Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc. / Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.

La méiose des ovocytes de mammifères débute au stade fœtal puis s’arrête temporairement au stade dictié de la prophase-1. Cet arrêt sera maintenu pendant plusieurs années. In vivo, la méiose des ovocytes ne reprendra que suite au pic de LH (hormone lutéinisante) endogène. Lorsque les ovocytes sont retirés de leur follicule et cultivés in vitro, ils reprennent spontanément leur méiose. Une concentration élevée d’AMPc les maintient en arrêt méiotique caractérisé par le stade de vésicule germinale (GV ou dictié), tandis qu’une diminution de la concentration d’AMPc par l’action des phosphodiestérases (PDEs) permet la reprise méiotique. Cet ouvrage comporte deux volets qui investiguent le rôle joué par deux enzymes, la phosphodiestérase de type 3 et l’AMPK (5’adenosine monophosphate activated protein kinase), dans le mécanisme de la reprise méiotique des complexes-ovocytes-cumulus (COCs) et des ovocytes dénudés (DOs) porcins. / The meiosis of mammalian oocytes begins during fœtal life and stops at the dictyate stage. This stop would be maintained for severals years. LH surge in vivo or culturing oocytes in vitro allows spontaneous meiotic resumption. High intracellular levels of cAMP maintain meiotic arrest, characterized by the germinal vesicle (GV stage), while decreased levels induce meiotic resumption. This study was undertaken to assess the role of phosphodiesterase types 3 and 5’adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) in controlling meiotic resumption in both porcine cumulus-oocytes complexes (COC) and denuded oocytes (DO).

La méiose est la division cellulaire qui aboutit à la production de gamètes haploïdes. Lors de la méiose, un unique évènement de réplication est suivi de deux divisions afin de réduire la ploïdie. Lors de ces deux divisions, la cohésion entre chromatides sœurs est éliminée de façon séquentielle pour permettre la succession de deux ségrégations de chromosomes équilibrées. La progression du ‘’cycle méiotique’’ est contrôlée par des régulateurs communs à la mitose et à la méiose mais également par des mécanismes nécessitant des protéines spécifiques à la méiose. L’objectif de de mon travail de thèse était de décrypter les mécanismes moléculaires permettant l’enchainement de deux divisions équilibrées pour la production de gamètes haploïdes. Nous avons pu montrer que la protéine OSD1 inhibait l’APC/C pour permettre la progression méiotique. Nous avons également mis en évidence un réseau fonctionnel, comprenant OSD1, CYCA1;2/TAM et TDM, indispensable à trois étapes clés de la progression méiotique chez Arabidopsis ; la transition prophase-méiose I, la transition méiose I-méiose II et la sortie de méiose. Ces travaux ont également permis de caractériser chez Arabidopsis les deux paralogues de Shugoshin, qui sont des protéines conservées et impliquées dans la protection de la cohésion centromérique. Nous avons également identifié Patronus comme un nouveau protecteur de la cohésion centromérique en méiose. Les résultats obtenus suggèrent que Patronus est un régulateur de l’APC/C qui permet d’empêcher l’élimination de la cohésion centromérique en interkinèse méiotique. / Meiosis is a specialized type of cell division that generates haploid gametes. At meiosis, two divisions follow a single DNA replication event leading to ploidy halving. A stepwise sister chromatids cohesion release also occurs to allow the two successive balanced rounds of chromosome segregation. In addition to general cell-cycle regulators, meiosis requires specific proteins. The aim of this thesis was to understand the molecular mechanisms leading to two successive balanced chromosome segregations. We show that OSD1 promotes meiotic progression through APC/C inhibition and we identified a functional network between OSD1, CYCA1;2/TAM and TDM in Arabidopsis. This functional network controls three key steps of meiotic progression; the prophase-meiosis I transition, the meiosis I-meiosis II transition and the meiosis exit. In addition, we characterized the two Arabidopsis thaliana Shugoshin paralogs, which are conserved proteins involved in sister chromatid cohesion protection. We also identified Patronus, an uncharacterized protein, as a novel protector of meiotic centromeric cohesion. We suggest that Patronus is a novel APC/C regulator that prevents cohesins release during meiotic interkinesis. This work identified two APC/C regulators essential for meiosis in Arabidopsis thaliana.

