Belastungsinduzierte Sehnen- und Bandschäden, besonders die der Oberflächlichen Beugesehne, sind eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen bei Sportpferden. Die intraläsionale Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine vielversprechende Therapieoption zur Reduktion der Rezidivraten dar. Der Verbleib der applizierten Zellen und ihre Wirkungsmechanismen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die Magnetresonanztomografie (MRT) ist ein hervorragendes Werkzeug zur Erkennung von Sehnengewebsabnormalitäten im distalen Gliedmaßenbereich sowie zum Verfolgen injizierter Zellen. Mit superparamagnetischen Eisenoxid-Partikeln (Spio) markierte MSC werden in der MRT als hypointense Artefakte sichtbar. Gesunde Sehnen zeigen jedoch auch ein hypointenses Signal, wodurch es nicht möglich ist, markierte Zellen von physiologischem Sehnengewebe zu unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war die magnetresonanztomografische Darstellung Spio-markierter equiner MSC in unterschiedlichen Zellzahlen in equinem physiologischen Sehnengewebe mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes. In der vorliegenden Arbeit wurden equine MSC mit Spio-Partikeln (BioPal Molday ION Rhodamine B, Inc., Worcester, USA) markiert und in präparierte Schnittinzisionen, in zuvor entnommenen Oberflächlichen Beugesehnen von Kadaverbeinen,in unterschiedlichen Zellzahlen von 106, 105, 104 MSC injiziert. Anschließend erfolgte eine magnetresonanztomografische Untersuchung der Sehnenkonstrukte jeweils in einem 90° sowie 55° Winkel zum Hauptmagnetfeld B0 in drei Magnetresonanztomografen unterschiedlicher Feldstärken (0,27 T (Tesla), 3 T, 7 T). Dabei wurden jeweils T1- und T2*- gewichtete 3D-Gradientenechosequenzen genutzt. Im Anschluss erfolgte eine histologische Validierung der magnetresonanztomografischen Ergebnisse mittels Preußischblau-, Diamino-2-Phenylindol-Färbung (DAPI) und Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T konnte eine signifikante Zunahme der Signalintensität der Oberflächlichen Beugesehne in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes (Konstruktwinkelung von 55° zum Hauptmagnetfeld B0) im Vergleich zur 90° Standardwinkelung verzeichnet werden (p < 0,05). Des Weiteren konnte die Ausprägung des Magic-Angle-Effektes im 3 T-Hochfeldsystem in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz als deutlicher beurteilt werden als im Niederfeldsystem (p < 0,05). Im 7 THochfeldsystem konnten keine signifikanten Unterschiede der Signalintensität der Oberflächlichen Beugesehne in den unterschiedlichen Sequenzen und Winkelungen der Sehnenkonstrukte zum Hauptmagnetfeld B0 gefunden werden. Die Detektion einer Zellzahl von 106 markierten MSC war sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem und sowohl in der T1- als auch in der T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes sicher möglich (p < 0,05). Darüber hinaus konnte im Hochfeld-MRT 7 T ebenfalls eine Zellzahl von 104 markierten MSC visuell detektiert werden. Des Weiteren konnte im Nieder- sowie 3 THochfeldsystem bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein höheres Kontrast-Rausch-Verhältnis der T1-gewichteten Sequenzen beider Winkeltechniken gegenüber der T2*-gewichteten Sequenzen festgestellt werden. Darüber hinaus stellte sich das Kontrast-Rausch-Verhältnis beider Sequenzen mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes höher gegenüber der Standardwinkelung von 90° zum Hauptmagnetfeld B0 dar. Außerdem konnte mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein erhöhtes Kontrast-Rausch-Verhältnis in den T1- und T2*-gewichteten Sequenzen des 3 T-Hochfeldsystems gegenüber der Standardwinkelung und des Niederfeldsystems ermittelt werden. Des Weiteren konnte in beiden Systemen eine Erhöhung des Kontrast-Rausch-Verhältnisses mit steigender Zellzahl beobachtet werden. Außerdem zeigte die T1-gewichtete Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle- Effektes sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem das höchste Kontrast-Rausch-Verhältnis. Bei der qualitativen lichtmikroskopischen Auswertung der Preußischblau-gefärbten Proben konnte in allen Zellzahlen der Nachweis Preußischblau-positiver Strukturen erbracht werden. Der Großteil dieser positiven Strukturen war innerhalb spindelförmiger Zellen lokalisiert. Darüber hinaus konnte ein signifikant höheres Volumen Preußischblau-positiver MSC bei einer Zellzahl von 106 im Vergleich zu einer Zellzahl von 104 ermittelt werden (p <0,05). Des Weiteren konnte Fluoreszenzmikroskopisch in allen markierten Proben die Präsenz Rhodamin B-positiver Zellen entlang der Schnittinzisionen nachgewiesen werden. Schlussfolgerung: Spio-markierte MSC sind