Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-23T19:51:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Rafaela de Siqueira Ferraz Carvalho.pdf: 2336940 bytes, checksum: 664ca08fe0473c6c7f282f6e4d5ed6ea (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-23T19:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Rafaela de Siqueira Ferraz Carvalho.pdf: 2336940 bytes, checksum: 664ca08fe0473c6c7f282f6e4d5ed6ea (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / FACEPE / A utilização de sistemas de liberação controlada de fármacos de base nanotecnológica, a exemplo dos lipossomas, representa atualmente um grande avanço no tratamento e diagnóstico de várias doenças. Modificações na superfície desses nanossistemas vêm sendo foco nas pesquisas, com objetivo de maximizar a eficácia e segurança dos mesmos, a partir do desenvolvimento de sistemas de longa circulação e/ou sítio-específicos. Neste trabalho, a fucana, um polissacarídeo sulfatado, foi utilizada como molécula de revestimento da superfície de lipossomas, uma vez que apresenta duas propriedades importantes: a capacidade de não ativar o sistema complemento, e a de ser reconhecida e poder se ligar à receptores encontrados na superfície de macrófagos. Essas duas propriedades nos encorajaram a utilizar a fucana com o propósito de desenvolver um novo sistema lipossomal de longa circulação e direcionado para macrófagos. Assim, a primeira etapa deste estudo envolveu uma síntese química, na qual a fucana foi modificada quimicamente por meio de sua conjugação com o colesterol (fucana hidrofobizada), através de um novo procedimento de irradiação por micro-ondas. Posteriormente, lipossomas revestidos com fucana contendo ácido úsnico foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico, variando as quantidades de fucana hidrofobizada. Os lipossomas foram caracterizados por determinação do tamanho da partícula, índice de polidispersão (PDI), carga de superfície (ζ) e eficiência de encapsulação do fármaco. Além disso, os lipossomas foram avaliados em estudos in vitro de citotoxicidade, captura celular e pelo método de competição de inibidores por receptores específicos frente a macrófagos RAW 264.7. Por fim, a atividade antimicobacteriana e interações entre fármacos foram avaliada pelo método chekerboard contra isolados de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes. Os resultados obtidos evidenciaram que a fucana modificada quimicamente foi capaz de ser utilizada no desenvolvimento de lipossomas revestidos. Observou-se que a variação da quantidade de fucana de 5 para 20 mg promoveu um aumento no tamanho e no PDI das vesículas de 168 ± 2,82 nm, 0,36 para 1,18 ± 0,01μm, 0,46, respectivamente. Por outro lado, com o aumento da concentração de fucana, o ζ diminuiu (1,35 ± 0,185 mV para -5,41 ± 0,234 mV), visto que a mesma é um polissacarídeo negativo. Em relação à taxa de encapsulação, todas as formulações apresentaram valor superior a 98% indicando que o revestimento com fucana não alterou a encapsulação do ácido úsnico. Os estudos de citotoxicidade revelaram que as formulações lipossomais revestidos com fucana, exibiram valores de IC50 inferiores (12.70 ± 1,56μM) em comparação aos lipossomas sem revestimento IC50= 18,37 ± 3,24 μM). Em relação à captura celular, os resultados mostraram que os lipossomas revestidos foram capturados de forma mais rápida (15 min) que os lipossomas sem revestimentos (60 min) podendo sugerir que foram mais rapidamente reconhecidos pelos macrófagos. Adicionalmente, os resultados obtidos no experimento de inibidores competitivos sugerem que os lipossomas revestidos pela fucana (Lipofuc5) foram internalizados através do “scavenger receptors” (SR) presente na superfície dos macrófagos. Nos estudos utilizando isolados de M. tuberculosis multirresistentes, a encapsulação do ácido úsnico em lipossomas potencializou a atividade antimicobacteriana deste composto liquênico, além de apresentar um efeito sinérgico com a ripamficina. Esses sistemas apresentam, portanto, um potencial como candidatos à melhoria da atividade antimicobacteriana da rifampicina. Diante do exposto, os lipossomas revestidos com fucana contendo ácido úsnico apresentam-se como uma alternativa para o direcionamento eficiente de fármacos aos macrófagos. / The use of controlled drug delivery systems, such as liposomes, currently represents a major advance in the treatment and diagnosis of various diseases. Changes in the surface of these nanosystems have been focusing on research, aiming to maximize their effectiveness through the development of stealth or site-specific systems. In this work, the fucoidan, a sulfated polysaccharide, was used for coating liposomes, since it presents two important properties: the ability to not activate the complement system and of being recognized and bound by receptors found on macrophages. These two activities have encouraged us to use the fucoidan for the purpose of developing a new long-circulating liposomal system and directed to macrophages. Thus, the first stage of the study involved a synthesis, wherein the fucoidan was chemically modified by conjugating with cholesterol through a new microwave irradiation procedure. Subsequently, fucoidan-coated liposomes containing usnic acid were prepared by lipid film hydration method and varying the amounts of hydrophobized fucan. Liposomes were characterized by determining particle size (Ø), polydispersity index (PDI), surface charge (ζ) and drug