.002), as well as lower rates of complete or partial remission (p <0.0001). The four polymorphisms segregate as a haplotype, according the Hardy-Weinberg model. Analysing each polymorphism, only TT/CT genotype from rs3752462 polymorphism was associated with the outcome of DC/ESRD (p = 0.02). E1 haplotype were associated with progression with an OR of 1.79 (CI 1.02 to 3.0). DISCUSSION: The presence of the E1 haplotype is associated with worse prognosis of chronic renal failure in lupus nephritis patients

Les exosomes apoptotiques (ApoExo) sont des vésicules extracellulaires (EVs) dérivées de lésions vasculaires et libérées par des cellules endothéliales (ECs) apoptotiques dont la taille, les protéines, le profil en ARN et l'activité enzymatique sont différents de ceux des corps apoptotiques classiques. Notre groupe a montré que les ApoExos accéléreraient le rejet vasculaire en association avec les anti-LG3 circulants, des auto-anticorps (auto-Ac) dirigés contre le LG3, le fragment 5' du perlécan. Nous avons également démontré le rôle de biomarqueur et le rôle effecteur des anti-LG3 dans les lésions vasculaires rénales, à la fois dans les reins natifs et transplantés. La néphrite lupique (NL) est une manifestation fréquente et grave du lupus érythémateux disséminé (LED). Il n'existe pas de biomarqueurs du dysfonctionnement rénal progressif dans la NL. Nous émettons l'hypothèse que les ApoExos stimulent des cellules B spécifiques qui existent dans le répertoire immunitaire normal et que les conditions pro-inflammatoires prévalant chez les patients atteints de LED, telles que l'activation accrue des récepteurs Toll-like (TLRs), amplifient cette réponse, conduisant à la production d'anti-LG3, un auto-Ac important dans l'établissement de la NL. Des cellules B productrices d’anti-LG3 ont été trouvées dans la cavité péritonéale de souris saines et ont produit des anti-LG3 suite à une stimulation in vitro avec des agonistes des TLR1/2, TLR4, TLR7 et TLR9. Il est intéressant de noter que ces cellules sont absentes de la cavité péritonéale de souris saines ayant reçu une injection d'ApoExos. En explorant l'importance fonctionnelle des TLRs dans le déclenchement d'une réponse auto-immune dans un modèle murin lupique, nous montrons que les agonistes de TLRs connus pour contribuer à la pathogenèse du LED (TLR2, 4, 7 et 9) déclenchent une production significativement plus élevée d'IgM anti-LG3, alors que la stimulation des TLRs qui ne sont pas associés à la pathogenèse du LED (TLR3 et 5) ne le fait pas. L’injection d'ApoExo a également déclenché l'axe auto-immun IL-23/IL-17 (mesuré par ELISA et essai cytokinique), augmenté les cellules B de centres germinatifs spléniques (mesuré par cytométrie de flux), augmenté les taux circulants d’IgG totaux, d’anti-LG3 et d’auto-Ac classiques du LED (mesuré par micropuce et ELISA) par rapport à l’injection de véhicule. Des niveaux élevés d'IgG anti-LG3 circulants sont observés chez les souris prédisposées au LED par rapport aux souris saines (mesurés par ELISA), ainsi qu'une proportion accrue de cellules B1 spléniques et de cavité péritonéale (mesurés par cytométrie de flux) augmentant avec l’établissement de la maladie. Ces observations suggèrent un rôle spécifique des ApoExos dans la modulation de la production d'auto-Ac qui, à son tour, déclenche l'involution microvasculaire importante dans les maladies auto-immunes et le rejet de greffe. Ces observations suggèrent également que les cellules B spécifiques de LG3 peuvent être modulées dans des conditions pro-inflammatoires telles que celles qui prévalent chez les patients atteints de LED, conduisant à la production d'auto-Ac. Une meilleure compréhension de