Dans la plupart des organismes, les crossovers se formant au cours de la méiose sont interférérents : deux crossovers sont rarement à proximité. Nous avons étudié ce phénomène en détail dans la plante modèle Arabidopsis thaliana en utilisant une grande population de rétro-croisements, en méiose mâle et en méiose femelle. Nous avons utilisé le modèle Gamma à deux voies, superposant à la voie interférente une proportion p de crossovers d'une deuxième voie non interférente. La méiose femelle montre une interférence plus élevée et une proportion p plus faible que la méiose mâle. Par ailleurs nos comparaisons intra-chromosomiques concluent qu'il existe des variations d'interférence entre le bras gauche et le bras droit d'une part et entre la partie centrale et les régions distales d'autre part. Nous avons ensuite développé des tests statistiques qui ont révélé des hétérogénéités dans la proportion p le long des chromosomes. De telles variations ont ensuite été trouvées dans un jeu de données de tomate où notre analyse statistique nous a permis de montrer pour la première fois sur un organisme «sauvage» que la deuxième voie était très peu interférente et qu'en fait les deux voies avaient un peu de « cross-talk ». Vu que la limitation la plus sévère des modèles utilisés jusqu'à présent est l'hypothèse de constance du paramètre p, nous avons développé un modèle généralisé où les deux voies peuvent avoir des paysages de recombinaison différents. Ce modèle nommé PSL-GS a été implémenté en logiciel et testé sur des données simulées et sur trois jeux de données de plantes. L'utilisation du critère BIC suggère que tout comme chez la tomate, les paysages de recombinaison d'Arabidopsis et du maïs sont différents entre les 2 voies. / For most organisms, crossovers forming during meiosis exhibit crossover interference – nearby crossovers are rare. This phenomenon was studied in great detail in Arabidopsis thaliana using a large backcross population for male and female meiosis. We used the gamma two-pathway model by superposing proportion (1- p) of interfering crossovers with p of non-interfering crossovers. It was observed that female meiosis shows higher interference but lower proportion of non-interfering crossovers than male meiosis. Further intra-chromosomal interference comparisons conclude that there are variations between (a) left and right arms, and (b) the central versus distal regions of a chromosome. Then statistical tests revealed heterogeneities in the non-interfering crossover proportion along chromosomes. Thereafter various statistical tools developed to examine a very novel wild-type tomato data annotating crossover positions from both pathways provided evidence for ‘cross-talk’ between the two pathways of crossover formation as opposed to being independent. Finally a model named Pathway-Specific Landscapes Gamma-Sprinkling (PSL-GS) incorporating chromosomal non-uniformity in the individual pathways has been proposed to extend present state-of-the-art interference modeling which consider both pathways to be uniform along chromosomes.

Afin de transmettre leurs informations génétiques d'une génération à l'autre, les organismes à reproduction sexuée doivent réduire de moitié leur contenu chromosomique pour former des gamètes haploïdes. Cette réduction se produit lors d'une division cellulaire appelée méiose, durant laquelle une étape de réplication est suivie de deux divisions successives, la méiose I et II. Au cours de la méiose I, les chromosomes homologues se séparent et leur bonne ségrégation dépend de la création entre eux d’un lien physique. En méiose c’est le processus de réparation appelé recombinaison homologue, qui à la suite de l’induction dans le génome de centaine de cassures double brin par la protéine Spo11, permet d’établir ce lien. Spo11 est l'orthologue méiotique de la sous-unité catalytique de la topoisomérase VI, TopoVIA. Comme TopoVI est composée de deux sous-unités, TopoVIA et TopoVIB, l’existence d’un orthologue méiotique de TopoVIB était une question posée depuis l'identification de Spo11. Au cours de ma thèse, j'ai contribué à identifier une nouvelle famille de protéine, que l’on a nommé TopoVIB-like, orthologue à TopoVIB et nécessaire à la formation des cassures double-brin d'ADN méiotiques(Robert et al, 2016). Ces protéines ont des domaines similaires à ceux de TopoVIB, à savoir un GHKL (impliqué dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP), un domaine transducteur et un domaine CTD. Nous avons démontré que chez la souris, SPO11 forme un complexe avec TOPOVIBL. De plus, nous avons démontré que cette protéine est nécessaire à la formation des CDB. Ces résultats suggèrent que chez la souris, les CDB méiotiques sont catalysées par un complexe TopoVI-like. Chez S. cerevisiae, il n'y a pas d'orthologue clair de TopoVIB, mais nous avons trouvé que la protéine Rec102, connue pour être nécessaire à la formation des CDB méiotiques, présente une homologie partielle avec le domaine transducteur des TopoVIB-like. Rec102 forme un complexe avec Rec104, une protéine également requise pour la formation des CDB. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que le complexe Rec102 / Rec104 était l'orthologue méiotique de TopoVIB chez la levure, interagissant avec Spo11 pour former un complexe de type TopoVI-like. Malgré l'importance de Spo11, son mode d'action est mal connu. Cette absence de données biochimiques est due à l’insolubilité de la protéine. Le but de ma thèse était de caractériser le mode d'action et la régulation du complexe TopoVI-like dans la formation des CDB méiotiques. Tout d'abord, biochimiquement, en purifiant in vitro une forme soluble du complexe TopoVI-like de levure composé de Spo11 / Rec102 / Rec104 / Ski8 (un partenaire direct de Spo11) en co-exprimant ces protéines dans deux systèmes d'expression, E. coli et S. cerevisiae. En utilisant E. coli, j'ai réussi à purifier un complexe soluble formé par Spo11 / Rec102 / Rec104 / Ski8 et en utilisant S. cerevisiae, j'ai purifié deux complexes différents, l'un formé par les quatre protéines, et un formé uniquement par Spo11 et Rec102. Néanmoins, les tests d'activité sur différents substrats d'ADN n'ont révélé aucune activité de coupure de l’ADN. Le deuxième objectif de ma thèse était d'étudier comment, chez la souris, TOPOVIBL régule l'activité de SPO11 en interagissant avec d'autres protéines nécessaires à la formation des CDB. En double hybride, j'ai prouvé que, comme chez la levure, l'orthologue méiotique de TopoVIB chez la souris interagissait avec REC114, une autre protéine nécessaire à la formation des CDB. La cartographie de cette interaction à l'échelle de l’acide aminé a conduit à l'identification d'un résidu sur TOPOVIBL essentiel pour l'interaction entre TOPOVIBL et REC114. Afin d'étudier in vivo le rôle de l'interaction entre TOPOVIBL et REC114, une souris mutante pour le résidu identifié de TOPOVIBL a été générée à l'aide de CRISPER-Cas9 et son phénotype a été analysé. / To properly transmit their genetic information from one generation to another, sexually reproductive organisms need to halve their genome to form haploid gametes. This reduction occurs during a special cell division called meiosis, which proceeds through one round of DNA replication followed by two successive divisions called meiosis I and II. During meiosis I homologous chromosomes segregate, and their proper segregation depends on the homologous recombination pathway that establishes a physical link between the homologues. During meiosis, homologous recombination events are triggered by the formation of DNA double strand break (DSB) catalyzed by the evolutionarily conserved Spo11 protein. Spo11 is the meiotic ortholog of the catalytic subunit of the TopoVI topoisomerase, TopoVIA. As TopoVI is composed of two subunits, TopoVIA and TopoVIB, the requirement for meiotic DSB formation of a B subunit was under investigation since the identification of Spo11. During my PhD, I contributed to the identification of a new family of protein, the TopoVIB-like family, ortholog to the Topoisomerase VI B subunit (TopoVIB) and required for meiotic DNA double strand break formation (Robert et al, 2016). These proteins share domains in part similar to the canonical TopoVIB which are a GHKL domain (involved in ATP binding and hydrolysis), a transducer domain and a CTD domain. We demonstrated that in mice, SPO11 forms a complex with TOPOVIBL. Biochemical characterization of this complex showed a structure compatible with an A2B2 organization. Furthermore, we demonstrated that this protein is required for meiotic DSB formation. These results suggest the existence, in mice, of a TopoVI-like complex that catalyzes the formation of meiotic DSB. In S. cerevisiae, there is no clear TopoVIB-like ortholog, but we found that the Rec102 protein, which is known to be required for the formation of meiotic DSB, shows a partial homology with the transducer domain of the TopoVIB-like proteins. Rec102 forms a complex with Rec104, a protein also essential for DSB formation. Thus, we hypothesized that the Rec102/Rec104 complex is the yeast meiotic ortholog of TopoVIB, interacting with Spo11 to form a meiotic TopoVI-like complex. Despite the importance of Spo11 little is known about its mode of action. This absence of biochemical data is due to the lack of solubility of the protein. The aim of my PhD was to characterize the mode of