AIMS: Macrophages (MPs) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) closely interact within the growing atherosclerotic plaque. An in vitro co-culture model was established to study how MPs modulate VSMC behaviour. METHODS AND RESULTS: MPs were exposed to fluorescence-labelled-acetylated LDL (FL-acLDL) prior to co-culture with VSMCs. Fluorescence microscopy visualized first transport of FL-acLDL within 6 h after co-culture implementation. When MPs had been fed with FL-acLDL in complex with fluorescence-labelled cholesterol (FL-Chol), these complexes were also transferred during co-culture and resulted in cholesterol positive lipid droplet formation in VSMCs. When infected with a virus coding for a fusion protein of Rab5a and fluorescent protein reporter (FP) to mark early endosomes, no co-localization between Rab5a-FP and the transported FL-acLDL within VSMCs was detected implying a mechanism independent of phagocytosis. Next, expression of lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1)-FP, marking all lysosomes in VSMCs, revealed that the FL-acLDL was located in non-acidic lysosomes. MPs infected with virus encoding for LAMP1-FP prior to co-culture demonstrated that intact fluorescence-marked lysosomes were transported into the VSMC, instead. Xenogenic cell composition (rat VSMC, human MP) and subsequent quantitative RT-PCR with rat-specific primers rendered induction of genes typical for MPs and down-regulation of the cholesterol sensitive HMG-CoA reductase. CONCLUSION: Our results demonstrate that acLDL/cholesterol-loaded lysosomes are transported from MPs into VSMCs in vitro. Lysosomal transfer results in a phenotypic alteration of the VSMC towards a foam cell-like cell. This way VSMCs may lose their plaque stabilizing properties and rather contribute to plaque destabilization and rupture.

Dynamic alterations of composition and mechanics of the extracellular matrix (ECM) are suggested to modulate cellular behavior including plasticity of macrophages (MPhs) during wound healing. In this study, engineered 3D fibrillar matrices based on naturally occurring biopolymers (collagen I, glycosaminoglycans (GAGs)) were used to mimic matrix stiffening as well as modification by sulfated and non-sulfated GAGs at different stages of wound healing. Human MPhs were found to sensitively respond to these microenvironmental cues in terms of polarization towards pro-inflammatory or wound healing phenotypes over 6 days in vitro. MPhs exhibited a wound healing phenotype in stiffer matrices as determined by protein and gene expression of relevant cytokines (IL10, IL12, TNF). Presence of sulfated and non-sulfated GAGs inhibited this polarization effect. Furthermore, control experiments on 2D matrices stressed the relevance of using stiffness-controlled 3D matrices, as MPhs showed a reciprocal polarization behavior depending on GAG presence. Hence, the results indicate a strong influence of dimensionality, stiffness, and GAG presence of the biomaterial scaffold on MPh polarization and emphasize the need for matrices closely mimicking the 3D in vivo context with a variable stiffness and GAG composition in in vitro studies.