encapsulation efficiency. Finally, liposomes have been evaluated in vitro study of cytotoxicity, cellular uptake and competition assay using RAW 264.7. In addition the antimycobacterial activity and interactions between the drugs were evaluated through chekerboard method against multidrug resistant strains of M. tuberculosis. The results showed that (hydrophobized fucoidan) were able to be used in the development of coated liposomes. It was observed that by varying the amount of fucoidan from 5 to 20 mg, an increase in size and PDI of the vesicles from 168 ± 2.82nm, 0.36 and 1.18 ± 0.01μm, 0.46, was found respectively. Moreover, with the increase in fucoidan concentration the ζ lower (1.35 ± 0.185 ± 0.234 -5.41 mV mV), due to its negative charges exposed to the surface of liposomes. Regarding drug encapsulation efficiency, all formulations showed greater than 98% value, indicating that the coating did not affect the encapsulation of usnic acid. In relation to cellular uptake, the results showed that the fucan coated liposomes were captured faster (15 min) as compared with uncoated liposomes (60 min), suggesting that were quickly recognized by macrophages. In addition, the results obtained in the experiments of competitive inhibitors suggested that the coated liposomes (Lipofuc5) were internalized through C-type carbohydrate recognition domain present in the scavenger receptors (SR). In studies using multidrug resistant M. tuberculosis isolates, the encapsulation of usnic acid into liposomes enhanced the antimycobacterial active both in the free and encapsulated forms. In this way, usnic acid may be candidates for improving the antimycobacterial activity of rifampicin. Given the above, fucoidan-coated liposomes containing usnic acid are an alternative approach for targeting efficiently drugs to macrophages.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología / Memoria para optar al Título de Bioquímico / El género Salmonella agrupa a más de 2500 serovares, muchos de los cuales son patógenos humanos y animales. El serovar Dublin afecta principalmente al ganado bovino pudiendo llegar a infectar a seres humanos por el consumo de alimentos contaminados. Salmonella presenta diversos mecanismos que le permiten ingresar y colonizar sistémicamente a sus hospederos. Algunos de estos mecanismos se relacionan con la capacidad de invadir el epitelio intestinal y sobrevivir al interior de las células del sistema inmune del hospedero, principalmente macrófagos. En ambos procesos los sistemas de secreción de proteínas juegan un papel fundamental. El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es el sistema de secreción más recientemente descrito en bacterias Gram negativo. Este sistema se encuentra codificado en el genoma de cerca del 25% de las bacterias secuenciadas y su importancia en las relaciones interbacterianas y en la relación bacteria-hospedero lo han convertido en un blanco de estudio de gran interés. Previamente, hemos identificado la presencia de 5 T6SS filogenéticamente distintos y distribuidos diferencialmente en representantes del género Salmonella. S. Dublin posee dos T6SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-6 y SPI-19. El objetivo de este proyecto fue determinar si los T6SS codificados en SPI-6 y SPI-19 se expresan al interior de macrófagos murinos y si cumplen un papel en los procesos de invasión y supervivencia intracelular de S. Dublin en estas células. Para esto, se evaluó la expresión intracelular y translocación de un componente fundamental del sistema (VgrG) y se compararon mutantes de los T6SS de SPI-6 y SPI-19 respecto a la cepa silvestre en su capacidad de invadir y sobrevivir en macrófagos murinos en cultivo in vitro. Para evaluar la expresión del gen vgrG y de la proteína VgrG codificada en cada uno de los T6SS presentes en el genoma de S. Dublin al interior de macrófagos, se construyeron en el cromosoma de la bacteria fusiones transcripcionales y traduccionales a la proteína fluorescente verde y se infectaron macrófagos RAW 264.7 con las cepas que contenían estas fusiones. Mediante microscopía de epifluorescencia se observó la expresión de las fusiones transcripcionales y traduccionales del componente VgrG de ambos T6SS desde tiempos tempranos de infección. Para determinar la translocación de VgrG al citoplasma de macrófagos infectados in vitro, se utilizaron fusiones traduccionales de VgrGSPI-6 y VgrGSPI-19 al reportero TEM-1 construidas en el plasmidio pFlagTEM. La translocación de cada proteína de fusión se determinó mediante un ensayo de fluorescencia acoplado a FRET. Para ello, se infectaron macrófagos RAW 264.7 con las cepas que contenían estas fusiones y posteriormente se analizaron los macrófagos infectados mediante microscopía de epifluorescencia. Se observó la translocación de VgrGSPI-19 a tiempos tempranos de infección y la translocación de VgrGSPI-6 a tiempos tardíos de infección. Sin embargo, la baja frecuencia de los eventos de translocación observados hace necesario realizar la comprobación del fenómeno mediante metodologías más sensibles. Para determinar si los T6SS codificados en el genoma de S. Dublin participan en los procesos de internalización y supervivencia de la bacteria al interior de macrófagos murinos, se realizaron ensayos de protección a gentamicina. En ellos se comparó la capacidad de ingresar y sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de la cepa silvestre y cepas mutantes de los T6SS o del componente ClpV. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que ninguno de los T6SS contribuye a la invasión y supervivencia intracelular de S. Dublin en macrófagos murinos. En conclusión, los T6SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-6 y SPI-19 de S. Dublin se expresan al interior de macrófagos murinos, pero no participan en la capacidad de la bacteria para invadir y sobrevivir al interior de éstos. / The Salmonella genus includes over 2500 serovars, many of which are human and animal pathogens. Although the serovar Dublin affects mainly livestock, it constitutes a threat to humans who consume contaminated foods. Salmonella has several mechanisms to colonize its hosts systemically. These mechanisms allow it to invade the intestinal epithelium and survive within immune cells, mainly macrophages. Of note, protein secretion systems play a central role in these processes. The Type VI Secretion System (T6SS) is the most recently described protein secretion system in Gram-negative bacteria. This secretion system is present in about 25% of all bacterial genomes and its putative role in inter-bacteria and bacteria-host relationships makes it an important target for scientific research. Previously we have identified the presence of 5 phylogenetically diverse T6SS distributed differentially in the Salmonella genus. S. Dublin carries two of these systems codified in the pathogenicity islands SPI-6 and SPI-19. The aim of this thesis was to determine if the T6SSs codified in SPI-6 and SPI-19 are expressed in and translocated to the cytosol of murine macrophages, and if they play a role in the internalization and survival of S. Dublin inside these cells. To achieve this, intracellular expression and translocation of a core component of T6SSs (VgrG) was analyzed and T6SS mutants were compared with the parental strain in their ability to invade and survive within murine macrophages in vitro. To asses the expression of the vgrG gene and VgrG protein codified in each S. Dublin T6SS within murine macrophages, transcriptional and translational fusions to the green fluorescent protein were constructed and macrophages RAW 264.7 were infected using the strains bearing these fusions. Using epifluorescence microscopy, expression was observed for the transcriptional and translational fusions of the VgrG component of both T6SSs. To determine the translocation of VgrG to the cytosol of infected macrophages in vitro, translational fusions of VgrGSPI-6 and VgrGSPI-19 to the TEM-1 reporter were constructed in plasmid pFlagTEM. Translocation of each protein was determined using a FRET-coupled fluorescence assay. To achieve this, RAW 264.7 macrophages were infected using strains bearing these fusions and subsequent analysis of the infected macrophages was carried out by epifluorescence microscopy. VgrGSPI-19 translocation was observed shortly after infection and VgrGSPI-6 translocation was observed several hours after infection. Noteworthy, due to the low frequency of the translocation events observed it is necessary to confirm this observation by means of more sensitive methods. To determine if the T6SSs codified in the S. Dublin genome play a role in the internalization and survival processes of the bacteria within murine macrophages, gentamicin protection assays where conducted. In these experiments, the ability to enter and survive in RAW 264.7 macrophages in vitro was compared between T6SS and ClpV mutant strains and the parental strain. The results of this work show that none of the T6SSs contribute to the ability of S. Dublin to invade and survive in murine macrophages. In conclusion, the T6SS encoded in pathogenicity islands SPI-6 and SPI-19 of S. Dublin are expressed in murine macrophages, but these do not play a role in the invasion or intracellular survival of the bacteria in these cells. / Fondecyt

Doctor en Bioquímica / La calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), una chaperona pleiotrópica de 47 kDa, se transloca desde el retículo endoplásmico (RE) a la zona de emergencia flagelar, donde actúa como un factor de virulencia principal, además de sus roles funcionales intracelulares. La TcCRT extracelular media la infectividad del parásito en virtud de su capacidad para interactuar con los componentes del complemento C1 y MBL. La inhibición de las vías del complemento clásica y de las lectinas también son consecuencias de estas interacciones. No se ha reportado respecto a la localización y funciones de TcCRT una vez que el parásito se encuentra en el interior de la célula hospedera. Aquí proponemos que, durante la infección por T. cruzi, y mediante el uso de anticuerpos específicos, es posible detectar TcCRT, una vez que el parásito se encuentra el interior de la célula hospedera de mamífero. También proponemos que la expresión de TcCRT en la célula hospedera se correlaciona inversamente con la expresión de antígenos MHC-I. Al abordar experimentalmente estos temas queremos contribuir al conocimiento de los términos moleculares que regulan la interacción células hospederas-T.cruzi, centrándose en el papel de TcCRT en particular, dentro de la célula hospedera infectada. Para alcanzar este objetivo apuntamos a la validación de la especificidad de los anticuerpos para ser utilizados como sondas detectoras de TcCRT, con ello identificar TcCRT interior de los macrófagos murinos infectados y, por último, evaluar las variaciones en la superficie de las moléculas de MHC- I en los macrófagos