action and regulation of the TopoVI-like complex for meiotic DSB formation. First, biochemically, by purifying in vitro a soluble form of the yeast TopoVI-like complex composed by Spo11/Rec102/Rec104/Ski8. To achieve this objective, I co-expressed these proteins in two different expression systems, E. coli and meiotic culture of S. cerevisiae. Using E. coli I managed to purify a soluble complex formed by Spo11/Rec102/Rec104/Ski8, and using meiotic culture of S. cerevisiae, I purified two different complexes, one formed, by the four proteins, and one formed only by Spo11 and Rec102. Nevertheless, in vitro activity essays on different DNA substrates did not reveal any DNA cleavage activity. The second goal of my PhD was to study how in mouse, the activity of TOPOVIBL / SPO11 may be regulated by other proteins known to be required for DSB formation. Using Y2H experiment I was able to prove that, as in yeast, mouse TOPOVIBL interacts with REC114, a protein required for DSB formation. The mapping of this interaction at the amino-acid scale, leads to the identification of one residue on TOPOVIBL essential for the interaction between TOPOVIBL and REC114. In order to investigate in vivo the role of the interaction between TOPOVIBL and REC114, a mutant mouse carrying a mutation in the identified residue of TOPOVIBL was generated using CRISPER-Cas9, and its phenotype analyzed.

La méiose est la division cellulaire qui aboutit à la production de gamètes haploïdes. Lors de la méiose, un unique évènement de réplication est suivi de deux divisions afin de réduire la ploïdie. Lors de ces deux divisions, la cohésion entre chromatides sœurs est éliminée de façon séquentielle pour permettre la succession de deux ségrégations de chromosomes équilibrées. La progression du ''cycle méiotique'' est contrôlée par des régulateurs communs à la mitose et à la méiose mais également par des mécanismes nécessitant des protéines spécifiques à la méiose. L'objectif de de mon travail de thèse était de décrypter les mécanismes moléculaires permettant l'enchainement de deux divisions équilibrées pour la production de gamètes haploïdes. Nous avons pu montrer que la protéine OSD1 inhibait l'APC/C pour permettre la progression méiotique. Nous avons également mis en évidence un réseau fonctionnel, comprenant OSD1, CYCA1;2/TAM et TDM, indispensable à trois étapes clés de la progression méiotique chez Arabidopsis ; la transition prophase-méiose I, la transition méiose I-méiose II et la sortie de méiose. Ces travaux ont également permis de caractériser chez Arabidopsis les deux paralogues de Shugoshin, qui sont des protéines conservées et impliquées dans la protection de la cohésion centromérique. Nous avons également identifié Patronus comme un nouveau protecteur de la cohésion centromérique en méiose. Les résultats obtenus suggèrent que Patronus est un régulateur de l'APC/C qui permet d'empêcher l'élimination de la cohésion centromérique en interkinèse méiotique.

Dans la plupart des organismes, les crossovers se formant au cours de la méiose sont interférérents : deux crossovers sont rarement à proximité. Nous avons étudié ce phénomène en détail dans la plante modèle Arabidopsis thaliana en utilisant une grande population de rétro-croisements, en méiose mâle et en méiose femelle. Nous avons utilisé le modèle Gamma à deux voies, superposant à la voie interférente une proportion p de crossovers d'une deuxième voie non interférente. La méiose femelle montre une interférence plus élevée et une proportion p plus faible que la méiose mâle. Par ailleurs nos comparaisons intra-chromosomiques concluent qu'il existe des variations d'interférence entre le bras gauche et le bras droit d'une part et entre la partie centrale et les régions distales d'autre part. Nous avons ensuite développé des tests statistiques qui ont révélé des hétérogénéités dans la proportion p le long des chromosomes. De telles variations ont ensuite été trouvées dans un jeu de données de tomate où notre analyse statistique nous a permis de montrer pour la première fois sur un organisme "sauvage" que la deuxième voie était très peu interférente et qu'en fait les deux voies avaient un peu de " cross-talk ". Vu que la limitation la plus sévère des modèles utilisés jusqu'à présent est l'hypothèse de constance du paramètre p, nous avons développé un modèle généralisé où les deux voies peuvent avoir des paysages de recombinaison différents. Ce modèle nommé PSL-GS a été implémenté en logiciel et testé sur des données simulées et sur trois jeux de données de plantes. L'utilisation du critère BIC suggère que tout comme chez la tomate, les paysages de recombinaison d'Arabidopsis et du maïs sont différents entre les 2 voies.

