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Die Interaktion zwischen Tumorzellen und Stromazellen spielt eine wichtige Rolle für die lokale Tumorprogression, die Invasivität und Metastasierung von soliden Tumoren wie dem Mammakarzinom. Es ist bekannt, dass die Kokultivierung von MCF-7 Mammakarzinomzellen mit humanen Makrophagen zu einer Wnt5a abhängigen Invasivitätssteigerung der Mammkarzinomzellen führt, welche durch den Wnt-Antagonisten Dkk-1 verhindert werden kann. Unbekannt war, ob sich primär hoch invasive Mammakarzinomzellen wie etwa die tripe-negative (TN) Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 und die schwach invasive Zelllinie MCF-7 hinsichtlich ihrer Expression von Wnt- und Wnt-abhängigen Genen unterscheiden. So zeigten sich sowohl die nicht-kanonischen Wnt-Liganden Wnt5a und Wnt5b als auch die Wnt-assoziierten Gene VEGF-A und PLAU-R in der MDA-MB-231 Zelllinie als deutlich höher exprimiert im Vergleich zu MCF-7. Insbesondere die Expressionsunterschiede von Wnt5a und Wnt5b waren zuvor unbekannt und erweitern die molekulare Charakteristik dieser Zelllinien. In Kokulturexperimten von MCF-7 Mammakarzinomzellen und humanen Makrophagen zeigte sich in dieser Arbeit eine signifkant höhere Expression von Wnt5a, VEGF-A und TNF-α in MCF-7 nach 24h. Dies ist ein weiterer Aspekt für die molekularen Mechanismen, welche zu einer Invasivitätssteigerung solider Tumore durch Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM) führen können. Interessanterweise blieb diese Regulation unter Zugabe von rh Dkk-1 aus, was eine wichtige Rolle von Dkk-1 möglicherweise auch aus therapeutischer Sicht nahelegt.

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Background: Tumor-associated macrophages (TAMs) promote tumor progression and have an effect on survival in human cancer. However, little is known regarding their influence on tumor progression and prognosis in human hilar cholangiocarcinoma. Methods: We analyzed surgically resected tumor specimens of hilar cholangiocarcinoma (n = 47) for distribution and localization of TAMs, as defined by expression of CD68. Abundance of TAMs was correlated with clinicopathologic characteristics, tumor recurrence and patients’ survival. Statistical analysis was performed using SPSS software. Results: Patients with high density of TAMs in tumor invasive front (TIF) showed significantly higher local and overall tumor recurrence (both ρ < 0.05). Furthermore, high density of TAMs was associated with decreased overall (one-year 83.6 % vs. 75.1 %; three-year 61.3 % vs. 42.4 %; both ρ < 0.05) and recurrence-free survival (one-year 93.9 % vs. 57.4 %; three-year 59.8 % vs. 26.2 %; both ρ < 0.05). TAMs in TIF and tumor recurrence, were confirmed as the only independent prognostic variables in the multivariate survival analysis (all ρ < 0.05). Conclusions: Overall survival and recurrence free survival of patients with hilar cholangiocarcinoma significantly improved in patients with low levels of TAMs in the area of TIF, when compared to those with a high density of TAMs. These observations suggest their utilization as valuable prognostic markers in routine histopathologic evaluation, and might indicate future therapeutic approaches by targeting TAMs.

AIMS: Macrophages (MPs) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) closely interact within the growing atherosclerotic plaque. An in vitro co-culture model was established to study how MPs modulate VSMC behaviour. METHODS AND RESULTS: MPs were exposed to fluorescence-labelled-acetylated LDL (FL-acLDL) prior to co-culture with VSMCs. Fluorescence microscopy visualized first transport of FL-acLDL within 6 h after co-culture implementation. When MPs had been fed with FL-acLDL in complex with fluorescence-labelled cholesterol (FL-Chol), these complexes were also transferred during co-culture and resulted in cholesterol positive lipid droplet formation in VSMCs. When infected with a virus coding for a fusion protein of Rab5a and fluorescent protein reporter (FP) to mark early endosomes, no co-localization between Rab5a-FP and the transported FL-acLDL within VSMCs was detected implying a mechanism independent of phagocytosis. Next, expression of lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1)-FP, marking all lysosomes in VSMCs, revealed that the FL-acLDL was located in non-acidic lysosomes. MPs infected with virus encoding for LAMP1-FP prior to co-culture demonstrated that intact fluorescence-marked lysosomes were transported into the VSMC, instead. Xenogenic cell composition (rat VSMC, human MP) and subsequent quantitative RT-PCR with rat-specific primers rendered induction of genes typical for MPs and down-regulation of the cholesterol sensitive HMG-CoA reductase. CONCLUSION: Our results demonstrate that acLDL/cholesterol-loaded lysosomes are transported from MPs into VSMCs in vitro. Lysosomal transfer results in a phenotypic alteration of the VSMC towards a foam cell-like cell. This way VSMCs may lose their plaque stabilizing properties and rather contribute to plaque destabilization and rupture.