Morbus Whipple (MW) ist eine chronische multisystemische Infektionskrankheit, die durch das Bakterium Tropheryma whipplei verursacht wird. Während asymptomatische Trägerschaften und selbst-limitierende Infektionen mit T. whipplei häufig vorkommen, ist die chronische Manifestation des MW sehr selten. Die geringe Inzidenz des MW bei ubiquitärer Verbreitung der Erreger deutet auf eine Assoziation mit prädisponierenden Faktoren bei der Entstehung der Erkrankung hin. Die zugrundeliegenden Faktoren und Mechanismen der Manifestation sind nicht ausreichend geklärt, sodass die vorliegende Arbeit die T-Zell-Reaktivität auf die Antigenpräsentation sowie die Interaktion von T. whipplei mit peripheren monozytären Zellen (PBMC) in vitro analysierte. Hierbei wiesen allogene PBMC von MW-Patienten bei produktiver Präsentation des T. whipplei GrpE Antigens über den MHC-I-Komplex einen vermehrten Anteil Perforin+ CD8+ T-Zellen auf. Die Interferon-g Produktion zeigte sich nach optimierter GrpE Präsentation mit gesunden Kontrollen vergleichbar, wodurch erstmalig nachgewiesen wurde, dass die verminderte T-Zell-Reaktion in MW-Patienten auf eine Dysfunktion im Zuge der Antigenpräsentation zurückzuführen ist. Die Infektion in vitro differenzierter Makrophagen mit vitalen T. whipplei resultierte in einer Reduktion der HLA-DR und CC-18 Expression. Stimulationen mit Bakterienlysat und -überstand induzierten keine phänotypischen Änderungen, wodurch die Hypothese einer aktiven Immunmodulation durch T. whipplei gestützt wurde. Transkriptomanalysen führten zur Identifikation von 105 Kandidaten-Gene, die die chronische Manifestation des MW bedingen könnten. Die klinische Relevanz der Gene ist in weiteren Studien zu prüfen, ebenso wie die Bedeutung CD14+ depletierter Zellen für die Pathogenese des MW. Diese gelangten im Zuge einer prospektiven Pilotstudie erstmalig in den Fokus und deuten darauf hin, dass neben Monozyten weitere Zellen in die systemische Verbreitung von T. whipplei involviert sind. / Whipple’s disease (WD) is a chronic systemic infection with the ubiquitous bacterium Tropheryma whipplei. Whereas self-limiting infections with T. whipplei occur frequently and lead to a protective immunity, a chronic manifestation of WD is rare and seems to be associated with predisposing immunological factors. These underlying factors have not yet been sufficiently understood. The present work analysed T cell reactivity against T. whipplei antigens and interaction of the pathogen with peripheral blood mononuclear cells in vitro. Upon stimulation with bacterial lysate, recombinant GrpE or Hsp70 of T. whipplei, the proportions of activated CD4+ and CD8+ T cells were significantly lower in WD-patients as compared to healthy controls. Productive presentation of GrpE antigens via the MHC-I complex resulted in an increase of perforin+ CD8+ T-cells in WD-patients. The proportion of interferon-gamma+ CD8+ T cells was comparable to healthy controls, thus demonstrating that the reduced T cell response in WD-patients is not due to a T cell defect, but to a dysfunction in antigen presentation. T. whipplei infection of in vitro differentiated macrophages significantly reduced the expression of HLA-DR and CC-18 in WD-patients and controls, whereas bacterial lysate and bacterial supernatant did not induce phenotypic changes. These findings supported the hypothesis of an active immunomodulation by T. whipplei, resulting in reduced antigen presentation and enabling intracellular persistence. Microarray based transcriptome analysis identified 105 candidate genes that may be related to the chronic manifestation of WD. Clinical relevance of these genes has to be examined in further studies, as well as the importance of CD14+ depleted cells for the pathogenesis of WD. The detection of bacterial DNA in CD14+ depleted cells in the course of a prospective pilot study indicated that, in addition to monocytes, other cells are involved in the systemic distribution of T. whipplei.