l'impact de ces mécanismes permettra d'améliorer l'identification, la prédiction et la prise en charge de la NL. / Apoptotic exosomes (ApoExo) are vascular injury derived extracellular vesicles (EVs) released by apoptotic endothelial cells (ECs) with distinct size, protein, RNA profile and enzymatic activity from classical apoptotic bodies. Our group showed that ApoExo accelerated vascular rejection in association with circulating anti-LG3, autoantibodies (autoAb) against LG3, the 5’ fragment of the perlecan. We have also unravelled biomarkers and effector roles of anti-LG3 in kidney vascular damage in both native and transplanted kidneys. Lupus Nephritis (LN) is a common and serious manifestation of systemic lupus erythematosus (SLE). Biomarkers of progressive renal dysfunction in LN, are lacking. We hypothesize that ApoExo stimulate specific B cells that exist in the normal immune repertoire and that the pro-inflammatory conditions prevalent in SLE patients, such as increased Toll-like Receptors (TLRs) activation, amplify this response, leading to anti-LG3 production, autoAb of importance in LN development. B cells producing anti-LG3 were found in the peritoneal cavity of healthy mice and produced anti-LG3 AutoAb when stimulated in vitro with TLR 1/2, 4, 7 and 9 agonists. Interestingly, these cells disappeared from the peritoneal cavity of healthy mice infused with ApoExo. ApoExo infusion also triggered circulating IL-23/IL-17 autoimmune axis (measured by cytokines assay), increased splenic germinal centre B cells (measured by flow cytometry), increased total circulating IgG, anti-LG3 and classical autoAb (measured by microarray and ELISA) compared to vehicle infusion. Elevated circulating anti-LG3 IgG levels are found in SLE prone mice compared to healthy ones (measured by ELISA) as well as an increased proportion of splenic and peritoneal cavity B1 cells (measured by flow cytometry). Exploring the functional importance of TLRs in triggering such a response, we show that while TLR agonists known to contribute to SLE pathogenesis (TLR2, 4, 7 and 9) triggered significantly higher IgM anti-LG3 production, stimulation of TLR that are not associated with SLE pathogenesis (TLR3 and 5) did not. These observations suggest a specific role for ApoExo in modulating the production of autoAb which, in turn, trigger microvascular involution of importance in autoimmune diseases and transplant rejection. These observations also suggest that LG3-specific B cells may be modulated under pro-inflammatory conditions such as those prevalent in lupus patients, leading to production of autoAb. A better understanding of the impact of these mechanisms will lead to improved identification, prediction, and management of LN.

INTRODUÇÃO: Perda óssea é um achado comum em pacientes com Nefrite Lúpica (NL), mesmo naqueles com diagnóstico recente. Algumas evidências indicam um aumento na osteoclastogênese como um dos distúrbios principais no processo de remodelamento ósseo. O objetivo deste estudo foi investigar algumas vias de sinalização (RANKL/OPG, Wnt/Beta-catenin and Th17/IL-17) possivelmente envolvidas na osteoclastogênese anormal detectada em mulheres jovens ao diagnóstico de nefrite lúpica ativa, assim como avaliar a ação da vitamina D (VitD) nesse cenário e sua correlação com fatores inflamatórios. MÉTODOS: Realizamos culturas com a linhagem de células osteoblásticas humanas hFOB 1.19 (ATCC) e as dividimos em um grupo suplementado com soro de pacientes lúpicas (NL) (n=15) e em um grupo com soro de controles saudáveis (CS) (n=15) em vez de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, adicionamos 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) em