Thesis Erasmus University Rotterdam. / Auteursnaam op omslag: Bert van der Horst. ook verschenen in gedrukte versie. With bibliogr., with a summary in Dutch.

Thesis Erasmus University Rotterdam. / ook verschenen in gedrukte versie. With bibliogr., with a summary in Dutch.

Thesis (doctoral)--Utrecht, 1983.

ClC-6 und ClC-7 sind Chlorid/Proton Austauscher des späten endozytischen Wegs und lokalisieren entsprechend auf späten Endosomen und Lysosomen. Während die Relevanz von ClC-6 in der humanen Physiologie lange unerkannt war, hat ClC-7 seit lange eine etablierte Rolle als Gen, das, wenn mutiert, zu Neurodegeneration und verschiedenen Arten von Osteopetrose in Menschen führt, eine Pathologie, die von dicken und fragilen Knochen gekennzeichnet wird. Hier berichten wir über eine neue ClC-6Y553C de novo Mutation, die vor Kurzem in 3 unabhängigen Patienten entdeckt wurde, die unter einer früh-entstehenden neurodegenerativen Pathologie litten, die mit generellen Entwicklungsverzögerung, MRI Gehirn-Anomalien, Hypotonie und mangelhaftem Atem verbunden war. Mit-ClC-6Y553C-transfizierten Zellen zeigten ungewӧhnlich erhöhten Strömungen und Unempfindlichkeit an pH, was eine dramatische “gain-of-function” in dem nativen säuren Umfeld von späten Endosomen, wo ClC-6 exprimiert wird, darstellt. Zusätzlich erforschten wir die Relevanz von ClC-7 in der lysosomalen Funktion, um die molekulare Mechanismen besser zu verstehen, die hinter des lysosomalen Speicher und Osteopetrose steht, die in Menschen beobachtet werden, die von ClC-7 Mutationen betroffen sind. Zusammenfassend liefern wir Einblicke in den Konsequenzen von ClC-6 und ClC-7 Mutationen für Zelluläre Homöostase und unterstützen eine wichtige Rolle von ClC-6 und ClC-7 in endolysosomaler Funktion und, wenn mutiert, in humaner neurodegenerativen Pathologie. / ClC-6 and ClC-7 are chloride/proton exchangers of the late endocytic pathway and reside on late endosomes and lysosomes, respectively. While relevance in human physiology for ClC-6 has been long unknown, ClC-7 has an established role as a gene, that, if mutated, causes neurodegeneration and different types of osteopetrosis in humans, a sickness characterized by thick and fragile bones. Here we report a new ClC-6Y553C de novo mutation, recently reported in 3 unrelated patients, affected by an early-onset neurodegenerative disease leading to general developmental delay, MRI brain abnormalities, hypotonia and respiratory insufficiency. Transfected cells revealed abnormally enlarged currents and insensitivity to pH in the Y553C ClC-6 mutant, representing a dramatic gain of function in the native acidic environment of late endosomes, where ClC-6 is expressed. Additionally, we investigated the importance of ClC-7 in lysosomal function to better understand the molecular mechanisms behind the lysosomal storage and osteopetrosis observed in human patients affected by ClC-7 mutations. Collectively, we provide insight into the consequences of ClC-6 and ClC-7 mutations for cellular homeostasis and support a crucial role for both ClC-6 and ClC-7 in endolysosomal function and, if mutated, in human neurodegenerative disease.