in Abhängigkeit von ihrer Zellzahl im Nieder- und Hochfeld-MRT nachweisbar. Es ist eine Detektion ab einer Zellzahl von 105 im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T möglich. Des Weiteren ist die Visualisierung markierter MSC in einer Zellzahl von 104 in einem Hochfeld-MRT 7 T realisierbar. Darüber hinaus ist es mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes möglich Spio-markierte MSC in gesundem Sehnengewebe im Nieder- und Hochfeldsystem zu detektieren. Als besonders geeignet konnte aufgrund des höheren Kontrast-Rausch-Verhältnisses die T1-gewichtete Sequenz ermittelt werden. Die Technik dieser Studie kann für zukünftige in-vivo-Studien zur Biodistribution von MSC und dem longitudinalen Zelltracking im Organismus von großem Nutzen sein.:1 EINLEITUNG ................................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT .............................................................................................. 3 2.1 Anatomie und Physiologie der Sehne am Beispiel der Oberflächlichen Beugesehne des Pferdes ......................................................................................... 3 2.1.1 Makroskopische Anatomie der Oberflächlichen Beugesehne .................................. 3 2.1.2 Struktureller Aufbau und mikroskopische Anatomie ................................................ 6 2.2 Sehnenerkrankungen ............................................................................................... 7 2.2.1 Allgemeines und Definition ...................................................................................... 7 2.2.2 Pathophysiologie ..................................................................................................... 9 2.2.3 Sehnenheilung .......................................................................................................12 2.2.4 Diagnostik von Sehnenerkrankungen .....................................................................14 2.2.5 Therapie .................................................................................................................17 2.3 Multipotente Mesenchymale Stromazellen ............................................................21 2.3.1 Allgemeines ...........................................................................................................21 2.3.2 Einsatz von MSC bei Erkrankungen der equinen Oberflächlichen Beugesehne .....23 2.3.3 Wirkmechanismus ..................................................................................................24 2.3.4 Longitudinales Zelltracking .....................................................................................25 2.4 Magnetresonanztomografie ....................................................................................28 2.4.1 Allgemeines ...........................................................................................................28 2.4.2 Physikalische Prinzipien .........................................................................................28 2.4.3 Relaxation ..............................................................................................................30 2.4.4 Bildkontrast ............................................................................................................31 2.4.5 Repetitionszeit ........................................................................................................32 2.4.6 Echozeit .................................................................................................................32 2.4.7 Darstellung von Sehnen und Bändern ....................................................................33 2.4.8 Magic-Angle-Effekt .................................................................................................34 2.4.9 Suszeptibilitätsartefakte .........................................................................................35 3 ZIELSTELLUNG UND HYPOTHESEN .........................................................................38 4 MATERIAL UND METHODEN ......................................................................................39 4.1 Übersicht Versuchsaufbau......................................................................................39 4.2 Isolation der MSC ....................................................................................................39 4.3 Zellaufbereitung .......................................................................................................40 4.3.1 Expansion der MSC ...............................................................................................41 4.3.2 Markierung der MSC ..............................................................................................41 5.6 Histologie .................................................................................................................77 5.6.1 Preußischblau-Färbung ..........................................................................................77 5.6.2 Vergleich der Volumen der Preußischblau-positiven Strukturen zum Volumen der hypointensen Artefakte im MR-Bild ........................................................................79 5.6.