murinos infectados. Por lo tanto, específica y topográficamente se monitoreó la presencia de TcCRT en los parásitos que infectan a una línea celular de macrófagos murinos, en comparación con tripomastigotes libres y epimastigotes no infecciosos. Para ello, se probaron tres anticuerpos diferentes como sondas detectoras para procedimientos inmunocitoquímicos. Anticuerpos anti-TcCRT policlonales y monoclonales se validaron como sondas detectoras, ya que mostraron poca o nula reactividad cruzada. En inmunocitoquímica, el anticuerpo policlonal de conejo, y los anticuerpos monoclonales murinos anti-TcCRT, detectan TcCRT con diferentes sensibilidades y especificidades, cuando son revelados con inmunosondas conjugadas con oro coloidal, seguido por microscopía electrónica de transmisión. Con los anticuerpos policlonales de conejo, se observaron partículas de CRT, tanto en parásitos libres como en aquellos que se encuentran dentro del interior de células hospederas infectadas, principalmente en el núcleo y kinetoplasto del parásito. Con un anticuerpo monoclonal murino anti-TcCRT, y el uso de partículas de oro de tamaño más grande, se obtuvo una mejora drástica en la sensibilidad y especificidad para la detección TcCRT. Se detectaron moléculas de TcCRT principalmente en el kinetoplasto del tripomastigote. Proponemos que este organelo puede representar una escala para TcCRT, generada en el RE, previo a su translocación a la zona de emergencia flagelar. Esta movilización puede estar influenciada por las nuevas condiciones ambientales con las que el parásito se encuentra en el interior de la célula hospedera. Queda por determinar las consecuencias funcionales de la presencia acumulada de TcCRT en el kinetoplasto. La posibilidad de que TcCRT regule la transcripción en el ADN del kinetoplasto, según lo propuesto anteriormente para la CRT de mamífero en el núcleo, podría ser considerada, aunque la organización de ADN en el kinetoplasto es diferente. Además, TcCRT podría regular vías de transducción de señales dependientes de Ca+2. Finalmente, por mecanismos desconocidos, la infección por T. cruzi disminuye el número de células positivas MHC de clase I, tan temprano como 2 horas después de la infección. Queda por determinar si TcCRT accede al RE de la célula huésped e interfiere en el proceso de plegamiento de moléculas MHC clase I / Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT), a 47 kDa pleiotropic chaperone, besides its intracellular functional roles, is translocated from the endoplasmic reticulum (ER) to the area of flagellum emergence where it acts as a main virulence factor. Extracellular TcCRT mediates parasite infectivity by virtue of its capacity to interact with complement components C1 and MBL. Both inhibitions of the classical and lectin complement pathways are also consequences of these interactions. The localization and functions of TcCRT once the parasite is inside the host cell has not been reported. Herein we hypothesize that, during T. cruzi infection, and using specific antibodies, it is possible to detect TcCRT, once the parasite is inside the mammalian host cell. We also propose that TcCRT expression in the host cell inversely correlates with the MHC-I antigen expression. By experimentally addressing these issues we expect to contribute to the knowledge of the molecular terms governing the T. cruzi-host cell interplay, focusing on the role of TcCRT in particular inside the infected host cell. To reach this goal we will aim at validating the specificity of the antibodies to be used as TcCRT detector probes to identify TcCRT inside infected murine macrophages and, finally, to evaluate variations in surface MHC-I molecules on infected murine macrophages. Thus, we specifically and topographically monitor the TcCRT presence in parasites infecting a murine macrophage cell line, as compared to free trypomastigotes and non-infective epimastigotes. For that purpose, three different antibodies were tested as detector probes for immunocytochemical procedures. Polyclonal and monoclonal anti-TcCRT antibodies were validated as detector probes, as they showed minimal or null cross reactivity. In immunocytochemistry, polyclonal rabbit, and monoclonal murine anti- TcCRT antibodies, detected TcCRT with different sensitivities and specificities, when revealed with immune probes conjugated to colloidal gold, followed by transmission electron microscopy. With the rabbit polyclonal antibodies, CRT particles were observed, both in free parasites and infected host cells, mainly in the parasite nucleus and kinetoplast. With a murine monoclonal anti-TcCRT antibody, and using larger size gold particles, a drastic improvement in sensitivity and specificity for TcCRT detection, was obtained. TcCRT molecules were detected mainly in the trypomastigotes kinetoplast. We propose that t his organelle may represent a stopover for TcCRT, generated in the ER, previous its translocation to the area of flagellum emergence. This mobilization may be influenced by the new environmental conditions that the parasite meets inside the host cell. It remains to be determined the functional consequences of TcCRT cumulative presence in the kinetoplast. The possibility that TcCRT regulates transcription in kinetoplast DNA, as previously proposed for mammalian CRT in the nucleus, could be considered, although the DNA organization in the kinetoplast is different. Also, TcCRT may regulate Ca+2-dependent transduction signalling pathways. Finally, by unknown mechanisms, T. cruzi infection seems to decrease the number of MHC class I positive cells, as early as 2h post-infection. It remains to be determined whether TcCRT accesses to the host cell ER and interferes in the MHC class I molecule-folding process / Conicyt Fondecyt