Programmierter Zelltod (PCD) oder Apoptose ist ein universeller biologischer Prozess, der in multizellulären Organismen essentiell ist für die Differenzierung und Homöostase von Geweben. Bei der Entwicklung eines funktionsfähigen zellulären Immunsystems können autoreaktive Zellen entstehen. Die negative Selektion von unreifen, autoreaktiven B-Zellen erfolgt durch IgM-vermittelte Apoptose und ist von de novo Transkription abhängig. Die genauen Mechanismen der IgM-vermittelten Apoptose und die involvierten Genprodukte sind nur unzureichend charakterisiert. Zur Identifikation Apoptose-assoziierter Gene in B-Zellen wurden die Differential Display-Analyse durchgeführt und die Expressionsmuster apoptotischer und nicht-apoptotischer BL60-Zellen untersucht. Es wurden 38 differentielle Fragmente identifiziert und kloniert. Sequenzanalysen ergaben Homologien eines Fragments mit LAPTM5, einem lysosomal-assoziierten Transmembran-Protein mit vorwiegender Expression in hämatopoetischem Gewebe. Northern Blot-Analysen zeigten 2 Stunden nach Inkubation von BL-60-Zellen mit anti-IgM einen Anstieg der Genexpression von LAPTM5. Das LAPTM5-Gen liegt auf Chromosom 1 (1p34), ist evolutionär konserviert und besitzt keine Homologien zu bekannten Genen. Die Untersuchung der gewebespezifischen Expression von LAPTM5 ergab neben der hohen Expressionsrate in hämatopoetischem Gewebe eine sehr starke Expression in Skelett- und Herzmuskelgewebe. Elektronenmikroskopisch zeigte sich eine Lokalisation des Proteins in späten Endosomen und Lysosomen. Daneben konnte LAPTM5 auch auf der Oberfläche von BL60-Zellen detektiert werden. Während des apoptotischen Prozesses bleibt die Menge an LAPTM5 auf der Zelloberfläche konstant. Zur weiteren Charakterisierung von LAPTM5 und anderen Kandidaten-Genen wurde ein episomales Expressions- und Selektionssystem entwickelt. Cotransfektionsanalysen unter Verwendung eines GFP (green fluorescent protein)- Konstrukts zeigten, dass die aufgereinigten Zellen zu 80% das interessierende Gen exprimieren und die Expression länger als vier Wochen anhält. / Programmed cell death (PCD) or apoptosis is a key feature of normal development and tissue homeostasis. In the development of a functional immunesystem the occurence of autoreactive cells is tightly controlled and prevented by apoptosis. The negative selection of autoreactive immature B cells after encountering self antigen occures via surface IgM (sIgM) mediated apoptosis and depends on de novo gene transcription. The precise mechanism of this process and the possible involvement of different genes in the regulation of sIgM-mediated cell death is not understood so far. In order to identify genes associated with B cell apoptosis Differential Display RT-PCR (DD) was performed to analyze sIgM-mediated apoptosis in the human Burkitt lymphoma line BL60. The expression patterns of apoptotic and non-apoptotic cells were investigated and 38 differentially expressed gene fragments were found. Subsequent northern blot analysis showed that LAPTM5, a lysosomal associated membrane protein preferential ly expressed in adult hematopoietic tissue, is up-regulated 2 hours after induction of apoptosis. LAPTM5 is a protein with five transmembrane domains, it is conserved during evolution and the gene, mapping to chromosome 1p34, has no homology to known genes. In contrast to earlier data a very high expression of the protein was detected not only in hematopoietic tissue but also in skeletal muscle and heart muscle. Electronmicroscopy was performed to investigate the subcellular localization in detail and showed that LAPTM5 is mainly present in late endosomes and lysosomes. FACS analysis revealed a surface expression of LAPTM5 and a constant amount of LAPTM5 at the surface during IgM mediated apoptosis. To further investigate the functional role of candidate genes during apoptosis an episomal expression and selection system was established. Cotransfection analysis with GFP (green fluorescent protein) showed that 80% of the separeted cells express the gene of interest for at least four weeks.