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...................................................................................84 5.6.4 Diamino-2-Phenylindol- (DAPI) -Färbung ...............................................................85 6 DISKUSSION ................................................................................................................87 6.1 Diskussion Material und Methodik .........................................................................87 6.1.1 Equine Oberflächliche Beugesehne .......................................................................87 6.1.2 Zellmarkierung und Zellviabilität .............................................................................87 6.1.3 Magnetresonanztomografie ....................................................................................88 6.1.4 Histologie ...............................................................................................................89 6.2 Diskussion Ergebnisse ...........................................................................................90 6.2.1 Magnetresonanztomografie ....................................................................................90 6.2.2 Histologie ...............................................................................................................95 6.3 Schlussfolgerung aus den Ergebnissen ................................................................95 7 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................96 8 SUMMARY....................................................................................................................98 9 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................ 100 ANHANG ........................................................................................................................... 115 DANKSAGUNG ................................................................................................................. 120

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Background Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed malignant disease among adult males in the USA and the second leading cause of cancer deaths in men. Due to the lack of diagnostic tools that are able to differentiate highly malignant and aggressive cases from indolent tumors, overtreatment has become very common in the era of prostate specific antigen (PSA) screening. New diagnostic methods to determine biological status, malignancy, aggressiveness and extent of PCa are urgently needed. 1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H HRMAS MRS) can be used to establish PCa metabolomic profiles while preserving tissue architecture for subsequent histopathological analysis. Immunohistochemistry (IHC), as opposed to conventional histopathology methods, has the potential to provide objective, more accurate and quantitative knowledge of tissue pathology. This diagnostic- accuracy study sought to evaluate a novel approach to quantitatively identify metabolomic markers of PCa by exploring the potential of PCa immunomarkers to quantify metabolomic profiles established by 1H HRMAS MRS. Material and Methods 1H HRMAS MRS was performed on tissue samples of 51 prostate cancer patients using a 14.1 Tesla NMR spectrometer (BRUKER Biospin, Billerica, MA) with a rotor synchronized CPMG pulse sequence. Spectral intensities of 36 regions of interest were measured as integrals of curve fittings with Lorentzian-Gaussian line shapes. Immunohistochemistry (IHC) was carried out following the spectroscopy scan, using three prostate immunomarkers to identify cancerous and benign glands: P504S (Alpha-methylacyl-CoA-racemace), CK903 (high-molecular weight cytokeratin) and p63. The immunostaining quality following 1H HRMAS MRS was evaluated and compared to unscanned sections of the same sample, to verify the stability and accessibility of the proposed immunomarkers. IHC images were automatically and quantitatively evaluated, using a quantitative image analysis program (QIAP), to determine the percentage of cancerous and benign epithelia in the tissue cross- sections. The results of the program were validated by a correlation with the results of a quantitative IHC review