dois subgrupos nas concentrações 10-9M e 10-7M, resultando em 6 grupos: CS, CS+vitD 10-9M, CS+vitD 10-7M, NL, NL+vitD 10-9M, NL+vitD 10-7M). Após 48h da adição de 1,25(OH)2D3 ao meio de cultura, células hFOB foram tripsinizadas e separado o lisato celular de cada grupo. Ensaios de citometria de fluxo e multiplex foram realizados para quantificação das seguintes proteínas do lisato cellular: CD166, CD54, fosfatase alcalina, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, Beta-catenina, IL-1-beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22. RT-PCR foi empregado para quantificação de mRNA dos genes RANKL, SOST, OPG e Beta-catenina. RESULTADOS: Pacientes com NL evidenciaram maiores níveis séricos de DKK-1 (2802,04 ± 1380,06 x 696,30 ± 421,22pg/ml, p < 0,001), OPG (560,12 ± 333,56 x 340,24 ± 102,08pg/ml, p=0,0212), TNF-alfa (9,63 ± 14,49 x 1,27 ± 0,35pg/ml, p=0,0337), IL-6 (15,58±39,08 x 8,02±3,49, p= 0,0053) and IL-2 (3,36 ± 3,06 x 1,54 ± 0,9pg/ml, p=0,0353) do que CS. Após exposição ao meio enriquecido com soro de pacientes com NL, células hFOB 1.19 apresentaram maior nível de mRNA de RANKL (p=0,045)) e menor nível de proteína OPG (178,81 ± 66,40 x 298,76 ± 114,94pg/mg, p=0,0016). Suplementação com 1,25(OH)2D3 aumentou a diferença da expressão das proteínas DKK-1 (673,03 ± 171,93 x 456,69 ± 234,53pg/mg, p=0,0215), IL-6 (0,80 ± 0,25pg/mg x 0,66 ± 0,18, p=0,0417) and IL-2 (4,97 ± 2,2 x 3,90 ± 1,66pg/mg, p=0,042) entre hFOB NL comparados com hFOB CS, enquanto diminuiu o nível de mRNA de Beta-catenina em células do grupo NL. DISCUSSÃO: Dentro das limitações deste estudo, os resultados sugerem que os maiores níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa, IL-6 e talvez IL-2, detectadas em pacientes com NL pode ter induzido a maior expressão osteoblástica de RANKL, representada pelo maior nível de mRNA RANKL em células do grupo NL, e suprimido OPG, conforme a diminuição observada na quantificação proteica de OPG nos lisatos celulares, o que pode ter contribuído para a aumentada osteoclastogênese evidenciada pela biópsia óssea dessas pacientes. A adição de 1,25(OH)2D3 não preveniu os efeitos inflamatórios do soro de pacientes com NL ativa em células hFOB 1.19 neste estudo / INTRODUCTION: Bone loss is a common finding in Lupus Nephritis (LN) patients even in those recently diagnosed. Some evidences indicate an increased osteoclastogenesis as the main disturb of the bone remodeling process. The aim of this study was to investigate some pathways (RANK-L/OPG, Wnt/?-catenin and Th17/IL-17) possibly involved in the abnormal osteoclastogenesis detected in women at the diagnosis of proliferative LN as well as evaluating the action of vitamin D (vitD) in this scenario and their correlation with inflammatory factors. METHODS: We cultured the human osteoblastic cell line hFOB 1.19 (ATCC), and divided cultures into those supplemented with serum from healthy controls (HC) (n=15) and LN patients (n=15) instead of fetal bovine serum (FBS). Then 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3] was added in two subgroups at the concentrations of 10-9M e 10-7M while vitD was absent in one subgroup in both HC and LN cultures (HC, HC+vitD 10-9M, HC+vitD 10-7M, LN, LN+vitD 10-9M, LN+vitD 10-7M) . After 48h of vitD addition, hFOB cultures were trypsinized. Flow cytometry and multiplex assays were performed to test CD166, CD54, alkaline phosphatase, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, ?