PIWI Proteine sind die zentralen Darsteller eines RNA-basierten Mechanismus, der die Mobilisierung transponierbarer Elemente im Genom unterdrückt, um genetische Stabilität zu gewährleisten. Demzufolge sind PIWI-Proteine für die langfristige Erhaltung verschiedener Stamzellpopulationen notwendig. Beispiele dafür sind verschiedene adulte somatische Stammzellen in Drosophila und die Stammzellen der Keimbahn aller bisher untersuchten Tierarten. Bei Säugetieren sind die beschriebenen Funktionen von PIWI Proteinen strikt auf die männliche Keimbahn beschränkt. Trotz Andeutungen auf eine Rolle von PIWI-Proteinen in somatischen Zellen von Säugetieren, wurde eine Funktion bisher nicht beschrieben. Ähnlich wie Stammzellen, können sich Makrophagen in verschiedenen Geweben selbst-erneuern, um ihre Populationen zu erhalten. Diese Selbsterneuerung beruht auf der geringen Expression der Transkriptionsfaktoren MafB und cMaf, was die Aktivierung eines stammzell-ähnliches Gen-Netzwerk, das die Proliferation vorantreibt. Makrophagen mit einer genetischen Deletion von MafB und cMaf (MafDKO-Makrophagen) oder Makrophagen mit natürlich niedriger Expression von MafB oder cMaf, wie z.B. alveoläre Makrophagen, weisen dementsprechend eine erweiterte Kapazität zur Selbsterneuerung auf. Wie haben festgestellt, dass eine kurze Isoform des Maus- Gens Piwil2, die wir ‚Piwito’ genannt haben, in MafDKO und alveolären Makrophagen exprimiert wird. Die Expression von Piwito ist für die normale Selbsterneuerung der untersuchten Makrophagen notwendig, wie die in vitro und in vivo Untersuchungen darlegen. Eine Abwesenheit von Piwito in alveolären Makrophagen führt zu einer Verkürzung derer Lebenspanne in Kultur. Außerdem beweisen wir, dass Piwito von MafB in nicht-proliferierenden Makrophagen gebunden und unterdrückt wird. Diese Studie ist somit der erste Bericht über eine somatische Funktion von PIWI-Proteinen in nicht transformierten Zellen von Säugetieren. / PIWI proteins are the main players of an RNA-based gene regulatory machinery that represses transposable elements in the genome to prevent their mobilization and ensure genetic stability. PIWI proteins have thus highly conserved stem-cell functions. They are indispensable for the long-term maintenance of the somatic stem cells that drive regeneration in invertebrates, of various adult somatic stem cells in Drosophila and, most prominently, of the germline of all species studied so far. In mammals, their described functions are strictly restricted to the male germline. Despite suggestive observations for a role of PIWI proteins in the mammalian soma, robust evidence remains absent. Similar to stem cells, tissue macrophages can locally self-renew to maintain their populations. Mechanistically, their self-renewal relies on low expression of the macrophage transcription factors MafB and cMaf, since it allows the induction of a stem cell-like network of genes that drives proliferation. Macrophages with a genetic deletion of MafB and cMaf (MafDKO macrophages) acquire therefore the capacity to self-renew, defined by an indefinite growth in culture that does not comprise their identity and does not involve cancerogenic transformation. Similarly, macrophages with naturally low levels of MafB or cMaf, such as alveolar macrophages, display an extended self-renewal capacity in vivo and in vitro. We have found that a short isoform of the murine Piwil2 gene, that we named ‘Piwito’, is expressed in MafDKO and alveolar macrophages. Piwito expression is necessary for the unaltered self-renewal of macrophages, as shown by in vitro and in vivo assays. To highlight is the fact that Piwito deficiency limits the extended lifespan of alveolar macrophages in culture. Additionally, we show that Piwito is bound and repressed by MafB in quiescent macrophages. This study thus represents the first report of a somatic function for mammalian PIWI proteins in non-transformed cells.