and quantitative conventional histopathology analysis performed by an experienced pathologist. Ultimately, spectral intensities and the cancer epithelium percentage, obtained from quantitative immunohistochemistry, were correlated in order to validate PCa metabolomic markers identified by 1H HRMAS MRS. Patient outcomes and incidence of recurrence were determined by retrospective review of medical records five years after initial surgery. Categories of recurrence were correlated to spectral intensities to explore potential metabolomic markers of recurrence in the cohort. Results Immunostainings with P504S and CK903 showed excellent staining quality and accessibility following 1H HRMAS MRS, suggesting these markers to be suitable for the presented quantitative approach to determine metabolomics profiles of PCa. In contrast, the quality of p63 IHC was impaired after previously performed spectroscopy. IHC using the immunomarkers P504S and CK903 on adjacent slides was found to present a feasible quantitative diagnostic method to distinguish between benign and cancerous conditions in prostate tissue. The cancer epithelium percentage as determined by QIAP showed a significant correlation to the results of quantitative IHC analysis performed by a pathologist (p < 0.001), as well as to a quantitative conventional histopathology review (p = 0.001). The same was true for the benign epithelium percentage (p < 0.001 and p = 0.0183), validating the presented approach. Two metabolomic regions showed a significant correlation between relative spectral intensities and the cancer epithelium percentage as determined by QIAP: 3.22 ppm (p = 0.015) and 2.68 ppm (p = 0.0144). The metabolites corresponding to these regions, phosphocholine and citrate, could be identified as metabolomic markers of PCa in the present cohort. 45 patients were followed for more than 12 months. Of these, 97.8% were still alive five years after initial surgery. 11 patients (24.4%) experienced a recurrence during the follow- up time. The categories of recurrence showed a correlation to the spectral intensities of two regions, 2.33 – 2.3 ppm (p = 0.0403) and 1.28 ppm (p = 0.0144), corresponding to the metabolites phosphocreatine and lipids. Conclusion This study introduces a method that allows an observer-independent, quantitative analysis of IHC to help establish metabolomic profiles and identify metabolomic markers of PCa from spectral intensities obtained with 1H HRMAS NMR Spectroscopy. The immunomarkers P504S and CK903 have been found suitable IHC analysis following 1H HRMAS MRS. A prospective in vivo application of PCa metabolite profiles and metabolomic markers determined by the presented method could serve as highly sensitive, non- invasive diagnostic tool. This observer- independent, computer- automated, quantitative analysis could help to distinguish highly aggressive tumors from low-malignant conditions, avoid overtreatment and reduce risks and complications for cancer patients in the future. Further studies are needed to verify the identified PCa metabolomic markers and to establish clinical applicability. / Einführung Prostatakrebs ist eine häufigsten Krebserkrankungen in den USA und die zweithäufigste malignom- assoziierte Todesursache männlicher Patienten weltweit. Seit der Einführung des Prostata- spezifischen Antigen (PSA)- Screeningtests wird diese Krebsart in früheren Stadien diagnostiziert und therapiert, wodurch die Mortalitätsrate in den letzten Jahren deutlich reduziert werden konnte. Da moderne diagnostische Methoden bislang jedoch nicht ausreichend in der Lage sind, suffizient zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Varianten dieses bösartigen Krebsleidens zu unterscheiden, werden häufig auch Patienten aggressiv therapiert, deren niedriggradiges Prostatakarzinom keine klinische Relevanz gehabt hätte. Es besteht daher ein großes wissenschaftliches Interesse an der Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zur akkuraten Bestimmung von biologischem Status, Malignität, Aggressivität und Ausmaß einer Prostatakrebserkrankung. \\\\\\\"1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy\\\\\\\" (1H HRMAS MRS) ist eine vielversprechende diagnostische Methode, welche es ermöglicht, metabolomische Profile von Prostatakrebs zu erstellen, ohne die Gewebsstruktur der analysierten Proben zu zerstören. Durch anschließende histopathologische Begutachtung lassen sich die erstellten Metabolitprofile validieren und evaluieren. Im Gegensatz zu konventionellen histopathologischen Methoden können durch immunhistochemische Verfahren dabei objektivere, akkuratere und quantifizierbare histopathologische Erkenntnisse gewonnen werden. Die vorliegende Studie