La recombinaison méiotique via les Crossing-Overs (COs) est le principal mécanisme permettant le brassage de la diversité génétique. Cependant, le nombre et la position des COs entre paires de chromosomes homologues sont strictement régulés, limitant la séparation des loci en sélection variétale. Dans le cas du colza B. napus, l’utilisation d’allotriploïdes (AAC, 2n=3x=29), issus du croisement entre le colza (AACC, 2n=4x=38) et l’un de ses progéniteurs B. rapa (AA, 2n=2x=20), permet d’augmenter considérablement le nombre de COs entre chromosomes homologues A. L’objectif de cette étude était de déterminer les conséquences d’une telle variation sur la distribution des COs le long des chromosomes ainsi que d’identifier des facteurs régulant ce phénomène. Suite à la production et à la caractérisation cytogénétiques d’hybrides F1 présentant différents caryotypes, la recombinaison homologue a été évaluée par des analyses génétiques via des marqueurs SNPs physiquement ancrés sur l’ensemble duNous avons montré que l’addition du génome C chez les allotriploïdes conduit toujours à (1) la formation de COs surnuméraires, dont le nombre varie fonction des méioses mâle/femelle et du fond génétique, (2) une modification des profils de recombinaison, notamment au voisinage des centromères, et (3) une réduction de l’intensité d’interférence. De plus, nous avons révélé que le contrôle génétique de ces variations est imputé à des chromosomes C spécifiques et aurait divergé dans un contexte polyploïde. Nous avons donc identifié un levier permettant d’optimiser le brassage de la diversité gén / Meiotic recombination via crossovers (COs) is the main mechanism responsible for mixing genetic diversity. However, the number and position of COs between the pairs of homologous chromosomes are strictly regulated, limiting the loci separation in plant breeding. In the case of the rapeseed B. napus, the use of allotriploids (AAC, 2n=3x=29), resulting from the cross between rapeseed (AACC, 2n=4x=38) and one of its progenitors B. rapa (AA, 2n=2x=20), allows a substantial increase of the number of COs between homologous A chromosomes. The objective of this study was to determine the consequences of such a variation on the distribution of COs along the chromosomes and to identify factors regulating this phenomenon. Following the production and cytogenetic characterization of F1 hybrids with different karyotypes, homologous recombination was assessed by genetic analyzes via SNPs markers physically anchored on the whole A genome.We showed that the additional C genome in allotriploids always leads to (1) the formation of extra COs, for which the number depends on the male/female meiosis and the genetic background, (2) the modification of the recombination landscapes, especially in the vicinity of centromeres, and (3) the decrease of CO interference. In addition, we revealed that the genetic control of these variations is assigned to specific C chromosomes and could have evolved in a polyploid context. We have therefore identified a way to optimize the shuffling of genetic diversity in rapeseed breeding.