EINLEITUNG Das maligne Melanom stellt aufgrund seiner frühen Metastasierung und der Resistenz gegenüber den bisher bekannten Therapieansätzen eine der aggressivsten Tumorentitäten dar. Allerdings handelt es sich beim Melanom um einen antigenen und immunogenen Tumor. Dies schürt die Hoffnung, dass durch das bessere Verständnis der Mechanismen, die der Metastasierung, aber auch der Dysregulation des Immunsystems zugrunde liegen, Rückschlüsse auf neue Therapieansätze, beispielsweise unter Einbeziehung der Immunabwehr, gezogen werden können. Darüber hinaus würde die Entwicklung von Radiotracern, die eine frühzeitige Diagnose und möglicherweise auch die Auswahl von Patienten für eine personalisierte Tumortherapie ermöglichen, die Heilungschancen des malignen Melanoms wesentlich verbessern. Das Eph-Ephrin-System wiederum stellt ein vielfältiges Zellkommunikations-System dar, das sowohl in lebenswichtige als auch in pathologische Prozesse involviert ist. Beispielsweise nehmen Eph-Rezeptoren und Ephrine Einfluss auf die gerichtete Bewegung von neuronalen, endothelialen und inflammatorischen Zellen. Zudem beeinflussen sie die Bewegung von Tumorzellen und tragen so zur Tumorprogression bei. Ausgehend von diesem Hintergrund wurde die Hypothese formuliert, dass die Eph-Ephrin-vermittelte Interaktion von Melanomzellen und Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms beeinflusst. Im Speziellen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob der Rezeptor EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, aber über eine mutierte und damit funktionsunfähige Kinasedomäne verfügt, eine regulative Rolle übernimmt und antitumorigen wirkt. Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Bedeutung von EphB4, EphB6 und EphrinB2 beim malignen Melanom sollten zudem verschiedene Ansätze zur Bildgebung der oben genannten Eph-Rezeptoren und Ephrine mittels PET etabliert und geprüft werden. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass die Membranproteine EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei den ausgewählten humanen Melanomzellen und den inflammatorischen Zellen exprimiert werden und somit potentielle Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen darstellen. Infolge der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen, die als Modell für Tumor-assoziierte Makrophagen dienten, kam es zu einer verminderten Adhäsion und/oder Migration der Melanomzellen sowie im Falle der A375- und A2058-Melanomzellen zu einer verstärkten Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6. Aufgrund der breiten Wirkung von IL-6 ergeben sich daraus vielfältige Einflussmöglichkeiten auf das Tumormikromilieu. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht näher charakterisiert, da erste Ergebnisse eine Beteiligung des Eph-Ephrin-Systems ausschlossen. Während die Überexpression von EphB6 keinen Einfluss auf die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften der A375-Melanomzellen hatte, führte die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 zu einer verminderten Migration der Zellen im intakten Zellverband. Des Weiteren bewirkte EphB4 eine verstärkte Adhäsion der A375-Zellen an das Extrazellularmatrix-Protein Fibronektin, wodurch die Migration dieser Melanomzellen, im Sinne einer Metastasierung, zusätzlich beeinträchtigt wird. Die erhöhte mRNA-Expression des Liganden EphrinB2 in den A375-Melanomzellen führte zu einer verminderten chemotaktischen Migration der Zellen. Um den Einfluss von EphB4 auf die Tumorprogression und Tumorangiogenese beim malignen Melanom in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein murines Xenograft-Modell mit subkutanen A375 pIRES- bzw. A375 EphB4-Tumoren etabliert. Die Auswertung der Tumorvolumina sowie der [18F]FDG-, [18F]FMISO- und Hoechst 33342-Anreicherung in den Tumoren ergab, dass die erhöhte EphB4-Proteinbiosynthese zu tendenziell kleineren Tumoren führte. Diese waren zudem signifikant schwächer perfundiert und wiesen im Inneren größere hypoxische Areale auf als die A375 pIRES-Tumoren. Somit zeigte EphB4 neben seiner antimetastasischen Wirkung in vitro auch eine antitumorigene Wirkung in vivo, wobei letztere möglicherweise auf eine Störung der Gefäßbildung zurückzuführen ist. Da eine adäquate Blutversorgung der Tumoren für die Metastasierung von Tumorzellen von Bedeutung ist, könnte dies auch auf eine antimetastatische Wirkung in vivo hinweisen. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuer, 18F-markierter EphB4 Kinaseinhibitor (Verbindung [18F]2) getestet. Dieser zeigte im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell eine geringe Tumoranreicherung, die von der EphB4-Proteinbiosynthese in den Tumoren unabhängig war. Darüber hinaus kam es zur schnellen hepatobiliären Ausscheidung von Verbindung [18F]2, was deren radiopharmazeutischer Anwendung im Wege steht. SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Insbesondere die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 hatte im Falle der untersuchten A375-Melanomzellen zu einer verminderten Migration und zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen geführt. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass EphB4 die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Darüber hinaus deuteten Untersuchungen am A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell auf eine antitumorigene Wirkung des EphB4-Rezeptors in vivo hin. Aufgrund dessen muss der anfänglich formulierten Hypothese, dass EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert, widersprochen werden. Eine regulative Beteiligung des Kinase-defizienten Rezeptors EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings ergeben sich aufgrund der Expression der Rezeptoren EphB4 und EphB6 sowie deren Ligand EphrinB2 sowohl auf den untersuchten Melanomzellen als auch auf den verschiedenen Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen interessante Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen. Deren Einfluss auf die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell ermöglicht die In vivo-Charakterisierung von Radiotracer, die gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen im Allgemeinen oder aber selektiv gegen EphB4 gerichtet sind. Da Verbindung [18F]2 eine ungünstige Pharmakokinetik zeigte, was wahrscheinlich auf die hohe Lipophilie des Radiotracers zurückzuführen ist, sollten sich zukünftige Untersuchungen mit der chemischen Modifikation dieser Verbindung beschäftigen, mit dem Ziel die Lipophilie und damit die biologische Halbwertszeit des Radiotracers zu verbessern. Zusätzlich sollte die Entwicklung von Radiotracern auf der Basis von löslichen Eph-Rezeptoren und Ephrinen (sEph bzw. sEphrin) weiter vorangetrieben werden.:1 EINLEITUNG 1.1 Die Bedeutung des Tumor-Mikromilieus bei der Entstehung des malignen Melanoms 1.2 Die Metastasierung des malignen Melanoms als limitierender Einflussfaktor auf die Tumortherapie 1.3 Die Rolle des Eph-Ephrin-Systems bei der Tumorprogression und Metastasierung 1.4 Zielstellung 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Eukaryotische Zellen 2.1.2 Prokaryotische Zellen 2.1.3 Versuchstiere 2.1.4 Plasmide 2.1.5 Kits 2.1.6 Antikörper 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 2.1.8 Chemikalien, Medien und Enzyme 2.1.9 Puffer und Lösungen 2.1.10 Geräte 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 RNA-Isolierung aus Zellen 2.2.2 DNase-Behandlung 2.2.3 Quantitative Echtzeit RT-PCR (qRT-PCR) 2.2.4 Klonierung von humanem EphB4, EphB6 und EphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pIRES2-AcGFP1 2.2.4.1 Prinzip 2.2.4.2 Restriktionshydrolyse 2.2.4.3 Dephosphorylierung und Glättung der cDNA mittels Alkalischer Phosphatase und Klenow-Fragment 2.2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 2.2.4.5 Gelextraktion 2.2.4.6 Ligation 2.2.4.7 Herstellung Transformations-kompetenter E. coli 2.2.4.8 Transformation kompetenter E. coli 2.2.4.9 Plasmid-Isolierung 2.2.5 Klonierung von humanem sEphB4, sEphB6 und sEphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pSecTag2B 2.2.5.1 Prinzip 2.2.5.2 PCR zur Gewinnung der cDNA für sEphrinB2, sEphB4 und sEphB6 2.2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 2.2.5.4 TOPO-TA-Klonierung, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.2.5.5 Restriktionshydrolyse, Ligation, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.3 Zellbiologische Methoden 2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 2.3.2 Kontrolle von Zellkulturen auf Mykoplasmen-Kontamination 2.3.