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Orientador: Joni Augusto Cirelli / Banca: Silvana Regina Perez Orrico / Banca: Ana Paula Faloni / Resumo: Atualmente diversas pesquisas em Periodontia e Implantodontia visam estudar novos procedimentos e materiais que otimizem o processo cicatricial. O reparo envolve a proliferação de várias células que atuam sob a coordenação de proteínas chamadas fatores de crescimento e/ou citocinas, nos quais muitos estudos têm se concentrado e confirmado seu papel especial no processo de reparação. Artin M é uma lectina isolada de sementes de Artocarpus integrifólia e foi utilizado no tratamento tópico de lesões por queimadura de pele proporcionando aceleração da cicatrização, e redução da necrose. Em estudos recentes, foi demonstrado que o Artin M também estimulou a proliferação de fibroblastos e a reparação tecidual de lesões em mucosa palatina de ratos. Buscando um melhor entendimento da forma de atuação desta lectina, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do Artin M na expressão gênica e produção proteica de citocinas e fatores de crescimento envolvidos no processo de reparo tecidual. Culturas primárias de fibroblastos gengivais e macrófagos de rato foram tratadas com Artin M nas concentrações de 1 ; 2,5 e 5,0 μg/ml por 4, 8, 12 e 24 h para análise da expressão gênica através da reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa de maneira quantitativa, em tempo real (RT-qPCR) e, nas mesmas concentrações por 48 e 72h após estímulo para análise quantitativa da concentração proteica dos fatores de crescimento (VEGF e TGFβ) e das citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNFα) em sobrenadante de culturas de células por meio de kits ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). Os resultados demonstraram um estímulo significativo (p<0,05; ANOVA) na expressão gênica das citocinas IL-1 e TNFα tanto pelos macrófagos como os fibroblastos. A secreção proteica dos fibroblastos gengivais demonstrou aumento nos níveis de TGFβ, enquanto nos macrófagos houve aumento para TNFα. Os resultados... / Abstract: Currently, several studies in Periodontics and Implantology seek for new procedures and material that optimize the healing process. The healing process involves the proliferation of various cells that act under the coordination of proteins called growth factors and/or cytokines, which have been focused by many researches that have confirmed their special role in the repair process. Artin M is a lectin isolated from Artocarpus integrifolia seed and used in the topical treatment of skin burn injuries, providing accelerated healing and necrosis reduction. Recently, some studies demonstrated that Artin M also stimulates fibroblast proliferation and wound healing in rat oral mucosa. Seeking a better understanding of the lectin action, the aim of this study was to evaluate the effects of Artin M on gene expression and protein production of cytokines and growth factors involved in tissue repair. Primary cultures of rat gingival fibroblasts and macrophages were treated with Artin M at concentrations of 1, 2.5, and 5.0 μg / ml for 4, 8, 12 and 24 h for gene expression analysis by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and at the same concentrations for 48 and 72h for quantitative analysis of protein concentration of growth factors (VEGF and TGFβ ) and inflammatory cytokines ( IL-1 , IL-6 and TNFα ) in culture supernatants by ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). The results demonstrated significant (p < 0.05, ANOVA ) expression of IL-1 and TNF-α by macrophages as well as fibroblasts. In relation to the protein levels, gingival fibroblasts produced increased levels of TGFβ, while macrophages synthesized significant levels of TNF-α. The results suggest that Artin M has a role in the increasing gene and protein expression of relevant cytokines in the repair process. / Mestre

A aterosclerose é uma doença pró-inflamatória, caracterizada por disfunção endotelial e pela presença de placa de ateroma, formada pela fagocitose de oxLDL por macrófagos da região subíntima. As espécies reativas apresentam um papel importante na doença, sendo responsáveis diretos pela oxidação da LDL. Os macrófagos podem apresentar dois fenótipos, o classicamente ativado, M1 (pró-inflamatório), e o alternativamente ativado, M2 (anti-inflamatório). Entretanto, o papel desses fenótipos na aterosclerose ainda carece de um maior entendimento. Portanto, nosso objetivo foi, em um primeiro momento, revisar os dados presentes na literatura sobre oxidação de LDL e fenótipos de macrófagos em aterosclerose. Em um segundo momento, objetivamos comparar (através de estudo de bioinformática) as expressões de grupos de genes antioxidantes (HAG), de genes relacionados ao fenótipo M1 e de genes relacionados ao fenótipo M2 entre macrófagos de pessoas com aterosclerose e de pessoas saudáveis e entre placas de aterosclerose humanas em estágio avançado e em estágio inicial. Os dados de expressão foram obtidos do repositório GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), enquanto as interações funcionais foram obtidas com os programas