Au vignoble, des nuits froides peuvent se produire pendant la floraison et en particulier au moment de la méiose ovulaire dans les fleurs. La vigne est particulièrement vulnérable puisque la méiose ovulaire se produit lors de la transition du métabolisme de la plante d'un état hétérotrophe à un état autotrophe. Bien que la feuille soit l'organe photosynthétique principal, la jeune inflorescence de vigne possède un statut particulier et participe activement à l'effort reproducteur en exportant la majorité du carbone qu'elle assimile, permettant ainsi le développement des feuilles. Par conséquent, le métabolisme carboné de l'inflorescence lors du développement reproducteur peut être impliqué dans le futur rendement. Chez la vigne, le phénomène de coulure, propre à chaque cépage, peut engendrer des pertes de rendement importantes lorsque la plante est exposée à un stress. Le Pinot noir (PN) est considéré comme un cépage relativement « résistant » à la coulure alors que le taux d'abscission chez le Gewurztraminer (GW) augmente considérablement lors de conditions climatiques défavorables. Chez le PN, l'inflorescence effectue une photosynthèse inférieure et une respiration de nuit supérieure à celle de la feuille. L'activité et la régulation des deux photosystèmes sont très différentes entre ces deux organes lors des premiers stades de développement et les activités des deux photosystèmes sont supérieures au niveau de l'inflorescence. Néanmoins, la protection de la chaîne photosynthétique contre l'excès d'énergie est plus efficace dans la feuille. Contrairement à la feuille, l'activité photosynthétique de l'inflorescence évolue au cours de son développement. En effet, l'activité de la chaîne photosynthétique ainsi que la photosynthèse nette diminuent progressivement au cours de la floraison et le flux cyclique des électrons se met en place pour être finalement supérieur à celui de la feuille. L'activation de ce flux peut alors permettre une synthèse accrue d'ATP, une protection de la chaîne photosynthétique contre les dommages provoqués par un excès d'énergie ou encore la réparation des photosystèmes. Lorsque la nuit froide survient lors de la méiose ovulaire, le métabolisme carboné de l'inflorescence de PN est différemment modifié selon l'intensité du stress. Ainsi, après une nuit à 4°C, la modification de l'activité photosynthétique de l'inflorescence est due à des limitations de nature non-stomatique alors qu'après une nuit à 0°C, cette modification est due à des limitations de nature stomatique. Une nuit à -3°C altère profondément l'activité photosynthétique de l'inflorescence. Ces nuits froides induisent également une accumulation de glucides. Lors du développement floral en conditions optimales, le PN et le GW présentent une activité photosynthétique et un métabolisme carboné différents. La régulation des flux linéaire et cyclique des électrons est également différente. Ce dernier semble avoir une fonction différente chez ces deux cépages avec notamment une possible implication dans la réparation du PSII et/ou dans une synthèse d'ATP accrue à la fin du processus de floraison chez le PN. La chaîne photosynthétique du GW semble mieux protégée ce qui peut expliquer le rendement supérieur de ce cépage en conditions optimales. Néanmoins, l'exposition à une nuit froide entraine des modifications différentes de l'activité de l'inflorescence chez ces cépages avec une perturbation plus importante chez le GW. En effet, chez ce cépage, seule la photosynthèse nette est perturbée suite à la nuit froide alors que chez le PN, les processus de photosynthèse et de respiration sont modifiés. L'activité de la chaîne photosynthétique ainsi que l'activité métabolique de l'inflorescence de GW est également davantage affectée. De manière intéressante, nos résultats suggèrent que ces différentes perturbations de l'activité de l'inflorescence sont dues à des régulations différentes. / In the vineyard, cold night can occur during flowering and particularly at time of female meiosis in flowers. In grapevine, stress vulnerability is enhanced because female meiosis occurs when the whole plant physiology is switching its carbon nutrition from mobilization of wood reserves to photosynthesis in the leaves. Nevertheless, although leaf is the major photosynthetic organ, in grapevine, the young inflorescence has a particular status and takes part in the reproductive effort by exporting the majority of assimilated carbon, allowing in particular the leaves development. Consequently, the inflorescence metabolism during this phase can ultimately determines yield. In grapevine, coulure phenomenon, differing according to the cultivar, can generate important yield losses when a stress occurs. Pinot noir (PN) is considered as a cultivar relatively “resistant” to coulure phenomenon whereas Gewurztraminer (GW) abscission rate considerably increases under environmental stress.In PN, inflorescence performs a lower photosynthesis and a higher dark respiration than leaves. Functioning and regulation of PSI and PSII are very different between inflorescence and leaf during the first developmental stages and activities of these photosystems are higher in the inflorescence. Nevertheless, the photosynthetic chain against excess energy is more efficient in the leaf. Contrary to the leaf, the inflorescence photosynthetic activity evolves during the floral development. Indeed, photosynthetic chain activity and net photosynthesis progressively decrease and the cyclic electron flow appears and is higher than in leaf. This activation could provide ATP, protection against photodamage or repair of the photosystems.When cold night occurs at the female meiosis stage, carbohydrate metabolism of the PN inflorescence is differently modified according to the intensity of the cold stress. At 4°C, photosynthesis in the inflorescence is impaired through non-stomatal limitations, whereas at 0°C it is affected through stomatal limitations. A freezing night (-3°C) severely deregulates photosynthesis in the inflorescence. Cold nights also induce accumulation of sugars.Comparing PN and GW, different photosynthetic activity and carbohydrate metabolism have been showed during the floral development under optimal conditions. Regulations of the linear and cyclic electron flow are also different and the cyclic electron flow seems to have a different aim with particularly an implication in the recovery of PSII and ATP synthesis at the end of the flowering process in PN. GW could have higher protection of the photosynthetic chain and consequently gets a higher yield under optimal conditions. Nevertheless, chilling night impacts differently the activity of the inflorescences of both cultivars with higher modification in GW inflorescence. Indeed, in this cultivar, only the net photosynthesis is altered whereas in PN, both net photosynthesis and respiration processes are modified. The photosynthetic chain activity and metabolical activity of the inflorescence are also more affected by the cold night in GW. Interestingly, our results suggest that the different fluctuation of the inflorescence activities as response to the chilled night is due to different regulations.