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen 2.3.4 Transfektion und Antibiotikaselektion von COS-7-Zellen 2.3.5 Transfektion und Antibiotika-Selektion von A375-Zellen 2.3.6 Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse und -sortierung (FACS) von transfizierten A375-Zellen 2.3.7 Fluoreszenzmikroskopie von transfizierten A375-Zellen 2.3.8 Bestimmung der Zellproliferation und Zellvitalität mittels Wachstumskurve 2.3.9 Differenzierung humaner THP-1-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen Zellen (THP-1(M)) 2.3.10 Differenzierung humaner HL-60-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen (HL-60(M)) und Granulozyten-artigen (HL-60(G)) Zellen 2.3.11 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) und anschließende Trennung mittels Magnet-aktivierter Zell Separierung (MACS) 2.3.12 Adhäsionsassay 2.3.12.1 Adhäsion an Fibronektin 2.3.12.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 2.3.13 Migrationsassay 2.3.13.1 Boyden-Kammer-Assay 2.3.13.2 Wundheilungsassay 2.4 Proteinbiochemische Methoden 2.4.1 Proteinisolierung aus Zellkulturen 2.4.2 Proteinisolierung aus Gewebeproben 2.4.3 Proteinbestimmung 2.4.4 SDS-PAGE 2.4.5 Western Blotting und Immundetektion 2.4.6 Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) 2.4.6.1 IL-6-ELISA 2.4.6.2 pEphB4-ELISA 2.4.7 Gewinnung und Reinigung der rekombinanten, löslichen Eph Rezeptoren sEphB4 und sEphB6 2.4.7.1 Gewinnung von COS-7-Zellkulturüberständen 2.4.7.2 Reinigung von sEphB4 und sEphB6 aus den COS-7-Zellkulturüberständen mittels Ni2+-Affinitätschromatographie 2.4.7.3 Regeneration der Ni2+-NTA-Agarose 2.4.7.4 Entfernung von Salzen und Imidazol mittels Schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) 2.4.7.5 Entfernung von Salzen und Imidazol mit Hilfe von Zentrifugalkonzentratoren 2.4.7.6 Gefriertrocknung 2.5 Tierexperimentelle Arbeiten 2.5.1 Etablierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 2.5.2 Fluoreszenz-Bildgebung 2.5.3 Magnet-Resonanz-Tomographie 2.5.4 Untersuchung der Tumorperfusion mittels Hoechst 33342 2.6 Radiochemische und Radiopharmakologische Methoden 2.6.1 Darstellung und Radiomarkierung von EphB4-Kinaseinhibitoren 2.6.2 Untersuchung des Einflusses der Verbindungen 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität mittels MTT-Test 2.6.3 Untersuchung der zellulären Bindung und Aufnahme der Verbindung [18F]2 2.6.4 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 2.6.5 Bioverteilung 2.6.6 Metabolitenanalyse 2.6.7 Autoradiographie 2.7 Histologische Methoden 2.7.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 2.7.2 Nachweis von Hoechst 33342 in Gefrierschnitten 2.7.3 Anfertigung von Paraffinschnitten 2.7.4 Nachweis von EphB4 in Paraffinschnitten 2.8 Statistische Auswertung 3 ERGEBNISSE 3.1 Genexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.2 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.3 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) 3.3.1 Etablierung eines Kokultur-Modells mit anschließender Trennung der humanen Melanomzellen von den HL 60(M)-Zellen 3.3.2 Einfluss der Kokultur auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der humanen Melanomzellen 3.3.2.1 Adhäsionsassay 3.3.2.2 Migrationsassay 3.3.3 Einfluss der Kokultur auf die Sekretion von Interleukin-6 durch die humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.4 Überexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei A375 Melanomzellen 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie und FACS 3.4.2 mRNA-Expression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.3 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.4 Proliferationsverhalten 3.5 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten von A375-Melanomzellen 3.5.1 Einfluss auf die Adhäsion 3.5.1.1 Adhäsion an Fibronektin 3.5.1.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 3.5.2 Einfluss auf die Migration 3.5.2.1 Boyden-Kammer-Assay 3.5.2.2 Wundheilungsassay 3.5.3 Einfluss der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der A375-Melanomzellen 3.6 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das inflammatorische Potential von A375-Melanomzellen und HL 60(M)-Zellen 3.7 Charakterisierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 3.7.1 Charakterisierung des Tumorwachstums 3.7.2 Nachweis der EphB4-Proteinbiosynthese 3.7.3 Charakterisierung des Tumormetabolismus und der Tumorperfusion mit [18F]FDG 3.7.4 Charakterisierung der Tumorperfusion mit Hoechst 33342 3.7.5 Charakterisierung der CD31-Proteinbiosynthese 3.7.6 Charakterisierung hypoxischer Areale mit [18F]FMISO 3.8 Charakterisierung eines neuen, 18F-radiomarkierten EphB4-Kinaseinhibitors als Radiotracer zur Bildgebung von EphB4 mittels Kleintier-PET 3.8.1 Einfluss von Verbindung 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität 3.8.2 Einfluss von Verbindung 2 auf die EphB4-Phosphorylierung 3.8.3 Charakterisierung der Zellaufnahme von Verbindung [18F]2 3.8.4 Charakterisierung des In-vivo-Metabolismus von Verbindung [18F]2 im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell 3.8.4.1 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 3.8.4.2 Autoradiographie 3.8.4.3 Bioverteilung 3.8.4.4 Metabolitenanalyse 3.9 Reinigung und Charakterisierung rekombinanter, löslicher Eph-Rezeptoren 3.9.1 Proteinbiosynthese und Sekretion von sEphB4 und sEphB6 3.9.2 Reinigung von rekombinantem sEphB4 und sEphB6 aus COS-7-Zellkulturüberständen 4 DISKUSSION 4.1 Therapiemöglichkeiten und Bedeutung von Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen beim malignen Melanom 4.2 Vorkommen von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Melanomzellen und inflammatorischen Zellen 4.3 Einfluss der Kokultur von Melanomzellen mit HL-60(M) auf die metastatischen und inflammatorischen Eigenschaften der Zellen 4.4 Einfluss von EphB4 auf das Wachstum und die Vaskularisierung von A375-Tumoren in vivo 4.5 Kinaseinhibitoren als potentielle Radiotracer für die In vivo-Bildgebung von Eph-Rezeptoren 4.6 Entwicklung löslicher Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden als Grundlage für die In vivo-Bildgebung des Eph-Ephrin-Systems 5 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 DANKSAGUNG 9 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE

Macrophages are innate immune cells responsible for engulfing microbes and cell debris through phagocytosis and orchestrating immune responses to maintain homeostasis. While conducting immune surveillance over all types of organs and tissues, macrophages face inherently heterogeneous microenvironments with unique biophysical features. For instance, microglia residing in the brain, Kupffer cells living in the skin and bone osteoclasts are exposed to very distinct tissue stiffnesses. Despite the research done in the last decade clearly indicates that macrophages are sensitive to physical factors, how mechanical cues modulate their inflammatory response remains poorly understood. The present study aims at investigating how microenvironment stiffness influences the pro-inflammatory behaviour of macrophages. Besides characterising the regulatory effect on pro-inflammatory gene expression and cytokine production, this work examines the impact of stiffness on the inflammasome, one of the main macrophage signalling platforms. For this, an in vitro system based in 2D polyacrylamide hydrogels whose stiffness can be independently tuned was established. Using substrates with an elastic moduli between 0.2 and 33.1 kPa, bone marrow-derived macrophages adopted a less spread and rounder morphology on compliant compared to stiff polyacrylamide. Upon priming with lipopolysaccharide, the expression levels of the gene encoding for TNF-α were higher on more compliant hydrogels, yet there were no significant differences in the expression of other major pro-inflammatory genes. Additionally stimulating macrophages with the ionophore nigericin revealed higher secreted protein levels of IL-1β and IL-6 on compliant substrates. Interestingly, macrophages challenged on compliant polyacrylamide also displayed an enhanced formation of the NLRP3 inflammasome as well as increased levels of pyroptotic cell death. The upregulation of inflammasome assembly on compliant hydrogels was not primarily attributed to the reduced cell spreading, since spatially confining cells on micropatterns led to a decrease of inflammasome-positive cells compared to well-spread cells. Finally, interfering with actomyosin contractility diminished the differences in inflammasome formation between compliant and stiff substrates. In summary, these results show that substrate stiffness affects the pro-inflammatory response of macrophages and for the first time describe that the NLRP3 inflammasome is one of the signalling components affected by stiffness mechanosensing. The work presented here expands our understanding of how microenvironment stiffness affects macrophage behaviour and which elements of their machinery might contribute to integrate mechanical cues into the regulation of their inflammatory functions. The onset of pathological processes or the implant of foreign bodies represent immune challenges in which macrophages can face a mechanically changing environment. Therefore, a better insight on how macrophages detect and process biophysical signals could potentially provide a basis for new strategies to modulate inflammatory responses.:INTRODUCTION 1.1 Macrophage cell biology 1.1.1 The origin of macrophages 1.1.2 The macrophage: a swiss army knife 1.1.3 The macrophage pro-inflammatory response 1.2 Immunobiophysics: the force of the immune system 1.2.1 Exertion of immune cell forces 1.2.2 Immune cell mechanosensing 1.3 Cellular mechanosensing and mechanotransduction 1.3.1 Cell adhesions to the extracellular matrix 1.3.2 Nuclear mechanotransduction 1.3.3 Membrane mechanosensing elements 1.4 Macrophage mechanosensing AIMS AND SCOPE OF THE THESIS RESULTS 3.1 Morphol. characterisation of macrophages cultured on substrates of varying stiffness 3.1.1 BMDMs adhere and can be cultured on polyacrylamide hydrogels 3.1.2 Macrophage morphology is influenced by substrate stiffness 3.1.3 PEG-Hep hydrogels induce similar morphological differences as PAA substrates but do not constitute a suitable macrophage culture platform 3.1.4 Substrate stiffness affects membrane architecture 3.2 Impact of substrate stiffness on the pro-inflammatory response of macrophages 3.2.1 The morphol. differences induced by different stiffness persist after macrophage priming 3.2.2 Tuning substrate stiffness does not cause major changes in the expression of pro-inflammatory genes 3.2.3 Lower substrate stiffness upregulates the secretion of the cytokines IL-6 and IL-1β 3.2.4 Stiffer substrates diminish macrophage pyroptotic cell death 3.2.5 Compliant substrates enhance NLRP3 inflammasome formation 3.3 Investigation of macrophage mechanotransducing elements 3.3.1 Limiting cell spreading alone does not recapitulate the effects induced by stiffness on inflammasome formation 3.3.2 Actomyosin contractility may play a role in transducing the mechanical cues given by substrate stiffness DISCUSSION AND CONCLUSIONS 4.1 Compliant substrates enhance the macrophage pro-inflammatory response 4.2 Substrate stiffness influences the formation of the NLRP3 inflammasome 4.3 Exclusively altering cell spreading does not explain the differences induced by substrate stiffness 4.4 Actomyosin contractility as a potential macrophage mechanotransducer element 4.5 Potential impact of the study in the context of cancer 4.6 Potential impact of the study in the context of implant design 4.7 Conclusions of the study MATERIALS AND METHODS 5.1 Production of polyacrylamide (PAA) hydrogels 5.2 Production of polyethylenglycol-heparin (PEG-Hep) hydrogels 5.3 Mechanical characterisation of hydrogels and macrophages 5.4 Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 5.5 Fluorescence confocal microscopy 5.6 Scanning electron microscopy (SEM) 5.7 Gene expression analysis using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 5.8 Cytokine quantification assays 5.9 Cell viability assay 5.10 Culture of BMDMs on micropatterns 5.11 Optical diffraction tomography (ODT) 5.12 Statistical analysis and data visualisation APPENDIX LIST OF ACRONYMS AND ABBREVIATIONS LIST OF FIGURES BIBLIOGRAPHY ACKNOWLEDGEMENTS / Als Teil des angeborenen Immunsystems sind Makrophagen dafür verantwortlich Pathogene und Zellrückstände durch Phagozytose zu beseitigen. Sie orchestrieren Immunantworten um homöostatische Bedingungen von Organen und Geweben aufrechtzuerhalten. Dabei sind sie extrem heterogenen Mikroumgebungen ausgesetzt, welche sich jeweils durch eine einzigartige Kombination von (bio)chemischen und mechanischen Eigenschaften, vor allem Gewebesteifigkeiten, auszeichnen. Dies veranschaulichen beispielsweise im Gehirn residierende Mikroglia, Kupffer-Zellen in der Haut und Osteoklasten in Knochen. Obwohl diverse Studien aus dem letzten Jahrzehnt eindeutig zeigen, dass Makrophagen auf mechanische Signale reagieren, ist der zugrunde liegende Mechanismus, wie diese Signale eine Entzündungsreaktion modulieren, noch immer unzureichend verstanden. Die vorliegende Studie beinhaltet die systematische Untersuchung, wie die Steifigkeit der Mikroumgebung das proinflammatorische Verhalten von Makrophagen beeinflusst. Neben der Charakterisierung der regulatorischen Wirkung auf die proinflammatorische Genexpression und Zytokinproduktion untersucht diese Arbeit auch den Einfluss der Steifigkeit auf das Inflammasom; eine der wichtigsten Signalplattformen für Makrophagen. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein Zellkultursystem mit 2D-Polyacrylamid-Hydrogelen als Zellsubstrat entwickelt, bei dem das Elastizitätsmodul der Gelsubstrate gezielt eingestellt werden kann. Unter Verwendung von Substraten mit einem Elastizitätsmodul zwischen 0,2 kPa und 33,1 kPa zeigt die mikroskopische Analyse, dass aus Knochenmark stammende Makrophagen im Vergleich zu steifem Polyacrylamid eine weniger ausgebreitete und rundere Morphologie annehmen. Nach dem Primen mit Lipopolysaccharid waren die Expressionsniveaus des Gens, das für TNF-α kodiert, auf deformierbareren Hydrogelen höher, jedoch gab es keine signifikanten Unterschiede in der Expression anderer wichtiger pro-inflammatorischer Gene. Eine zusätzliche Stimulierung von Makrophagen mit dem Ionophor Nigericin bewirkte höhere sekretierte Proteinspiegel von IL-1β und IL-6 auf deformierbaren Substraten. Makrophagen, die deformierbarem Polyacrylamid ausgesetzt waren, zeigten auch eine verstärkte Bildung des NLRP3-Inflammasoms sowie ein erhöhtes Ausmaß an pyroptotischem Zelltod. Die Hochregulierung der Inflammasom-Assemblierung auf deformierbaren Hydrogelen wurde nicht primär auf die reduzierte Zellausbreitung zurückgeführt, da räumlich begrenzte Zellen auf Mikromustern zu einer Abnahme von Inflammasom-positiven Zellen im Vergleich zu stark ausgebreiteten Zellen führten. Schließlich verringerte eine Störung der Aktomyosin-Kontraktilität die Unterschiede in der Inflammasombildung zwischen deformierbaren und steifen Substraten. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Substratsteifigkeit die proinflammatorische Reaktion von Makrophagen beeinflusst und beschreiben erstmalig, dass das NLRP3-Inflammasom eine der Signalkomponenten ist, die von der zellulären Steifheitswahrnehmung beeinflusst werden. Die hier vorgestellte Arbeit erweitert unser Verständnis davon, wie die Steifigkeit der Mikroumgebung das Verhalten von Makrophagen beeinflusst und welche Elemente ihrer Maschinerie dazu beitragen könnten mechanische Signale in die Regulierung ihrer Entzündungsfunktionen zu integrieren. Das Einsetzen pathologischer Prozesse oder die Implantation von Fremdkörpern stellen Immunherausforderungen dar, bei denen Makrophagen einer sich mechanisch verändernden Umgebung ausgesetzt sein können. Daher könnte ein besserer Einblick in die Art und Weise, wie Makrophagen biophysikalische Signale erkennen und verarbeiten, möglicherweise eine Grundlage für neue Strategien zur Modulation von Entzündungsreaktionen bieten.:INTRODUCTION 1.1 Macrophage cell biology 1.1.1 The origin of macrophages 1.1.2 The macrophage: a swiss army knife 1.1.3 The macrophage pro-inflammatory response 1.2 Immunobiophysics: the force of the immune system 1.2.1 Exertion of immune cell forces 1.2.2 Immune cell mechanosensing 1.3 Cellular mechanosensing and mechanotransduction 1.3.1 Cell adhesions to the extracellular matrix 1.3.2 Nuclear mechanotransduction 1.3.3 Membrane mechanosensing elements 1.4 Macrophage mechanosensing AIMS AND SCOPE OF THE THESIS RESULTS 3.1 Morphol. characterisation of macrophages cultured on substrates of varying stiffness 3.1.1 BMDMs adhere and can be cultured on polyacrylamide hydrogels 3.1.2 Macrophage morphology is influenced by substrate stiffness 3.1.3 PEG-Hep hydrogels induce similar morphological differences as PAA substrates but do not constitute a suitable macrophage culture platform 3.1.4 Substrate stiffness affects membrane architecture 3.2 Impact of substrate stiffness on the pro-inflammatory response of macrophages 3.2.1 The morphol. differences induced by different stiffness persist after macrophage priming 3.2.2 Tuning substrate stiffness does not cause major changes in the expression of pro-inflammatory genes 3.2.3 Lower substrate stiffness upregulates the secretion of the cytokines IL-6 and IL-1β 3.2.4 Stiffer substrates diminish macrophage pyroptotic cell death 3.2.5 Compliant substrates enhance NLRP3 inflammasome formation 3.3 Investigation of macrophage mechanotransducing elements 3.3.1 Limiting cell spreading alone does not recapitulate the effects induced by stiffness on inflammasome formation 3.3.2 Actomyosin contractility may play a role in transducing the mechanical cues given by substrate stiffness DISCUSSION AND CONCLUSIONS 4.1 Compliant substrates enhance the macrophage pro-inflammatory response 4.2 Substrate stiffness influences the formation of the NLRP3 inflammasome 4.3 Exclusively altering cell spreading does not explain the differences induced by substrate stiffness 4.4 Actomyosin contractility as a potential macrophage mechanotransducer element 4.5 Potential impact of the study in the context of cancer 4.6 Potential impact of the study in the context of implant design 4.7 Conclusions of the study MATERIALS AND METHODS 5.1 Production of polyacrylamide (PAA) hydrogels 5.2 Production of polyethylenglycol-heparin (PEG-Hep) hydrogels 5.3 Mechanical characterisation of hydrogels and macrophages 5.4 Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 5.5 Fluorescence confocal microscopy 5.6 Scanning electron microscopy (SEM) 5.7 Gene expression analysis using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 5.8 Cytokine quantification assays 5.9 Cell viability assay 5.10 Culture of BMDMs on micropatterns 5.11 Optical diffraction tomography (ODT) 5.12 Statistical analysis and data visualisation APPENDIX LIST OF ACRONYMS AND ABBREVIATIONS LIST OF FIGURES BIBLIOGRAPHY ACKNOWLEDGEMENTS

Einleitung: Septische Arthritis (SA) ist ein häufiges und für Pferde potenziell lebensbedrohliches Erkrankungsbild, dass einer unverzüglichen, korrekten Diagnosestellung sowie unverzüglichen Einleitung therapeutischer Maßnahmen bedarf. Als wichtigstes objektives diagnostisches Mittel gilt weiterhin die zytologische Synoviaanalyse. Obwohl die routinemäßig implizierte Differenzierung der Leukozyten im Gelenkpunktat das Verhältnis von synovialen Makrophagen (SFM) zu polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) und Lymphozyten (LY) erfasst und SFM inklusive ihrer Polarisierungsstadien seit geraumer Zeit im Fokus der Wissenschaft stehen, ist ihr Einfluss auf entzündliche Gelenkerkrankungen und Wiederherstellung der Homöostase nicht abschließend geklärt. Die Charakterisierung von Makrophagen als katabole Entzündungsmediatoren konnte längst um eine antiinflammatorische, protektive Komponente erweitert werden und eröffnet damit den Horizont für eine zukünftige Nutzung als immuntherapeutisches Agens. Vor dem Hintergrund der bis dato überwiegend symptomatischen Behandlungsmöglichkeiten osteoarthrotischer Erkrankungen bei Mensch und Pferd ist die Aussicht auf gezielte Polarisierung von Makrophagen in pro-regenerative Subtypen besonders vielversprechend. Nicht zuletzt, weil sich equine Arthropathien zur Extrapolation auf entsprechende humanmedizinische Erkrankungszustände bewährt haben. Ziele der Untersuchungen: Um mehr Erkenntnisse über Funktion und Pathophysiologie von SFM bei Etablierung und Fortschreiten einer Gelenkinfektion und Wiederherstellung der Homöostase zu gewinnen, lag der Fokus dieser Studie auf Evaluierung von Quantität bzw. Proportion und Morphologie dieser Zellfraktion bei juvenilen und adulten Pferden mit SA unter Berücksichtigung des Einflusses einer arthroskopischen Lavage. Lichtmikroskopische Untersuchungen des Phänotyps von SFM im Ausstrichpräparat könnten zukünftig mit spezifischen Marker-Affinitäten und Aktivitätsstadien verknüpft werden. Material und Methoden: Nach Auswertung aller zwischen 2014 - 2018 entnommenen Synovialpunktate inklusive zugehöriger Patientenakten erfolgte eine Einteilung in drei unterschiedliche Gruppen: (1) nicht septisch, (2) hämatogene SA beim Fohlen und (3) traumatische/iatrogene SA. Das Verhältnis von SFM zu PMN, LY, Gesamtleukozytenzahl (WBCC) und Totalprotein (TP) wurde anhand der zytologischen Synoviaanalyse sowohl gruppenspezifisch als auch hinsichtlich der Auswirkungen einer arthroskopischen Lavage evaluiert. Als prospektiver Teil dieser Studie wurde die morphologische Ausprägung der SFM lichtmikroskopisch in Giemsa-gefärbten Ausstrichen septischer Synovialpunktate untersucht. Dabei wurden verschiedene Phänotypen identifiziert, ihr Auftreten vor bzw. nach der Gelenkspülung quantitativ ermittelt und die Übereinstimmung der Ergebnisse beider Untersucher*innen statistisch verifiziert. Ergebnisse: Es wurden insgesamt 167 Synovialpunktate von 74 Pferden evaluiert; 46 Proben von 32 Pferden lagen unterhalb des festgelegten Grenzwertes und bildeten die nicht-septische Gruppe 1. Vierunddreißig Punktate von 12 septikämischen Fohlen bildeten Gruppe 2. Gruppe 3 bestand aus 87 Proben von 28 Adulten und 2 Fohlen, darunter 24 mit SA auf Grund einer Verletzung mit Gelenkbeteiligung und 6 mit SA iatrogener Genese. Unabhängig von der Ätiologie der Erkrankung und dem Alter des Pferdes sinkt der Anteil synovialer Makrophagen bei SA auf 5-6 %, während in der nicht-septischen Gruppe 1 Medianwerte von 23,5 % ermittelt wurden. Nach arthroskopischer Lavage septischer Kavitäten kommt es zu einer signifikanten Verringerung von WBCC, PMN und SFM. Lichtmikroskopisch konnten erstmals vier unterschiedliche Makrophagen-Phänotypen identifiziert werden. Typ 1 weist morphologische Ähnlichkeiten zu Blut-Monozyten auf und überwiegt in nicht erkrankten Gelenken sowie nach arthroskopischer Spülung, während die vakuolen- bzw. phagosomhaltigen Phänotypen 3 und 4 vermehrt in septischen Synovialausstrichen vor Lavage auftraten. Schlussfolgerungen: Lichtmikroskopische Untersuchungen zur phänotypischen Ausprägung von Makrophagen tragen als niedrigschwellige und breit anwendbare Modalität zum besseren Verständnis der gelenkassoziierten Makrophagenpopulation bei. Es kann angenommen werden, dass SFM bei SA den Polarisationsgrad pro-inflammatorischer M1 mit großer Phagozytosekapazität annehmen. Die korrespondierende Morphologie könnte vom vakuolen- bzw phagosomhaltigen Phänotyp 3 und 4 repräsentiert werden. Typ 1 kann aus einem vermehrten Influx monozytärer Makrophagen-Progenitorzellen resultieren und ist möglicherweise an der Wiederherstellung der Gelenkhomöostase beteiligt. In zukünftigen Forschungsprojekten sollte der Fokus auf der Verknüpfung dieser 4 Phänotypen mit spezifischen Färbemethoden zum Rückschluss auf Aktivitätszustände liegen.