STRING (http://string-db.org/) e Medusa (http://coot.embl.de/medusa/). As análises estatísticas foram conduzidas com o programa ViaComplex (http://lief.if.ufrgs.br/pub/biosoftwares/viacomplex/) ze com a plataforma GSEA (http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp). A expressão dos grupos de genes HAG e M1 aumentou nas placas em estágio avançado em comparação às placas em estágio inicial. A expressão dos grupos de genes HAG, M1 e M2 aumentou nos macrófagos de pessoas com aterosclerose em comparação com os macrófagos de pessoas saudáveis, mas somente o grupo de genes M1 teve sua expressão aumentada em células espumosas (foam cells) de pessoas com aterosclerose em comparação com pessoas saudáveis. Por outro lado, houve uma diminuição na expressão do grupo de genes M1 em foam cells de pessoas saudáveis em comparação com macrófagos do mesmo grupo de indivíduos. Portanto, nossos resultados sugerem que, diferente do que acontece em câncer, na aterosclerose não há uma polarização dos fenótipos de macrófagos. Na verdade, ambos estão aumentados e mais estudos são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Palavraschave: antioxidantes, aterosclerose, macrófagos, polarização, M1/M2. / Atherosclerosis is a pro-inflammatory disease, which is characterized by endothelial dysfunction and atheroma plaque formation, as a result of oxLDL phagocytosis by macrophages in subintima region. Reactive species play an important role, being involved with the LDL oxidation process. Macrophages can present two phenotypes, classically activated, M1 (pro-inflammatory), and the alternatively activated, M2 (antiinflammatory). However, the role of these phenotypes needs to be better explained. Therefore, our objective is to review the literature data about LDL oxidation and macrophage phenotypes in atherosclerosis. Thereafter, we aimed to compare, through bioinformatics study, the expression of human antioxidant genes (HAG), M1 phenotype-related genes and M2 phenotype-related genes groups between healthy people macrophages and atherosclerotic people macrophages, and between human advanced atherosclerotic plaques and human initial atherosclerotic plaques. Expression data were obtained from GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), while functional interactions were from STRING (http://string-db.org/) and Medusa (http://coot.embl.de/medusa/). The statistical analysis was conducted with ViaComplex (http://lief.if.ufrgs.br/pub/biosoftwares/viacomplex/) and GSEA (http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp). The expression of HAG e M1 groups increased in advanced plaques compared to initial plaques, while the expression of HAG, M1 e M2 groups increased in atherosclerotic people macrophages compared to healthy people macrophages. Nevertheless, only M1 group had its expression elevated in atherosclerotic people foam cells compared to healthy people foam cells. On the other hand, there was a decreased expression of M1 group in healthy people foam cells compared to the macrophages from the same individuals set. Thus, our results suggest that in atherosclerosis there is not a macrophage phenotype polarization, differently of what happens for cancer. Actually, both phenotypes are increased and more studies are needed to better elucidate the involved mechanisms. Key-words: antioxidants, atherosclerosis, macrophages, polarization, M1/M2.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / Introducción: La periodontitis apical crónica (PAC) es una patología inmunoinflamatoria de origen infeccioso que se caracteriza por la destrucción del tejido óseo periapical y está asociada a la expresión de diversos mediadores inflamatorios. MCP-3 proteína quimiotáctica de monocitos, CSF-1 factor que estimula la diferenciación de células precursoras de osteoclastos y Catepsina K, enzima asociada a la destrucción ósea, son moléculas que debido a su función podrían estar relacionadas con la osteólisis apical presente en los dientes con PAC. Por esta razón, el objetivo de este estudio fue caracterizar la expresión de CSF-1, MCP-3 y Catepsina K en quiste radicular inflamatorio (QRI), granuloma periapical (GP) y en tejido periapical sano. Materiales y Métodos: Se seleccionaron 20 individuos con diagnóstico clínico de PAC e indicación de extracción. Luego de la exodoncia, las lesiones periapicales (LPAs) fueron biopsiadas y se realizó el diagnóstico anátomopatológico. Posteriormente se realizó la tinción inmunohistoquímica, para finalmente examinar los cortes en un microscopio óptico. Resultados: De un total de 20 muestras, 5 se diagnosticaron como QRI, 7 correspondieron a GP y 7 LPA sanos. La expresión de MCP-3 se observó en QRI epitelio, endotelio e infiltrado inflamatorio; en GP su distribución fue similar, aunque no se identificó en endotelio vascular. CSF-1 se expresó en QRI a nivel del epitelio, células mesenquimales, endotelio e infiltrado inflamatorio, mientras que en GP se identificó en endotelio e infiltrado inflamatorio. Catepsina K se observó en epitelio, células mesenquimales e infiltrado inflamatorio de QRI; mientras que en GP se localizó en células mesenquimales e infiltrado inflamatorio. No se observó inmunoreactividad en tejido periapical sano. Conclusiones: MCP-3, CSF-1 y Catepsina K se expresan en forma similar en QRI y GP, mientras que no se observaron en tejido periapical sano. Nuestros resultados sugieren que existe participación de estos mediadores en la patogénesis de la PAC.