-catenin, IL-1Beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22 concentrations in the cell lysates. Polymerase reaction chain (RT-PCR) assays analyzed the expression of RANKL, SOST, OPG and Beta-catenin mRNA. RESULTS: LN patients showed higher serum levels of DKK-1 (2802.04 ± 1380.06 x 696.3 ± 421.22pg/ml, p < 0.001), OPG (560.12 ± 333.56 x 340.24 ± 102.08pg/ml, p=0.0212), TNF-alfa (9.63 ± 14.49 x 1.27 ± 0.35pg/ml, p=0.0337), IL-6 (15.58±39.08 x 8.02±3.49, 0.0053) and IL-2 (3.36 ± 3.06 x 1.54 ± 0.9pg/ml, p=0.0353) than HCs. After exposure to medium enriched with LN serum, osteoblasts expressed higher RANKL mRNA (fold change 1.573, p=0.045) and lower OPG protein (178.81 ± 66.40 x 298.76 ± 114.94pg/mg, p=0.0016). 1,25(OH)2D3 supplementation increased the difference between LN and HC expression of DKK-1 (673.03 ± 171.93 x 456.69 ± 234.53pg/mg, p=0.0215), IL-6 (0.80 ± 0.25pg/mg x 0.66 ± 0.18, p=0.0417) and IL-2 (4.97 ± 2.2 x 3.90 ± 1,66pg/mg, p=0.042) proteins and diminished Beta-catenin mRNA in LN cells. DISCUSSION: Within the limitations of this study, the results suggest that the higher serum levels of proinflammatory cytokines, such as TNF-alfa, IL-6 and perhaps IL-2, detected in LN patients would possibly have induced RANKL genes, as demonstrated by an enhanced RANKL mRNA expression in LN osteoblasts, and suppressed OPG protein in cell lysates, which would have contributed to the increased osteoclastogenesis detected in bone biopsies of women with new onset of LN. 1,25(OH)2D3 addition to osteoblast cultures did not prevent the effects of inflammatory LN serum in vitro

INTRODUÇÃO: Perda óssea é um achado comum em pacientes com Nefrite Lúpica (NL), mesmo naqueles com diagnóstico recente. Algumas evidências indicam um aumento na osteoclastogênese como um dos distúrbios principais no processo de remodelamento ósseo. O objetivo deste estudo foi investigar algumas vias de sinalização (RANKL/OPG, Wnt/Beta-catenin and Th17/IL-17) possivelmente envolvidas na osteoclastogênese anormal detectada em mulheres jovens ao diagnóstico de nefrite lúpica ativa, assim como avaliar a ação da vitamina D (VitD) nesse cenário e sua correlação com fatores inflamatórios. MÉTODOS: Realizamos culturas com a linhagem de células osteoblásticas humanas hFOB 1.19 (ATCC) e as dividimos em um grupo suplementado com soro de pacientes lúpicas (NL) (n=15) e em um grupo com soro de controles saudáveis (CS) (n=15) em vez de soro fetal bovino (SFB). Em seguida, adicionamos 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) em dois subgrupos nas concentrações 10-9M e 10-7M, resultando em 6 grupos: CS, CS+vitD 10-9M, CS+vitD 10-7M, NL, NL+vitD 10-9M, NL+vitD 10-7M). Após 48h da adição de 1,25(OH)2D3 ao meio de cultura, células hFOB foram tripsinizadas e separado o lisato celular de cada grupo. Ensaios de citometria de fluxo e multiplex foram realizados para quantificação das seguintes proteínas do lisato cellular: CD166, CD54, fosfatase alcalina, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, Beta-catenina, IL-1-beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22. RT-PCR foi empregado para quantificação de mRNA dos genes RANKL, SOST, OPG e Beta-catenina. RESULTADOS: Pacientes com NL evidenciaram maiores níveis séricos de DKK-1 (2802,04 ± 1380,06 x 696,30 ± 421,22pg/ml, p < 0,001), OPG (560,12 ± 333,56 x 340,24 ± 102,08pg/ml, p=0,0212), TNF-alfa (9,63 ± 14,49 x 1,27 ± 0,35pg/ml, p=0,0337), IL-6 (15,58±39,08 x 8,02±3,49, p= 0,0053) and IL-2 (3,36 ± 3,06 x 1,54 ± 0,9pg/ml, p=0,0353) do que CS. Após exposição ao meio enriquecido com soro de pacientes com NL, células hFOB 1.19 apresentaram maior nível de mRNA de RANKL (p=0,045)) e menor nível de proteína OPG (178,81 ± 66,40 x 298,76 ± 114,94pg/mg, p=0,0016). Suplementação com 1,25(OH)2D3 aumentou a diferença da expressão das proteínas DKK-1 (673,03 ± 171,93 x 456,69 ± 234,53pg/mg, p=0,0215), IL-6 (0,80 ± 0,25pg/mg x 