No description available.

No description available.

Die Leber nimmt als Hauptzielorgan des metastasierenden Kolorektalkarzinoms (CRC) eine exponierte Rolle ein; bei mehr als 50 % der betroffenen Patienten werden im Laufe ihrer Tumorerkrankung Lebermetastasen diagnostiziert, die trotz multimodaler Therapiekonzepte immer noch den fatalen Kranksheitsverlauf bestimmen. Zwecks Entwicklung neuer Therapiestrategien ist ein fundiertes Verständnis der Entstehungsmechanismen und des Genexpressionsprofils der Metastasen erforderlich. Makrophagen wird in diesem Kontext ein großer Einfluss auf die Tumorentstehung und -progression zugeschrieben, weshalb von einer klinischen Relevanz der Makrophagenpolarisation auszugehen ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit der CRC Zelllinie CMT-93 ein syngenes, orthotopes Lebermetastasenmodell in C57BL/6N Mäusen etabliert. Basierend auf RNA Sequenzierungsdaten und bioinformatischen Analysemethoden wurde eine Entwicklung und fein abgestimmte Adaptation der CMT-93 Zellen im Zuge ihrer Propagation im hepatischen Milieu nachgewiesen. Diese resultierte in divergierenden Genexpressionsprofilen zwischen Zelllinie und Metastasen. Von insgesamt 3329 differentiell exprimierten Genen wurden mittels einer Selektionsliste 32 signifikant exprimierte Gene identifiziert. Insbesondere Matrix-Metalloproteasen (MMP-2, -7, -9), Chemokinrezeptoren (CXCR2, CXCR4), Zelladhäsionsgene (ITGA6, ITGB3) sowie Wif1 als Feinregulator des kanonischen Wnt Signalweges nehmen eine bedeutende Rolle ein und tragen zum Invasions- und Metastasierungsprofil von CMT-93 Zellen unter dem Einfluss des Lebermilieus bei. Invasive und aggressive Eigenschaften der CMT-93 induzierten Lebermetastasen wurden insbesondere im frühen und späten Metastasierungsstadium nachgewiesen. Hier wurde u.a. die Expression der EMT Marker Vimentin, MMP-7 und CD44, Ki-67, NFkb1 und Stat3 untersucht. Eine Gene Ontology Analyse und RNA Sequenzierungsdaten verschiedener Leberareale zeigten, dass die vielschichtige Interaktion zwischen CMT-93 Zellen und der hepatischen Mikroumgebung u.a. durch immunregulatorische Prozesse gesteuert wird, die in veränderten Genexpressionsprofilen zwischen Zelllinie, Metastase und tumorumgebendem Gewebe resultiert. In Lebermetastasen konnte eine Mischpopulation aus M1 und M2 Makrophagen nachgewiesen werden, die einen tendenziell M2 geprägten Charakter aufweisen. Dieser ist höchstwahrscheinlich an einer Stimulation der invasiven Eigenschaften der Tumorzellen beteiligt. Durch qRT-PCR und immunhistochemische Analysen konnten Hinweise gesammelt werden, dass nicht explizit die Quantität oder spezifische Lokalisation von Makrophagenphänotypen, sondern mutmaßlich eher das Zytokinprofil des Tumors und der Mikroumgebung und damit einhergehend der Polarisationsstatus der Makrophagen zum Metastasierungserfolg beiträgt. Eine Inkubation von CMT-93 Zellen mit konditionierten Medien der verschiedenen Makrophagenphänotypen bestätigte die Rolle sezernierter Faktoren. Eine indirekte Interaktion zwischen Tumorzelle und M2 Makrophagen reicht offensichtlich aus, um tumorstimulierende Eigenschaften, Aggressivität und Proliferationsfähigkeit der Zelllinie zu beeinflussen. Somit wurden Gene und Signalwege identifiziert, die relevant sind für eine erfolgreiche Induktion und Progression von Lebermetastasen infolge der Implantation von CRC-Zellen. Eine Adaptation des Genexpressionsprofils der CMT-93 Zelllinie im Zuge der Leberkolonisation konnte nachgewiesen werden. Das molekulare Profil bzw. die Gensignatur der Metastasen korrelierte dabei in hohem Maße mit der Migrations- und Invasionsfähigkeit der Tumorzellen. Insbesondere die Anwendung bioinformatischer Methoden erwies sich dabei als nützliches Werkzeug zur Analyse von großen Datensätzen, die mittels RNA Sequenzierung generiert wurden. Diese werden nun zur Formulierung prädiktiver Modelle der Metastasierungsvorgänge genutzt, um deregulierte Gene und damit einhergehend die Aggressivität von Tumorzellen gezielt identifizieren und konsekutiv beeinflussen zu können. Eine Analyse der Makrophagenphänotypen und ihrer Interaktion mit Tumorzellen verdeutlichte den durchaus tumorstimulierend geprägten Charakter der CMT-93 induzierten Lebermetastasen und den Einfluss des Zytokinprofils auf die Tumorprogression. Eine weiterführende Untersuchung der Makrophagenpolarisation bedarf jedoch eine rigorose Charakterisierung der Phänotypen anhand weiterer spezifischer Marker. Die subtile Analyse wird Rückschlüsse der organspezifischen Einflüsse des Zytokinprofils auf die kolorektale Karzinogenese erlauben.