Lysosomen spielen entscheidende Rolle bei der zellulären Homöostase. Die Überwachung von Lysosomen, die Lipide ansammeln, ist eine erhebliche Herausforderung. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS) als Methode zur Überwachung intakter Lysosomen, insbesondere hinsichtlich des Einflusses von Arzneimitteln, die den Lipidstoffwechsel stören. Um das Potenzial von SERS zur Untersuchung von Lysosomen in lebenden Zellen zu bewerten, wurden die Wechselwirkungen zwischen trizyklischen Antidepressiva und saurer Sphingomyelinase untersucht. Zunächst wurden Modellsysteme untersucht. Die Wechselwirkungen zwischen den Antidepressiva und Goldnanopartikeln wurden durch SERS charakterisiert. Die Daten zeigten, dass Moleküle mit den Nanopartikeln interagieren. Als Modellsystem der lipidreichen Umgebung wurden Komposite aus Liposomen und Goldnanopartikeln von SERS und Cryo-EM untersucht. Die SERS-Spektren sind charakteristisch für die Lipidzusammensetzung der Vesikel. Die Wechselwirkungen zwischen den Antidepressiva und den Lysosomen wurden in der Fibroblastenzelllinie 3T3 durch SERS und komplementäre Methoden untersucht. In Übereinstimmung mit den SERS-Spektren von Modellsystemen zeigen die SERS-Spektren lebender Zellen Signaturen sowohl der Antidepressiva als auch der Lipide. Um die Unterschiede in den Lysosomen zwischen behandelten und nicht behandelten Zellen aufzudecken, wurde ein zufälliger Waldansatz verwendet. Darüber hinaus wurde SERS verwendet, um die Lipidverteilung in Leishmania-infizierten Makrophagen zu untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie Lipide akkumulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass SERS verwendet werden kann, um die Lipidzusammensetzung in lebenden Zellen verschiedener Zelltypen zu untersuchen. Als neue methodische Entwicklung zeigt die Random-Forest-Analyse von SERS-Daten, dass Ansätze des maschinellen Lernens für ein besseres Verständnis von Daten aus biologischen Systemen nützlich sein können. / Lysosomes play a crucial role in cellular homeostasis. Monitoring lysosomes that accumulate lipids represents a considerable challenge. This thesis focuses on the development of surface-enhanced Raman scattering (SERS) as a method to monitor intact lysosomes, in particular regarding the influence of drugs that interfere with lipid metabolism. To evaluate the potential of SERS for studying lysosomes in live cells, the interactions between tricyclic antidepressants and acid sphingomyelinase were studied. First, model systems were investigated. The interactions between the antidepressants and gold nanoparticles were characterized by SERS. The data showed that molecules interact with the nanoparticles. As a model system of the lipid-rich environment, composites of liposome and gold nanoparticles were studied by SERS and cryo-EM. The SERS spectra are characteristic of the vesicles’ lipid composition. The interactions between the antidepressants and the lysosomes were studied in the fibroblast cell line 3T3 by SERS and complementary methods. In agreement with the SERS spectra of model systems, the SERS spectra of live cells show signatures of both, the antidepressants and the lipids. To reveal the differences in the lysosomes between treated and non-treated cells, a random forest approach was used. Moreover, SERS was used to study the lipid distribution in Leishmania-infected macrophages known to accumulate lipids. The results show that SERS can be used to investigate lipid composition in live cells of different cell types. As a new methodological development, the random forest analysis of SERS data shows that machine learning approaches can be useful for a better understanding of data from biological systems.

Sensing of pathogens by pattern recognition receptors (PRR) is critical to initiate protective host defence reactions. However, activation of the immune system has to be carefully titrated to avoid tissue damage necessitating mechanisms to control and terminate PRR signalling. Dectin-1 is a PRR for fungal β-glucans on immune cells that is rapidly internalised after ligand-binding. Here, we demonstrate that pathogen recognition by the Dectin-1a isoform results in the formation of a stable receptor fragment devoid of the ligand binding domain. This fragment persists in phagosomal membranes and contributes to signal transduction which is terminated by the intramembrane proteases Signal Peptide Peptidase-like (SPPL) 2a and 2b. Consequently, immune cells lacking SPPL2b demonstrate increased anti-fungal ROS production, killing capacity and cytokine responses. The identified mechanism allows to uncouple the PRR signalling response from delivery of the pathogen to degradative compartments and identifies intramembrane proteases as part of a regulatory circuit to control anti-fungal immune responses.