präsentiert einen neuentwickelten diagnostischen Ansatz zur quantitativen Bestimmung von metabolomischen Markern von Prostatakrebs, basierend auf der Durchführung von 1H HRMAS NMR Spektroskopie und quantitativer Immunhistochemie. Material und Methoden Einundfünfzig Gewebsproben von Prostatakrebspatienten wurden mittels 1H HRMAS MRS an einem 14.1 T BRUKER NMR Spektrometer unter Einsatz einer CPMG-Pulssequenz untersucht. Spektrale Intensitäten in 36 Metabolitregionen wurden gemessen. Anschließend wurden die analysierten Gewebeproben mit drei Immunfärbemarkern für sowohl malignes (P504S, Alpha-methylacyl-CoA-racemase) als auch benignes (CK903, High-molecular weight cytokeratin, und p63) Prostatagewebe angefärbt und quantitativ mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (QIAP) ausgewertet. Die Anwendbarkeit und Auswertbarkeit der genannten Immunomarker nach Spektroskopie wurde evaluiert und mit der Färbungsqualität von nicht- gescannten Schnitten verglichen. Die Resultate der automatischen Auswertung durch QIAP konnten durch einen erfahrenen Pathologen in einer quantitativen Analyse der Immunfärbungen sowie konventioneller histologischer Färbungen derselben Gewebsproben validiert werden. Die spektralen Intensitäten aus den Messungen mit 1H HRMAS MRS wurden mit den korrespondierenden Ergebnissen der quantitativen Auswertung der Immunfärbungen korreliert, um metabolomische Marker von Prostatakrebs zu identifizieren. Der klinische Verlauf und die Rezidivrate der Patienten wurden 5 Jahre nach der initialen Prostatektomie retrospektiv bestimmt. Rezidivkategorien wurden erstellt und mit den bestimmten spektralen Intensitäten korreliert, um metabolomische Marker für das Auftreten von Prostatakrebsrezidiven zu identifizieren. Ergebnisse Die Immunfärbungen mit P504S und CK903 zeigten exzellente Qualität und Auswertbarkeit nach vorheriger 1H HRMAS MRS. Beide Marker eigneten sich zur Durchführung von quantitativer Immunhistochemie an spektroskopierten Gewebeproben. Im Gegensatz dazu war die Qualität der Immunfärbungen mit p63 nach Spektroskopie vermindert. Quantitative Immunfärbungen unter Einsatz der Immunmarker P504S und CK903 stellten eine praktikable diagnostische Methode dar, um zwischen malignen und benignem Prostatagewebe zu unterscheiden. Der Anteil von bösartig verändertem Prostatagewebe, bestimmt durch QIAP, korrelierte signifikant mit den Ergebnissen der quantitativen Analyse der Immunfärbungen durch den Pathologen (p < 0.001), sowie mit der quantitativen Auswertung der konventionellen histopathologischen Färbung (p = 0.001). Ebenso ließ sich die Bestimmung des Anteils von benignem Gewebe mit QIAP zu den Ergebnissen der pathologischen Analyse korrelieren (p < 0.001 und p = 0.0183). Für zwei metabolomische Regionen konnte ein signifikante Korrelation zwischen relativen spektralen Intensitäten, bestimmt mit 1H HRMAS NMR Spektroskopie, und dem Anteil von malignem Epithelium in derselben Gewebeprobe, ermittelt durch QIAP, festgestellt werden: 3.22 ppm (p = 0.015) und 2.68 ppm (p = 0.0144). Die zu diesen Regionen korrespondierenden Metaboliten, Phosphocholin und Zitrat, konnten als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Die retrospektiven Analyse der klinischen Daten der Patienten fünf Jahre nach Prostatektomie ergab eine Überlebensrate von 97.8%. Elf dieser Patienten (24.4%) erlitten ein Rezidiv ihrer Erkrankung. Die bestimmten Rezidivkategorien korrelierten signifikant mit zwei metabolomischen Regionen (2.33 – 2.3 ppm, p = 0.0403 und 1.28 ppm, p = 0.0144), welche zu den Metaboliten Phosphokreatin und Lipiden korrespondierten. Schlussfolgerung Die vorliegende Studie präsentiert einen diagnostischen Ansatz zur objektiven und quantitativen Bestimmung metabolomischer Marker von Prostatakrebs unter Verwendung von 1H HRMAS MRS und Immunhistochemie. P504S und CK903 eignen sich als Immunmarker für quantitative Immunfärbungen nach vorheriger Durchführung von 1H HRMAS MRS. Die Metaboliten Phosphocholin und Zitrat konnten in der vorliegenden Patientenkohorte als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Eine mögliche in vivo Anwendung der gefundenen metabolomischen Marker könnte als hochsensitives, objektives und nicht- invasives diagnostisches Werkzeug der Prostatakrebsdiagnostik dienen. Der vorliegende untersucherunabhängige, automatisierte und quantitative diagnostischer Ansatz hat das Potential, zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Krebsfällen zu unterscheiden und somit unnötige Risiken und Komplikationen für Prostatakrebspatienten zu reduzieren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die identifizierten metabolomischen Marker zu verifizieren und eine klinische Anwendung zu etablieren.