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung ...1 2. Literaturübersicht ...2 2.1. Anatomie und Physiologie von Gelenk und Synovia im Überblick ...2 2.2. Zelluläre Bestandteile des Immunsystems ...4 2.3. Makrophagen: Funktion und Pathophysiologie ...5 2.4. Charakterisierung verschiedener Subtypen - das Yin und Yang der Makrophagen ...8 2.5. Klinische und ökonomische Bedeutung der Osteoarthrose - das Pferd als Modell ...12 2.6. Makrophagen als immunmodulatorisches Therapeutikum ...13 2.7. Septische Arthritis ...17 2.7.1. Ätiologie ...17 2.7.2. Prognose...18 2.7.3. Prävalenz ...19 2.7.4. Pathophysiologie ...19 2.7.5. Diagnose ...20 2.7.6. Therapie ...23 3. Hypothesen und Zielstellung der vorliegenden Dissertation ... 29 4. Publikation ...31 5. Diskussion ...41 5.1. Limitationen hinsichtlich Gruppenformation und Bewertung eines Synovialpunktats als septisch anhand von Grenzwerten ...41 5.2. Die Kultivierung von Mikroorganismen als ‚diagnostischer Goldstandard'...42 5.3. Histomorphologie als möglicher Rückschluss auf Polarisationsstadien von Makrophagen ...43 6. Zusammenfassung ...47 7. Summary ...49 8. Literaturverzeichnis ...51 / Introduction: Septic arthritis (SA) is a common and for horses potentially life-threatening condition in need of immediate, solid diagnosis and treatment. The cytological synovial fluid (SF) examination remains the most important objective variable to diagnose SA. It comprises a leucocyte differentiation routinely providing proportions of polymorphonuclear leucocytes (PMN), lymphocytes (LY) and synovial fluid macrophages (SFM), but there is still little information about the way SFM act upon synovial sepsis and joint homeostasis. A key feature of this heterogenous cell population in promoting osteoarthritis is the expression of pro-inflammatory cytokines and catabolic enzymes when activated by microorganisms. However, the prevailing paradigm of macrophages solely as contributors to the onset and progression of inflammatory joint diseases is considered obsolete. According to microenvironmental cues, joint-associated macrophages can also provide anti-inflammatory and protective responses regulating synovitis and contribute to maintaining local homeostasis and synovial integrity. Thus, finding a way of enhancing these pro-regenerative, tissue-remodeling functions bears great potential as novel therapeutic avenue but requires further research. Objectives: In an approach to gain more insights into the way SFM act upon joint inflammation onset, clearance and restoration of homeostasis, this study focused on tracing SFM in septic synovial cavities of foals and adult horses by means of cytological SF analysis and light microscopy. It was aimed to describe SFM relative concentrations in SF from unaffected joints and septic joints of different aetiologies (hematogenous vs. traumatic/iatrogenic) and to analyse the effect of therapeutic arthroscopic lavage on cell proportions, especially SFM relative concentrations, in septic joints. Light microscopy was performed on SF smears to assess SFM morphology, which might one day be linked to specific marker affinities and hence functions. Material and Methods: All SF samples collected between 2014 – 2018 including associated patient records were evaluated and subdivided into different groups: (1) non-septic, (2) haematogenous SA in foals and (3) traumatic/iatrogenic SA. SF cytology regarding proportions of SFM, PMN, LY, white blood cell counts (WBCC) and TP were investigated in a group-specific manner and with respect to the effects of joint lavage. As a prospective part of this study, light microscopy was performed on SF smears to assess SFM morphology and to identify different phenotypes and their occurrence prior to and post joint lavage. Results: A total of 167 synovial samples from 74 horses were evaluated; 46 samples from 32 horses fell below the established threshold and formed non-septic group 1. Thirty-four punctates from 12 septicemic foals formed group 2. Group 3 consisted of 87 samples from 28 adults and 2 foals, thereof 24 with SA due to joint-involving injuries and 6 with SA of iatrogenic origin. Regardless of aetiology of the disease and age of the horse, macrophage concentrations in synovial sepsis were decreased to a median of 5–6 % and strongly negatively correlated to high PMN numbers, whereas non-septic joints showed SFM amounts up to 74 % (median 23.5 %). Joint lavage further diminished WBCC, relative PMN and absolute SFM numbers. The microscopic assessment of 24 Giemsa-stained smears led to the identification of four different phenotypes. Morphological characteristics of type 1 showed similarities to blood-derived monocytes and predominated in unaffected and in septic joints after lavage, whereas vacuole- and phagosome-containing phenotypes 3 and 4, respectively, were more prevalent in septic synovial smears before lavage. Conclusion: Light microscopic studies of macrophage phenotypes are easily applicable and contribute to a better understanding of the joint-associated macrophage population. SFM in SA probably polarize towards pro-inflammatory M1-subtypes with phagocytic capacity. The corresponding morphology could be represented by vacuole- and phagosome-containing phenotypes 3 and 4. Type 1 may result from an increased influx of monocytic macrophage progenitor cells and may be involved in restoring joint homeostasis. Future research projects should focus on linking these phenotypes to functional profiling with specific marker affinities.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung ...1 2. Literaturübersicht ...2 2.1. Anatomie und Physiologie von Gelenk und Synovia im Überblick ...2 2.2. Zelluläre Bestandteile des Immunsystems ...4 2.3. Makrophagen: Funktion und Pathophysiologie ...5 2.4. Charakterisierung verschiedener Subtypen - das Yin und Yang der Makrophagen ...8 2.5. Klinische und ökonomische Bedeutung der Osteoarthrose - das Pferd als Modell ...12 2.6. Makrophagen als immunmodulatorisches Therapeutikum ...13 2.7. Septische Arthritis ...17 2.7.1. Ätiologie ...17 2.7.2. Prognose...18 2.7.3. Prävalenz ...19 2.7.4. Pathophysiologie ...19 2.7.5. Diagnose ...20 2.7.6. Therapie ...23 3. Hypothesen und Zielstellung der vorliegenden Dissertation ... 29 4. Publikation ...31 5. Diskussion ...41 5.1. Limitationen hinsichtlich Gruppenformation und Bewertung eines Synovialpunktats als septisch anhand von Grenzwerten ...41 5.2. Die Kultivierung von Mikroorganismen als ‚diagnostischer Goldstandard'...42 5.3. Histomorphologie als möglicher Rückschluss auf Polarisationsstadien von Makrophagen ...43 6. Zusammenfassung ...47 7. Summary ...49 8. Literaturverzeichnis ...51