0,66 ± 0,18, p=0,0417) and IL-2 (4,97 ± 2,2 x 3,90 ± 1,66pg/mg, p=0,042) entre hFOB NL comparados com hFOB CS, enquanto diminuiu o nível de mRNA de Beta-catenina em células do grupo NL. DISCUSSÃO: Dentro das limitações deste estudo, os resultados sugerem que os maiores níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa, IL-6 e talvez IL-2, detectadas em pacientes com NL pode ter induzido a maior expressão osteoblástica de RANKL, representada pelo maior nível de mRNA RANKL em células do grupo NL, e suprimido OPG, conforme a diminuição observada na quantificação proteica de OPG nos lisatos celulares, o que pode ter contribuído para a aumentada osteoclastogênese evidenciada pela biópsia óssea dessas pacientes. A adição de 1,25(OH)2D3 não preveniu os efeitos inflamatórios do soro de pacientes com NL ativa em células hFOB 1.19 neste estudo / INTRODUCTION: Bone loss is a common finding in Lupus Nephritis (LN) patients even in those recently diagnosed. Some evidences indicate an increased osteoclastogenesis as the main disturb of the bone remodeling process. The aim of this study was to investigate some pathways (RANK-L/OPG, Wnt/?-catenin and Th17/IL-17) possibly involved in the abnormal osteoclastogenesis detected in women at the diagnosis of proliferative LN as well as evaluating the action of vitamin D (vitD) in this scenario and their correlation with inflammatory factors. METHODS: We cultured the human osteoblastic cell line hFOB 1.19 (ATCC), and divided cultures into those supplemented with serum from healthy controls (HC) (n=15) and LN patients (n=15) instead of fetal bovine serum (FBS). Then 1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3] was added in two subgroups at the concentrations of 10-9M e 10-7M while vitD was absent in one subgroup in both HC and LN cultures (HC, HC+vitD 10-9M, HC+vitD 10-7M, LN, LN+vitD 10-9M, LN+vitD 10-7M) . After 48h of vitD addition, hFOB cultures were trypsinized. Flow cytometry and multiplex assays were performed to test CD166, CD54, alkaline phosphatase, RANKL, OPG, CD14, TLR4, NF-KappaB, SOST, DKK-1, ?-catenin, IL-1Beta, IL-2, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22 concentrations in the cell lysates. Polymerase reaction chain (RT-PCR) assays analyzed the expression of RANKL, SOST, OPG and Beta-catenin mRNA. RESULTS: LN patients showed higher serum levels of DKK-1 (2802.04 ± 1380.06 x 696.3 ± 421.22pg/ml, p < 0.001), OPG (560.12 ± 333.56 x 340.24 ± 102.08pg/ml, p=0.0212), TNF-alfa (9.63 ± 14.49 x 1.27 ± 0.35pg/ml, p=0.0337), IL-6 (15.58±39.08 x 8.02±3.49, 0.0053) and IL-2 (3.36 ± 3.06 x 1.54 ± 0.9pg/ml, p=0.0353) than HCs. After exposure to medium enriched with LN serum, osteoblasts expressed higher RANKL mRNA (fold change 1.573, p=0.045) and lower OPG protein (178.81 ± 66.40 x 298.76 ± 114.94pg/mg, p=0.0016). 1,25(OH)2D3 supplementation increased the difference between LN and HC expression of DKK-1 (673.03 ± 171.93 x 456.69 ± 234.53pg/mg, p=0.0215), IL-6 (0.80 ± 0.25pg/mg x 0.66 ± 0.18, p=0.0417) and IL-2 (4.97 ± 2.2 x 3.90 ± 1,66pg/mg, p=0.042) proteins and diminished Beta-catenin mRNA in LN cells. DISCUSSION: Within the limitations of this study, the results suggest that the higher serum levels of proinflammatory cytokines, such as TNF-alfa, IL-6 and perhaps IL-2, detected in LN patients would possibly have induced RANKL genes, as demonstrated by an enhanced RANKL mRNA expression in LN osteoblasts, and suppressed OPG protein in cell lysates, which would have contributed to the increased osteoclastogenesis detected in bone biopsies of women with new onset of LN. 1,25(OH)2D3 addition to osteoblast cultures did not prevent the effects of inflammatory LN serum in vitro