L'utilisation intensive des produits phytosanitaires, en particulier les insecticides, provoque des effets indésirables sur les organismes vivants et leur environnement. Mon travail de thèse a consisté à évaluer l'effet de deux insecticides chez un insecte modèle la drosophile. Une première étude concernait l'effet d'un néonicotinoïde, l'imidaclopride. Nous avons pu montrer que l'exposition chronique à des doses sublétales de cet insecticide perturbe la fonction de reproduction chez la drosophile. D'autre part, une exposition aiguë à l'imidaclopride a mis en évidence une résistance chez les femelles d'une souche de drosophile dite ''des champs''. Deux mécanismes différents ont été mis en évidence dans la résistance à l'imidaclopride de cette souche. Le premier concerne la sous expression d'une sous-unité (D1) du récepteur nicotinique à l'acétylcholine, cible de l'imidaclopride. Le deuxième concerne l'implication des glutathion S-transférases, enzymes de détoxification, dans le métabolisme de l'imidaclopride. Ces études montrent que les insecticides peuvent avoir en plus des effets sur les insectes ravageurs, des effets néfastes sur des organismes non cibles. La deuxième étude avait pour but de modéliser chez la drosophile, l'impact d'un organochloré, la dieldrine, potentiellement impliquée dans la maladie de Parkinson chez l'homme. L'exposition à cet insecticide conduit à une dégénérescence des neurones dopaminergiques ainsi qu'une perturbation de la structure de régions particulières du cerveau. Nous avons également montré des altérations du métabolisme et l'implication de processus épigénétiques dans la neurodégénérescence induite par la dieldrine. Au cours de ce travail, nous avons pu montrer l'intérêt de nouvelles méthodes comme l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) ou le High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) dans ce type d'étude.

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In equine medicine, experience regarding MRI of chronic tendon lesions is limited, and evidence on the suitability of different sequences in 3 T high-field MRI is scarce. Therefore, macroscopically healthy and altered tendons were examined by histology and in 0.27 T low- and 3 T high-field MRI, focusing on T1-weighted (T1w) sequences to visualize chronic lesions. In high-field MRI, tendons were positioned parallel (horizontal) and perpendicular (vertical) to the magnetic field, acknowledging the possible impact of the magic angle effect. The images were evaluated qualitatively and signal intensities were measured for quantitative analysis. Qualitative evaluation was consistent with the quantitative results, yet there were differences in lesion detection between the sequences. The low-field T1w GRE sequence and high-field T1w FLASH sequence with vertically positioned tendons displayed all tendon lesions. However, the horizontally scanned high-field T1w SE sequence failed to detect chronic tendon lesions. The agreement regarding tendon signal intensities was higher between high-field sequences scanned in the same orientation (horizontal or vertical) than between the same types of sequence (SE or FLASH), demonstrating the impact of tendon positioning. Vertical scanning was superior for diagnosis of the tendon lesions, suggesting that the magic angle effect plays a major role in detecting chronic tendon disease.

Background: Circadian rhythm disturbance is commonly observed in Alzheimer's disease (AD). In mammals, these rhythms are orchestrated by the superchiasmatic nucleus (SCN). Our previous study in the Tg2576 AD mouse model suggests that inflammatory responses, most likely manifested by low GABA production, may be one of the underlying perpetrators for the changes in circadian rhythmicity and sleep disturbance in AD. However, the mechanistic connections between SCN dysfunction, GABA modulation, and inflammation in AD is not fully understood. Objective: To reveal influences of amyloid pathology in Tg2576 mouse brain on metabolism in SCN and to identify key metabolic sensors that couple SCN dysfunction with GABA modulation and inflammation. Methods: High resolution magic angle spinning (HR-MAS) NMR in conjunction with multivariate analysis was applied for metabolic profiling in SCN of control and Tg2576 female mice. Immunohistochemical analysis was used to detect neurons, astrocytes, expression of GABA transporter 1 (GAT1) and Bmal1. Results: Metabolic profiling revealed significant metabolic deficits in SCN of Tg2576 mice. Reductions in glucose, glutamate, GABA, and glutamine provide hints toward an impaired GABAergic glucose oxidation and neurotransmitter cycling in SCN of AD mice. In addition, decreased redox co-factor NADPH and glutathione support a redox disbalance. Immunohistochemical examinations showed low expression of the core clock protein, Bmal1, especially in activated astrocytes. Moreover, decreased expression of GAT1 in astrocytes indicates low GABA recycling in this cell type. Conclusion: Our results suggest that redox disbalance and compromised GABA signaling are important denominators and connectors between neuroinflammation and clock dysfunction in AD.