A aterosclerose é uma doença extremamente grave que leva à morte milhares de pessoas em todo o mundo. A ruptura do balanço intracelular que leva ao acúmulo de colesterol é uma das principais características observadas nas células que participam do desenvolvimento da lesão aterosclerótica. Estudos de nosso grupo mostraram que as prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a PGA2, desviam o metabolismo lipídico de macrófagos e macrófagos-foam cells reduzindo a síntese de novo de colesterol e ésteres de colesterol e induzindo a síntese de fosfolípides, no lugar dos derivados do colesterol. Além disso, as CP-PGs são potentes agentes antiinflamatórios por promoverem diretamente a inibição da ativação do fator nuclear NF-κB e, indiretamente, pela ativação das proteínas de choque térmico (HSP), o que também leva à citoproteção. O resultado combinado dessas alterações é que a PGA2 induz uma potente redução na quantidade de colesterol total em macrófagos-foam cells revertendo seu fenótipo ao de uma célula normal. Assim, e tendo em vista que a aterogênese e o acúmulo de lipídios por macrófagos está relacionado a disfunções na capacidade de regulação de síntese e exportação de lipídios, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo de ação da PGA2 sobre a atividade e expressão de enzimas que participam do metabolismo do colesterol, a saber, acil-coenzima A: colesterol acil-transferase (ACAT) e 3- hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA redutase). Foi estudada, também, a possibilidade de que o efeito desta prostaglandina pudesse dar-se pela indução de alterações no estado redox celular e expressão de proteínas relacionadas à iniciação e desenvolvimento da lesão ateromatosa em macrófagos. Verificamos que, apesar de a PGA2 inibir a atividade da ACAT em macrófagos/foam cells, o mesmo não ocorre com macrófagos normais. Contudo, a PGA2 apresenta um potente efeito inibitório sobre a atividade da HMG-CoA redutase, mas não sobre a expressão da proteína ou de seu mRNA. Os dados obtidos com a PGA2, que é um agente eletrofílico, são mimetizados e potencializados por manobras que alteram as concentrações intracelulares de glutationa (GSH) e dissulfeto de glutationa (GSSG) e confirmados pela expressão de proteínas cujos fatores de transcrição específicos são sensíveis ao estado redox, como a HSP70 (via HSF), MRP1 (via Nrf2/Keap1) e iNOS (via NF-κB). Os resultados implicam as CP-PGs como uma nova classe de agentes hipocolesterolemiantes através da modulação do estado redox celular. / Atherosclerosis is a leading cause of death in the world. Disruption of the intracellular lipid balance, which leads to cholesterol accumulation is one of the features of cells that participate of the development of atherosclerotic lesions. Evidence form our laboratory indicates that cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs), particularly PGA2, deviate lipid metabolism from the synthesis of cholesterol and cholesteryl esters to the synthesis of phospholipids in foam cell macrophages. Moreover, CP-PGs are powerful anti-inflammatory agents by directly inhibiting nuclear factor NF-κB, and indirectly through the activation of heat shock protein (HSP) pathway, which, in turn, confers cytoprotection. The combined effect of such alterations is that PGA2 dramatically reduces cholesterol contents in foam cell macrophages, thus reversing its phenotype to that of a normal cell. Hence, and since atherogenesis and lipid accumulation by macrophages are related with dysfunctions in the ability of regulating lipid synthesis and export, the aim of this study was to investigate the mechanism of action of PGA2 on the activity and expression of enzymes related to cholesterol metabolism, namely, acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase (ACAT) and 3-hidroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase). The possibility that the effects of this CP-PG were modulated by alterations in the intracellular redox status and expression of proteins related to the initiation and development of atheromatous lesions in macrophages was also investigated. We found that, although PGA2 did inhibit ACAT activity in foam cell macrophages, the same was not true for normal macrophages. However, PGA2 showed a powerful inhibitory effect of HMG-CoA reductase activity but not in the expression of both protein or mRNA. The data obtained with PGA2, which is an electrophilic agent, were mimicked and potentialized by certain maneuvers that alter intracellular glutathione (GSH) and glutathione disulphide (GSSG) contents and were confirmed by the expression of proteins whose specific transcription factors areredox-sensitive, such as HSP70 (via HSFs), MRP1 (via Nrf2/Keap1) and iNOS (via NF-κB). The results indicate CP-PGs as a new class of hypocholesterolemic drugs by virtue of their capacity to modulate intracellular redox status.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-07T17:52:23Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-02-08T16:02:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T16:02:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / CAPES / As leishmanioses se constituem um complexo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania spp. Esses parasitos infectam preferencialmente os macrófagos, podendo infectar também células dendríticas e neutrófilos. Macrófagos infectados por microrganismos intracelulares produzem vesículas extracelulares (VEs), que podem modular respostas imunes tanto in vitro quanto in vivo. Essas VEs são consideradas uma das principais vias de comunicação intercelulares, em conjunto com fatores de crescimento, citocinas, nucleotídeos, lipídios, óxido nítrico e moléculas de adesão. Foi demonstrado pelo nosso grupo que vesículas extracelulares secretadas por macrófagos infectados por L. amazonensis são capazes de estimular a produção de IL-12, IL-1β e TNF-α por macrófagos naive. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito dessas vesículas sobre a infecção leishmaniótica tanto in vitro quanto in vivo. Para isso, as vesículas extracelulares foram geradas a partir de macrófagos originados de medula óssea de camundongos BALB/c superinfectados com L. amazonensis, a confirmação da produção dessas vesículas foi obtida pela visualização das mesmas pela técnica de rastreamento de nanopartículas (NTA, do inglês). As vesículas não foram capazes de interferir na infecção por L. amazonensis in vitro, não houve diferença estatisticamente significativa no percentual de macrófagos infectados e nem no número de parasitos por célula. Em modelo murino, a utilização dessas vesículas ocasionou aumento significativo da carga parasitária em relação ao grupo controle salina sem interferir no tamanho de lesão e na produção de anticorpos anti- Leishmania. É possível que essas vesículas exerçam importante papel no processo biológico da doença, sendo responsáveis pelo agravamento da infecção. / Leishmaniases are a complex of diseases caused by parasites of the genus Leishmania spp. These parasites preferentially infect macrophages, which can also infect dendritic cells and neutrophils. Macrophages infected by intracellular microorganisms release extracellular vesicles (EVs), which can modulate immune responses in vitro and in vivo. These EVs have an important part to play in intercellular communication, together with growth factors, cytokines, nucleotides, lipids, nitric oxide and adhesion molecules. Our group showed that extracellular vesicles secreted by macrophages infected with L. amazonensis are able to induces the production of IL-12, IL-1β and TNF-α by macrophages naive. The aim of this study was to evaluate the role of these vesicles on Leishmania amazonensis infection both in vitro and in vivo. For this, the extracellular vesicles were generated from macrophages derived from bone marrow of BALB/c superinfected with L. amazonensis, confirmation of production of vesicles was obtained by nanoparticle tracking analysis. The vesicles were not able to interfere with infection by L. amazonensis in vitro, there was no statistically significant difference in the percentage of infected macrophages and in the number of parasites per cell. In a murine model, the vesicles caused a significant increase in parasite burden compared to the saline control group without interfering with the lesion size and production of anti-Leishmania antibodies. It is possible that these vesicles carry important role in the biological process of the disease, being responsible for the worsening the infection.