In zebrafish, transgenic labeling approaches, robust regenerative responses and excellent in vivo imaging conditions enable precise characterization of immune cell behavior in response to injury. Here, we monitored osteoblast-immune cell interactions in bone, a tissue which is particularly difficult to in vivo image in tetrapod species. Ablation of individual osteoblasts leads to recruitment of neutrophils and macrophages in varying numbers, depending on the extent of the initial insult, and initiates generation of cathepsin K+ osteoclasts from macrophages. Osteoblast ablation triggers the production of pro-inflammatory cytokines and reactive oxygen species, which are needed for successful macrophage recruitment. Excess glucocorticoid signaling as it occurs during the stress response inhibits macrophage recruitment, maximum speed and changes the macrophage phenotype. Although osteoblast loss is compensated for within a day by contribution of committed osteoblasts, macrophages continue to populate the region. Their presence is required for osteoblasts to fill the lesion site. Our model enables visualization of bone repair after microlesions at single-cell resolution and demonstrates a pro-osteogenic function of tissue-resident macrophages in non-mammalian vertebrates.

Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A) is the most common subtype of congenital polyneuropathies of the peripheral nervous system and is currently incurable. It is characterised by an early onset in the first decades of life and a combination of motor and sensory symptoms. The disease is caused by a duplication of the peripheral myelin protein 22 (PMP22) gene. This is mainly expressed in Schwann cells, which produce the insulating myelin layer of the peripheral nerves. This overexpression leads to primary dysmyelination, demyelination and subsequent axonal loss. Clinically, CMT1A manifests as muscle weakness and atrophy of the extremities progressing from distal to proximal. In the CMT1A animal model, it has been shown that a reduction in the number of macrophages can have a positive effect on the course of the disease. A more detailed understanding of the role of this cell type, in particular their heterogeneity, as demonstrated for example after acute nerve lesions, is currently still lacking for CMT1A, but might be a promising therapeutic target. Our research group showed in preliminary work that the Schwann cell pathology - contrary to the clinical picture - is more pronounced proximally than distally. Based on this, we have taken into account both a temporal as well as a spatial component in our analysis. In this study, we show that in our genetic mouse model of CMT1A disease, there is a ubiquitous increase in macrophage number in peripheral nerves during postnatal development. In addition, we found evidence that this increase may be cell-subgroup specific. In contrast, a more nerve-specific finding was observed at an adult time point. Here, the increase in macrophage density was more pronounced in proximal nerves, such as the primarily motoric ventral root. Moreover, we found an internerval variability in the number of macrophages expressing phagocytosis markers and antigen-presenting MHCII molecules. The results of this study suggest a connection between the proximally pronounced histopathology and an altered interaction of macrophages. They suggest that there are diverse macrophage subpopulations that have adapted to their specific niche according to the environmental conditions in the different peripheral nerves. This hypothesis is supported by the fact that we also found heterogeneity between the nerves of wild-type animals. Within the scope of this project, we have developed the methodological basis to further clarify and confirm the diversity of macrophages in CMT1A. By taking into account the properties of specific macrophage subgroups, this might enable a more precise search for therapeutic targets that act at the site of the pathology itself in the future.:Acronyms 4 Introduction 9 1. The peripheral nervous system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2. Macrophages in the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.1. Peripheral nerve macrophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3. Peripheral neuropathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4. Charcot-Marie-Tooth disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 6. Macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Research questions and aim of this project 25 Materials and Methods 27 1. Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.1. Mouse lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.2. Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.3. Primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4. Buffers and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.5. Apparatus, laboratory equipment and consumables . . . . . . . . . . . . 33 1.6. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2. Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.1. Mouse procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.2. Histological analysis of diseased and non-diseased mouse peripheral nerves 38 2.3. Spatial analysis of diseased and undiseased mouse peripheral nerves . . . 42 2.4. Fluorescence Activated Cell Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.5. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Results 47 1. Quantification of macrophages in CMT1A along the proximo-distal axis . . . . . 47 1.1. PMP22-tg mice have increased numbers of nuclei . . . . . . . . . . . . . 48 1.2. Peripheral nerves of PMP22-tg mice display a heterogenous macrophage response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 1.3. Characterisation of nerve macrophages in WT at different time points . . 55 1.4. There are no differences in the density of macrophages along the proximodistal axis within one nerve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2. Macrophage characterisation in 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.1. There is a lack of increase in total volume of CX3CR1+ macrophages in nerves of P18 PMP22-tg mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.2. There are no significant differences in spatial properties . . . . . . . . . . 61 3. Inflammatory profile of macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.1. There are no changes in the expression of the lysosomal marker CD107b in 6mo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 3.2. DECTIN1 expression is altered in nerve macrophages at 6 months . . . . 66 3.3. The ventral roots of P18 PMP22-tg mice have a higher quantity ofMHCII objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.4. Macrophages in VR have higher MHCII+ content . . . . . . . . . . . . . 69 3.5. The Npero in PMP22-tg mice displays a specific switch in the antigen presenting cell type via MHCII at P18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4. Establishing a protocol for nerve macrophage isolation for downstream transcriptomic analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.1. Isolating cells from peripheral nerve tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.2. Isolating macrophages using FACS-analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Discussion 77 1. Macrophage increase in different nerves and at different disease stages is more diverse than previously known . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 2. CX3CR1+ macrophage subpopulation stays quantitatively stable and is spatially unchanged . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3. Inflammation markers display a diverse pattern in nerve macrophages . . . . . . 86 4. Macrophage separation enables subpopulation-specific analyses . . . . . . . . . . 