Aperçu du contrôle de la dégradation des ARNm par les protéines YTHpendant la transition de la méiose à la mitose chez les levures.Le cycle cellulaire est contrôlé par des processus complexes et interconnectés. Un gène est transcrit en ARNm qui est traduit en protéines mais de nombreux processus de régulation travaillent pour contrôler chaque étape de ce processus apparemment simple. Parmi ces points de contrôle, la régulation post-transcriptionnelle est importante, et la formation d'un complexe protéine-ARN peut diriger le destin cellulaire. Parmi ces protéines de liaison à l'ARN, les protéines contenant des domaines YTH n’ont été découvertes qu’à la fin des années 90. Les protéines contenant des domaines YTH sont abondantes chez les eucaryotes et absentes chez les procaryotes. Elles constituent la majorité des protéines « readers » capables de reconnaître spécifiquement la modification m6A. L’Homme possède cinq protéines YTH, YTHDF1-3, YTHDC1,2 (Hazra, D., C. Chapat, et Graille, M. (2019). Destin de l'ARNm de m6A : enchaînés au rythme par les protéines contenant de la YTH. , 10 (1), 49.). Bien qu'il soit évident que ces protéines contrôlent le destin cellulaire, la fonction de chaque protéine et son réseau d’interaction restent à élucider. Chez les levures, une seule protéine YTH est présente: Pho92 chez Saccharomyces cerevisiae et Mmi1 chez Schizosaccharomyces pombe. Hormis le domaine YTH, il n'y a pas d'homologie de séquence entre ces deux protéines mais leur fonction cellulaire est similaire.Il est bien établi que Mmi1 est responsable de la dégradation des transcrits spécifiques de la méiose au cours de la croissance végétative des cellules chez la levure S. pombe. Mmi1 forme un complexe stable avec une petite protéine, Erh1 (complexe Erh1-Mmi1 ou EMC). Le complexe EMC peut physiquement interagir avec la sous-unité Not1 du complexe CCR4-Not et la recruter pour la dégradation des ARNm contenant des motifs DSR (déterminant de l'élimination sélective). L'action de Mmi1 est à son tour régulée par une protéine possédant un domaine RRM, Mei2. Au cours de la méiose, Mei2, avec l’aide d’un lncRNA meiRNA, séquestre Mmi1 dans un point nucléaire, le rendant inactif et assurant la continuité de la méiose. Ces trois protéines, Mmi1-Erh1-Mei2, jouent un rôle clé dans la transition de la mitose vers la méiose.Chez S. cerevisiae, Pho92 est impliquée dans la dégradation des transcrits de PHO4, contribuant à la voie du métabolisme du phosphate, pendant la privation en phosphate et participe également à la dégradation des ARNm contenant les marques épitranscriptomiques de N6-méthyladénosine (m6A). Comme pour S. pombe Mmi1, Pho92 recrute le complexe CCR4-Not via une interaction physique avec Not1.Au cours de ma thèse, j'ai tenté d'élucider le rôle de ces deux protéines du domaine YTH de deux organismes modèles, S. cerevisiae et S. pombe, dans la dégradation de l'ARNm et la régulation du cycle cellulaire par des approches biochimiques et structurales.Pho92 de S. cerevisiae interagit physiquement avec Not1 du complexe CCR4-Not, nous avons pu déterminer les limites des domaines impliqués dans cette interaction. L’interaction entre ces deux protéines a été étudiée par anisotropie de fluorescence. Le complexe protéique a été purifié avec succès et des essais de cristallisation sont en cours.Chez S. pombe, la structure de Mei2-RRM3 a été résolue avec et sans ARN. Les propriétés de liaison à l'ARN de Mei2-RRM3 ont été étudiées par ITC. La structure de Erh1 a également été résolue révélant une organisation en homodimere. Nous avons montré que la formation