MAGALHÃES, L. C. C. S. Macrófagos associados ao tumor em carcinoma hepatocelular: avaliação quantitativa e correlação com aspectos clínicos e patológicos. 2010. 73 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by PPG Patologia (pgpatol@ufc.br) on 2017-07-25T13:43:41Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_lccsmagalhaes.pdf: 1034052 bytes, checksum: 425e0b093cea5b188d14c491a581fe4e (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-07-25T14:14:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_lccsmagalhaes.pdf: 1034052 bytes, checksum: 425e0b093cea5b188d14c491a581fe4e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-25T14:14:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_lccsmagalhaes.pdf: 1034052 bytes, checksum: 425e0b093cea5b188d14c491a581fe4e (MD5) Previous issue date: 2010-08-04 / The role of macrophages in tumorigenesis is complex because they can both prevent and promote tumor development. The distinct microenvironments where tumor-associated macrophages (TAMs) act include intratumoral and peritumoral areas. This study aims to evaluate the evidence of TAMs´ infiltration in the tumoral microenvironment and its correlations with clinicopathologic features and prognostic values in resected hepatocellular carcinoma (HCC) patients.Methods:TAMs´ infiltration was evaluated in paraffin-embedded tissues from 35 HCC patients through immunohistochemistry methods. Each specimen was stained with the pan-monocyte/macrophage marker CD68, and average infiltration was quantitatively evaluated and results were expressed as cells-per-five-independent-visual-field by light microscopy (magnification, 400x). Correlation between TAMs´ infiltration and clinicopathologic features, were statistically analyzed. Results:Through the evaluation of these 35 specimens of hepatocellular carcinoma (HCC) we find a higher TAMs´ infiltration in the peritumoral area, which was statistically significant (p<0,001), regarding the intratumoral area. A second important result was a negative linear correlation between the presence of intratumoral TAMs and tumor size (p = 0.03).Conclusions:The tumor diameter is a recognized clinical prognostic factor in HCC, used worldwide. The negative correlation between tumor diameter and number of intratumoral TAMs reinforces the idea that the number of TAMs within the tumor may be a limiting factor for tumor growth in the microenvironment of HCC. / O papel dos macrófagos na gênese tumoral é complexo porque eles podem prevenir ou promover o desenvolvimento do tumor. Os diferentes microambientes onde os macrófagos associados ao tumor (TAMs) agem incluem áreas peritumoral e intratumoral. Neste estudo iremos avaliar a evidência de infiltração de TAMs no microambiente tumoral e correlacionar com fatores clínicos e patológicos de prognóstico em pacientes com carcinoma hepatocelular (CHC) em tratamento por transplante hepático.Método:A infiltração de TAMs foi avaliada por imuno-histoquímica em 35 amostras de tecidos contendo carcinoma hepatocelular(CHC). Cada amostra foi corada com marcador de macrófagos CD68, a infiltração foi avaliada quantitativamente e os resultados expressos em quantidade de células por cinco campos de grande aumento ao microscópio óptico (400x). A relação entre a infiltração de TAMs e os achados clínico-patológicos foram submetidos à análise estatística.Resultados:Foram analisadas 35 amostras de carcinoma hepatocelular. Constatou-se maior infiltração de TAMs em áreas peritumorais em relação à área intratumoral (p<0,001). Um segundo resultado relevante foi uma associação linear negativa entre a presença de TAMs intratumoral e o tamanho do tumor (p=0,03).Conclusões: O tamanho do tumor é um reconhecido fator clínico de prognóstico. Foi observado, neste estudo, que a concentração de macrófagos (TAMs) intra e peritumorais é estatisticamente diferente no CHC, e que há uma correlação negativa entre o tamanho do tumor e a quantidade de TAMs intratumoral, indicando que a quantidade de TAMs no microambiente do hepatocarcinoma pode ser fator limitante para o crescimento tumoral.