EINLEITUNG Das maligne Melanom stellt aufgrund seiner frühen Metastasierung und der Resistenz gegenüber den bisher bekannten Therapieansätzen eine der aggressivsten Tumorentitäten dar. Allerdings handelt es sich beim Melanom um einen antigenen und immunogenen Tumor. Dies schürt die Hoffnung, dass durch das bessere Verständnis der Mechanismen, die der Metastasierung, aber auch der Dysregulation des Immunsystems zugrunde liegen, Rückschlüsse auf neue Therapieansätze, beispielsweise unter Einbeziehung der Immunabwehr, gezogen werden können. Darüber hinaus würde die Entwicklung von Radiotracern, die eine frühzeitige Diagnose und möglicherweise auch die Auswahl von Patienten für eine personalisierte Tumortherapie ermöglichen, die Heilungschancen des malignen Melanoms wesentlich verbessern. Das Eph-Ephrin-System wiederum stellt ein vielfältiges Zellkommunikations-System dar, das sowohl in lebenswichtige als auch in pathologische Prozesse involviert ist. Beispielsweise nehmen Eph-Rezeptoren und Ephrine Einfluss auf die gerichtete Bewegung von neuronalen, endothelialen und inflammatorischen Zellen. Zudem beeinflussen sie die Bewegung von Tumorzellen und tragen so zur Tumorprogression bei. Ausgehend von diesem Hintergrund wurde die Hypothese formuliert, dass die Eph-Ephrin-vermittelte Interaktion von Melanomzellen und Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms beeinflusst. Im Speziellen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob der Rezeptor EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, aber über eine mutierte und damit funktionsunfähige Kinasedomäne verfügt, eine regulative Rolle übernimmt und antitumorigen wirkt. Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Bedeutung von EphB4, EphB6 und EphrinB2 beim malignen Melanom sollten zudem verschiedene Ansätze zur Bildgebung der oben genannten Eph-Rezeptoren und Ephrine mittels PET etabliert und geprüft werden. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass die Membranproteine EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei den ausgewählten humanen Melanomzellen und den inflammatorischen Zellen exprimiert werden und somit potentielle Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen darstellen. Infolge der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen, die als Modell für Tumor-assoziierte Makrophagen dienten, kam es zu einer verminderten Adhäsion und/oder Migration der Melanomzellen sowie im Falle der A375- und A2058-Melanomzellen zu einer verstärkten Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6. Aufgrund der breiten Wirkung von IL-6 ergeben sich daraus vielfältige Einflussmöglichkeiten auf das Tumormikromilieu. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht näher charakterisiert, da erste Ergebnisse eine Beteiligung des Eph-Ephrin-Systems ausschlossen. Während die Überexpression von EphB6 keinen Einfluss auf die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften der A375-Melanomzellen hatte, führte die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 zu einer verminderten Migration der Zellen im intakten Zellverband. Des Weiteren bewirkte EphB4 eine verstärkte Adhäsion der A375-Zellen an das Extrazellularmatrix-Protein Fibronektin, wodurch die Migration dieser Melanomzellen, im Sinne einer Metastasierung, zusätzlich beeinträchtigt wird. Die erhöhte mRNA-Expression des Liganden EphrinB2 in den A375-Melanomzellen führte zu einer verminderten chemotaktischen Migration der Zellen. Um den Einfluss von EphB4 auf die Tumorprogression und Tumorangiogenese beim malignen Melanom in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein murines Xenograft-Modell mit subkutanen A375 pIRES- bzw. A375 EphB4-Tumoren etabliert. Die Auswertung der Tumorvolumina sowie der [18F]FDG-, [18F]FMISO- und Hoechst 33342-Anreicherung in den Tumoren ergab, dass die erhöhte EphB4-Proteinbiosynthese zu tendenziell kleineren Tumoren führte. Diese waren zudem signifikant schwächer perfundiert und wiesen im Inneren größere hypoxische Areale auf als die A375 pIRES-Tumoren. Somit zeigte EphB4 neben seiner antimetastasischen Wirkung in vitro auch eine antitumorigene Wirkung in vivo, wobei letztere möglicherweise auf eine Störung der Gefäßbildung zurückzuführen ist. Da eine adäquate Blutversorgung der Tumoren für die Metastasierung von Tumorzellen von Bedeutung ist, könnte dies auch auf eine antimetastatische Wirkung in vivo hinweisen. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuer, 18F-markierter EphB4 Kinaseinhibitor (Verbindung [18F]2) getestet. Dieser zeigte im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell eine geringe Tumoranreicherung, die von der EphB4-Proteinbiosynthese in den Tumoren unabhängig war. Darüber hinaus kam es zur schnellen hepatobiliären Ausscheidung von Verbindung [18F]2, was deren radiopharmazeutischer Anwendung im Wege steht. SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Insbesondere die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 hatte im Falle der untersuchten A375-Melanomzellen zu einer verminderten Migration und zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen geführt. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass EphB4 die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Darüber hinaus deuteten Untersuchungen am A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell auf eine antitumorigene Wirkung des EphB4-Rezeptors in vivo hin. Aufgrund dessen muss der anfänglich formulierten Hypothese, dass EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert, widersprochen werden. Eine regulative Beteiligung des Kinase-defizienten Rezeptors EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings ergeben sich aufgrund der Expression der Rezeptoren EphB4 und EphB6 sowie deren Ligand EphrinB2 sowohl auf den untersuchten Melanomzellen als auch auf den verschiedenen Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen interessante Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen. Deren Einfluss auf die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell ermöglicht die In vivo-Charakterisierung von Radiotracer, die gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen im Allgemeinen oder aber selektiv gegen EphB4 gerichtet sind. Da Verbindung [18F]2 eine ungünstige Pharmakokinetik zeigte, was wahrscheinlich auf die hohe Lipophilie des Radiotracers zurückzuführen ist, sollten sich zukünftige Untersuchungen mit der chemischen Modifikation dieser Verbindung beschäftigen, mit dem Ziel die Lipophilie und damit die biologische Halbwertszeit des Radiotracers zu verbessern. Zusätzlich sollte die Entwicklung von Radiotracern auf der Basis von löslichen Eph-Rezeptoren und Ephrinen (sEph bzw. sEphrin) weiter vorangetrieben werden.

No description available.

No description available.