89 5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Abstract 94 Zusammenfassung 95 References 97 A. Appendix i A.1. List of Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.2. List of Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.3. Macros in Fiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii A.4. Macros in Imaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v A.5. Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x A.6. Copyright of figures taken from publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii B. Selbstständigkeitserklärung (Declaration of independence) xx C. Curriculum Vitae xxi D. Acknowledgements xxii / Die Charcot-Marie-Tooth-1A (CMT1A) Erkrankung ist die, derzeit unheilbare, häufigste Subform der angeborenen Polyneuropathien des peripheren Nervensystems. Sie zeichnet sich durch einen frühen Beginn bereits in den ersten Lebensdekaden und kombiniert motorisch-sensorische Symptome aus. Ursächlich ist eine Duplikation des peripheren Myelinprotein 22 (PMP22) Gens, welches vornehmlich in Schwannzellen exprimiert wird, die die isolierende Myelinschicht der peripheren Nerven produzieren. Diese Überexpression führt zu primärer Dysmyelinisierung, Demyelinisierung und nachfolgenden axonalen Verlusten. Klinisch äußert sich CMT1A durch eine von distal nach proximal fortschreitende Muskelschwäche und -atrophie der Extremitäten. Im CMT1A Tiermodell zeigte sich, dass eine Verringerung der Makrophagenanzahl den Krankheitsverlauf positiv beeinflussen kann. Ein genaueres Verständnis der Rolle dieser Zellen, insbesondere deren Heterogenität, wie etwa nach akuten Nervenläsionen nachgewiesen, fehlt derzeit noch für CMT1A, könnte jedoch einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt darstellen. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten eine – konträr zum klinischen Bild – proximal stärker ausgeprägte Schwannzellpathologie. Hieran anknüpfend berücksichtigt unsere Analyse neben einer zeitlichen auch eine räumliche Komponente. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir in peripheren Nerven des genetischen CMT1A Mausmodells eine ubiquitäre Erhöhung der Makrophagenanzahl in der postnatalen Entwicklung. Zusätzlich fanden wir Hinweise, dass diese Erhöhung Zell-subgruppenspezifisch sein könnte. Zu einem adulten Zeitpunkt zeigte sich indes ein Nerven-spezifischeres Bild. Hier war die erhöhte Makrophagendichte in proximalen Nerven, etwa der primär motorischen vorderen Nervenwurzel, stärker betont. Überdies fanden wir eine internervale Variabilität der Anzahl an Makrophagen, die Phagozytosemarker und antigenpräsentierende MHCII-Moleküle exprimierten. Unsere Ergebnisse lassen einen Zusammenhang zwischen der proximal betonten Histopathologie und einer veränderten Interaktion von Makrophagen vermuten. Sie legen nahe, dass es diverse Subpopulationen gibt, die sich entsprechend biologischer Nischen an die jeweiligen Gegebenheiten der peripheren Nerven angepasst haben. Diese These wird unter anderem dadurch unterstützt, dass sich auch die Nerven der Wildtyp Tiere heterogen zeigten. Zur weiteren Abklärung und Bestätigung der Diversität von Makrophagen in CMT1A, haben wir im Rahmen dieser Arbeit die methodischen Grundlagen entwickelt. Dies könnte es in Zukunft ermöglichen, unter Berücksichtigung der Eigenschaften spezifischer Makrophagen-Subgruppen, gezielter nach therapeutischen Ansatzpunkten zu suchen, die am Ort der Pathologie selbst wirken.:Acronyms 4 Introduction 9 1. The peripheral nervous system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2. Macrophages in the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.1. Peripheral nerve macrophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3. Peripheral neuropathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4. Charcot-Marie-Tooth disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 6. Macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Research questions and aim of this project 25 Materials and Methods 27 1. Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.1. Mouse lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.2. Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.3. Primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4. Buffers and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.5. Apparatus, laboratory equipment and consumables . . . . . . . . . . . . 33 1.6. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2. Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.1. Mouse procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.2. Histological analysis of diseased and non-diseased mouse peripheral nerves 38 2.3. Spatial analysis of diseased and undiseased mouse peripheral nerves . . . 42 2.4. Fluorescence Activated Cell Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.5. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Results 47 1. Quantification of macrophages in CMT1A along the proximo-distal axis . . . . . 47 1.1. PMP22-tg mice have increased numbers of nuclei . . . . . . . . . . . . . 48 1.2. Peripheral nerves of PMP22-tg mice display a heterogenous macrophage response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 1.3. Characterisation of nerve macrophages in WT at different time points . . 55 1.4. There are no differences in the density of macrophages along the proximodistal axis within one nerve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2. Macrophage characterisation in 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.1. There is a lack of increase in total volume of CX3CR1+ macrophages in nerves of P18 PMP22-tg mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.2. There are no significant differences in spatial properties . . . . . . . . . . 61 3. Inflammatory profile of macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.1. There are no changes in the expression of the lysosomal marker CD107b in 6mo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 3.2. DECTIN1 expression is altered in nerve macrophages at 6 months . . . . 66 3.3. The ventral roots of P18 PMP22-tg mice have a higher quantity ofMHCII objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.4. Macrophages in VR have higher MHCII+ content . . . . . . . . . . . . . 69 3.5. The Npero in PMP22-tg mice displays a specific switch in the antigen presenting cell type via MHCII at P18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4. Establishing a protocol for nerve macrophage isolation for downstream transcriptomic analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.1. Isolating cells from peripheral nerve tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.2. Isolating macrophages using FACS-analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Discussion 77 1. Macrophage increase in different nerves and at different disease stages is more diverse than previously known . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 2. CX3CR1+ macrophage subpopulation stays quantitatively stable and is spatially unchanged . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3. Inflammation markers display a diverse pattern in nerve macrophages . . . . . . 86 4. Macrophage separation enables subpopulation-specific analyses . . . . . . . . . . 89 5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Abstract 94 Zusammenfassung 95 References 97 A. Appendix i A.1. List of Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.2. List of Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.3. Macros in Fiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii A.4. Macros in Imaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v A.5. Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x A.6. Copyright of figures taken from publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii B. Selbstständigkeitserklärung (Declaration of independence) xx C. Curriculum Vitae xxi D. Acknowledgements xxii