Strukturelle Untersuchungen mittels Lösungs-NMR Spektroskopie sind für supramolekulare Maschinen mit Molekulargewichten von mehr als 150 kDa nur beschränkt möglich. Die Festkörper-NMR mit Probenrotation im sogenannten magischen Winkel (MAS) stellt dagegen eine molekulargewichtsunabhängige Methode dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Methode entwickelt, die die MAS NMR Spektroskopie an supramolekularen Komplexen in Lösung erlaubt. Proteinlösungen bilden demnach durch MAS und dessen Ultrazentrifugationseffekt homogene Proteinsedimente aus, in denen die rotatorische Diffusion großer Proteinkomplexe überwiegend aufgehoben ist. Auf diese Weise können klassische Festkörper-NMR Methoden angewandt werden, ohne dass Präzipitations- oder Kristallisationsverfahren erforderlich sind. In Kombination mit Proteindeuterierung, Protonendetektion sowie paramagnetischer Relaxationsverstärkung ermöglichte diese neuartige Methode die Zuordnung von Rückgrat-Amidresonanzen des 20S Proteasoms mit einem Molekulargewicht von 1,1 MDa. Weiterhin wurde diese Methode zur Untersuchung des kleinen Hitzeschockproteins alpha-B-Crystallin und dessen Cu(II)-Bindungseigenschaften genutzt. Das Chaperon (600 kDa) spielt eine wesentliche Rolle in der zellulären Proteinhomeostase. Verschiedenste NMR Techniken und andere biophysikalische Methoden zeigen, dass die konservierte alpha-Crystallin-Domäne ein Cu(II)-Ion nahe der Monomer-Monomer Interaktionsfläche mit pikomolarer Affinität bindet. Die Cu(II)-induzierte Freilegung von Substrat-Interaktionsflächen und Veränderungen in der dynamischen Quartärstruktur modulieren so die oligomere Architektur und die Chaperonaktivität von alpha-B-Crystallin. Die hier erstmals beschriebene MAS NMR Spektroskopie von sedimentierten Biomolekülen legt einen wichtigen Grundstein für zukünftige Struktur- und Dynamikuntersuchungen an großen molekularen Maschinen. / Structural investigations of large biomolecules by solution-state NMR are challenging in case the molecular weight of the complex exceeds 150 kDa. Magic-angle-spinning (MAS) solid-state NMR is a powerful tool for the characterization of biomolecular systems irrespective of their molecular weight. In this work, an approach was developed, which enables the investigation of supramolecular modules by MAS NMR. Protein solutions can yield fairly homogeneous sediments due to the ultracentrifugal forces during MAS. Since rotational diffusion is impaired, typical solid-state NMR techniques can thus be applied without the need of precipitation or crystallization. This new approach in combination with protein deuteration, proton-detection and paramagnetic relaxation enhancement enabled the observation and the assignment of backbone amide resonances of a 20S proteasome assembly with a molecular weight of 1.1 MDa. Similarly, the approach was used to characterize the small heat-shock protein alpha-B-crystallin with respect to its Cu(II)-dependent chaperone activity. The chaperone (600 kDa) plays an essential role in cellular protein homeostasis. We show that the conserved alpha-crystallin core domain is the elementary Cu(II)-binding unit specifically coordinating one Cu(II) ion near to the dimer interface with picomolar binding affinity. We suggest that Cu(II)-binding unblocks potential client binding sites and alters quaternary dynamics of both the dimeric building block as well as the higher-order assemblies of alpha-B-crystallin. In summary, MAS NMR employed to biomolecules in solution is a very promising tool to explore structural and dynamic properties of large biological machines with no upper size limit.