de cet homodimere est important pour la fonction biologique de Mmi1. Des essais de co-cristallisation ont été réalisés avec de l'ARN et les protéines Mmi1 et Mei2, mais sans succès et nous avons obtenu des cristaux de Mmi1. / Insights into the control of mRNA decay by YTH proteinsduring the transition from meiosis to mitosis in yeasts.Keywords: Epitranscriptomics, mRNA decay, meiosis, multi-protein complexes, YTH domainCell cycle is controlled by multi-layered processes. A gene is transcribed in mRNA which is translated in proteins but innumerable regulation processes are working to control every step of this apparently simple process. Among these regulatory check points, post-transcriptional regulation is an important one, where formation of a protein-RNA complex may direct the cellular fate. Among these RNA binding proteins, YTH domain proteins are most novel, discovered in late 90s. YTH domain proteins are abundant in eukaryotes and absent in prokaryotes. YTH domain proteins constitute the majority of reader proteins that can specifically identify m6A modification. Human beings have five YTH domain proteins YTHDF1-3, YTHDC1-2 (Hazra, D., Chapat, C., & Graille, M. (2019). m6A mRNA Destiny: Chained to the rhYTHm by the YTH-Containing Proteins. Genes, 10(1), 49.). Although it is evident that these proteins are controlling cellular fate, the function of each protein and their network is yet to be elucidated. In yeast, there is only one YTH domain protein present: Pho92 in Saccharomyces cerevisiae and Mmi1 in Schizosaccharomyces pombe. Apart from the YTH domain there is no sequence homology between these two proteins but their cellular function is similar.It is well established that Mmi1 is responsible for degradation of meiosis specific transcripts during vegetative growth of the cell. Mmi1 forms a tight complex with a small protein, Erh1 (Erh1-Mmi1 complex or EMC). EMC can physically interact with Not1 of CCR4-Not complex and recruit it for degradation of DSR (determinant of selective removal) containing RNAs. The action of Mmi1 is in turn regulated by an RRM domain protein, Mei2. During meiosis, Mei2, along with a lncRNA meiRNA sequesters Mmi1 in a nuclear dot, rendering it inactive and ensuring smooth continuance of meiosis. These three proteins, Mmi1-Erh1-Mei2 play a key role in mitosis to meiosis switch.In S. cerevisiae, Pho92 is involved in the degradation of PHO4 transcripts contributing to phosphate metabolism pathway, during phosphate starvation and also participates in the degradation of mRNAs containing the N6-methyladenosine (m6A) epitranscriptomics marks. Similarly, to S. pombe Mmi1, Pho92 recruits CCR4-Not complex by physical interaction with Not1.During my PhD, I have tried to elucidate the role of these two YTH domain proteins from two model organisms, S. cerevisiae and S. pombe, in mRNA degradation and cell cycle regulation using biochemical and structural approaches.Pho92 of S. cerevisiae physically interacts with Not1 of CCR4-Not complex, we were able to determine the boundaries of this interaction. The interaction between these two proteins was studied by Fluorescence anisotropy. The protein complex was successfully purified and crystallization trials are ongoing.From S. pombe, structure of Mei2-RRM3 was solved with and without an RNA. RNA binding properties of Mei2-RRM3 was studied by ITC. The structure of Erh1 was also solved and we tried to elucidate its importance for biological function of Mmi1. A co-crystallization trial was performed with Mmi1-Mei2-RNA but it was unsuccessful and we ended up with Mmi1 crystals.