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Die in dieser Arbeit isolierten und hochaufgereinigten, humanen dermalen Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 bestrahlt und anschließend entweder mit Substanz P oder anti-IgE stimuliert. Dadurch sollten Einblicke in die unterschiedlichen Wirkmechanismen der bei zahlreichen mastzellassoziierten Erkrankungen eingesetzten UV Licht Therapie gewonnen werden. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Erforschung der Histamin-, Tryptase- und Zytokinfreisetzung von menschlichen Mastzellen. Zusätzlich wurde die Expression von Lysosomen-assoziierten Membran Proteinen (LAMPs) auf der Oberfläche dieser Zellen untersucht. Im Gegensatz zu der durch UV Licht induzierbaren spontanen Histaminfreisetzung zeigte sich die anti-IgE stimulierte Histaminausschüttung durch UVB, UVA-1 und PUVA-1 signifikant und dosisabhängig inhibierbar. Auch die durch Substanz P stimulierten Mastzellen gaben nach UVA-1 Bestrahlung deutlich weniger Histamin ab. Demgegenüber blieb die sezernierte Menge des Mediators nach UVB und PUVA-1 konstant. Analog zu den erhobenen Histaminergebnissen konnte eine signifikante Inhibition der anti-IgE induzierten Tryptasefreisetzung nachgewiesen werden. Ebenso zeigte sich eine signifikante Verringerung, der innerhalb von vierundzwanzig Stunden basal freigesetzten Menge an Interleukin-6 und Interleukin-8, nach UV Bestrahlung. Die spontane Ausschüttung vom Tumornekrosefaktor-a verblieb in dem Untersuchungszeitraum auf sehr geringem Niveau, so dass eine relevante Beeinflussung durch UV Licht nicht stattfand. Des weiteren konnte eine vermehrte basale Expression von CD107a und CD63 auf der Mastzellmembran durch UV Bestrahlung demonstriert werden. Auch die anti-IgE induzierte Mehrexpression der LAMPs konnte bei den drei Bestrahlungsarten nachweisbar supprimiert werden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass die Auswirkungen der UV Licht Therapie auf Mastzellen sehr komplex sind. Zu beachten ist, dass unter physiologischen Bedingungen nicht nur isolierte Mastzellen, sondern auch weitere bestrahlte Zellverbände eine Veränderung erfahren. Erst durch das Zusammenspiel aller Zellen lassen sich Rückschlüsse auf Krankheitsbilder und die anzuwendende Therapien ziehen. Letztendlich soll diese Arbeit dazu beitragen, dass das Verständnis der unterschiedlichen Wirkungen von UV Licht begriffen und so ein sinnvolles und gezieltes Einsetzen im klinischen Alltag ermöglicht wird. / For all experiments highly purified dermal mast cells were used. The aim of the current study was to systematically investigate the effects of UVB, UVA-1 and PUVA-1 on skin derived human mast cells. Baseline and stimulated release of histamine, tryptase and of the proinflammatory cytokines IL-6, IL-8 and TNF-a were examined. Furthermore, the CD 107a and CD 63 surface levels in UV treated cells were investigated representing two members of lysosome associated membrane proteins which were found to appear on mast cell surface during degranulation. Prior treatment with UV resulted in a striking suppression of the anti-IgE induced release of preformed mediators such as histamine and tryptase in a dose dependent manner. This inhibition was accompanied by a diminished, anti-IgE mediated increase in CD 107a and CD 63 surface expression. In sharp contrast, UV-light slightly preactivates mast cells as indicated by a marginal but statistically significant direct UV-caused histamine release. Theses findings matched the observation of slightly enhanced CD 107a and CD 63 surface levels in UV treated but unstimulated cells. After UVA-1 treatment the histamine release of substance P stimulated mast cells is statistically significant reduced which contrasts to the unchanged liberation of this preformed marker after UVB and PUVA-1 irradiation. Furthermore the release of mediators that are not or only partially preformed was examined. In the present study all types of UV-irradiation inhibits baseline IL-6 and IL-8 secretion from mast cells. The very low baseline level of TNF-a remained unaffected. Taken together, the present findings identify cutaneous human mast cells as important targets of UV-induced immunomodulation. They help explain both the dose-dependent adverse effects of UV-light and the beneficial and desired antiinflammatory effects during therapy.

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