L' ENGROGUIMENT DE LES CUCURBITÀCIES: DIAGNÓSTIC I MICROSCOPIA DE LES RELACIONS VIRUS-PLANTA I VIRUS-VECTOR La malaltia de l'engroguiment de les cucurbitàcies, de gran importància, en els cultius del sud-est espanyol, està produïda per dos Closteroviridae transmesos per mosques blanques, el virus del fals engroguiment de la remolatxa (BPYV) i el virus de l'engroguiment enanitzant de les cucurbitàcies (CYSDV). BPYV és transmès específicament i de forma semipersistent per Trialeurodes vaporariorum (Westwood) i CYSDV per Bemisia tabaci (Gennadius). En els darrers anys, encara que s'ha produït un gran avenç en el coneixement a escala molecular, alguns dels aspectes de la relació virus-planta i virus-vector són encara desconeguts. L' objecte d'aquest treball ha estat l'estudi de les relacions que BPYV i CYSDV estableixen amb les cucurbitàcies i les mosques blanques per ajustar-lo a un dels models virus-planta-vector descrit. Es varen establir tres grups d'estudis: (i) en el primer, destinat a l'establiment d'una tècnica de diagnòstic i a la propagació de BPYV i CYSDV, durant dos anys es varen realitzar mostreigs dirigits a plantes amb símptomes d'engroguiment en cultius protegits de meló i cogombre del sud-est espanyol i en cultius de meló a l'aire lliure de la zona de Lleida, varen evaluar-se distintes tècniques de diagnòstic i es realitzaren assaigs de transmissió amb els vectors, (ii) en el segon grup varen abordar-se les realcions virus-planta, mitjançant estudis citopatològics i de localització en els que va assajar-se immunomarcatge amb or coloidal (IGL) i hibridació in situ (ISH) amb sondes d'ARN i (iii) en el tercer varen estudiar-se les relacions virus-vector, mitjançant comparació de l'anatomia interna de T.vaporariorum i de B. tabaci relacionada amb la transmissió, varen assajar-se dues tècniques d'inclusió en resina per IGL i es realitzaren proves de IGL i ISH.En el sud-est espanyol, l'engroguiment està associat amb BPYV i CYSDV, detectant-se aquest darrer en un major nombre de mostres. En canvi, a l'àrea de Lleida, aquests virus no es detecten i únicament trobem virus transmesos per pugons,essent el virus del mosaic del cogombre (CMV) el més abundant, juntament amb el virus del mosaic de la sindria soca 2 (WMV-2) i el virus del mosaic groc del carbassó (ZYMV). En aquesta zona, els casos d'engroguiment no associats a virus són majors quan les mostres són recollides al final del cultiu. Els estudis citopatològics realitzats amb BPYV i CYSDV mostraren la presència d'alteracions a les cèl.lules del floema, a les que es va observar la proliferació de vesícules membranoses citoplasmàtiques amb distinta morfologia, grans agregats de partícules virals, hipertròfia en mitocòndries i la desorganització de les membranes dels cloroplasts. Cap dels virus estudiats produeix la formació de dipòsits cònics de material electrodens a la zona del plasmalema característics del virus de l'engroguiment infecciós de l'enciam (LIYV), membre tipus dels Crinivirus. Els resultats de les proves de IGL i IHS varen confirmar la limitació d'aquests virus al floema. Les proteïnes de coberta de CYSDV i LIYV es varen detectar en el citoplasma de les cél.lulas acompanyants del floema; i mitjançant ISH, BPYV i CYSDV varen localitzar-se en el citoplasma d'aquestes cèl.lules.El canal alimentari de T. vaporariorum presenta unes característiques anatòmiques semblants a les descrites i observades a B. tabaci, de manera que les diferències en el seu comportament com a insectes vectors no poden explicar-se amb aquest tipus d'observacions. Les proves d' IGL mostraren la localització tant de CYSDV com de LIYV en els trams inicials del canal alimentari i de l'intestí anterior del seu insecte vector, B. tabaci, descartant-se la possible circulació d'aquests virus a l'interior del cos de l' insecte. En base als resultats obtinguts, el model de transmissió que més s'ajusta a la transmissió semipersistent dels Crinivirus per mosques blanques és el de ingestió-regurgitació. / EL AMARILLEO DE LAS CUCURBITÁCEAS: DIAGNÓSTICO Y MICROSCOPÍA DE LAS RELACIONES VIRUS-PLANTA Y VIRUS-VECTOR La enfermedad del amarilleo de las cucurbitáceas, de gran importancia en los cultivos del sudeste español, está producida por dos Closteroviridae transmitidos por moscas blancas, el virus del falso amarilleo de la remolacha (BPYV) y el virus del amarilleo enanizante de las cucurbitáceas (CYSDV). BPYV es transmitido específicamente y de modo semipersistente por Trialeurodes vaporariorum (Westwood) y CYSDV por Bemisia tabaci (Gennadius). En los últimos años, aunque se ha producido un gran avance en el conocimiento a escala molecular, algunos de los aspectos de la relación virus-planta y virus-vector son todavía desconocidos. El objeto de este trabajo ha sido el estudio de las relaciones que BPYV y CYSDV establecen con las cucurbitáceas y las moscas blancas para ajustarlo a uno de los modelos virus-planta-vector descrito. Se abordaron tres grupos de estudios: (i) en el primero, destinado al establecimiento de una técnica de diagnóstico y a la propagación de BPYV y CYSDV, durante dos años se realizaron muestreos dirigidos a plantas con síntomas de amarilleo en cultivos protegidos de melón y pepino del sudeste español y en cultivos de melón al aire libre de la zona de Lleida, se evaluaron distintas técnicas de diagnóstico y se realizaron ensayos de transmisión con los vectores, (II) en el segundo se abordaron las relaciones virus-planta, mediante estudios citopatológicos y de localización en los que se ensayó inmunomarcaje con oro coloidal (IGL) e hibridación in situ (ISH) con sondas de ARN; y (III) en el tercero se estudiaron las relaciones virus-vector, se realizó un estudio comparativo de la anatomía interna de T.vaporariorum y de B. tabaci relacionada con la transmisión, se ensayaron dos técnicas de inclusión para IGL y se realizaron pruebas de IGL e ISH.En el sudeste español, el amarilleo está asociado con BPYV y CYSDV, detectándose este último en un mayor número de muestras. En cambio, en el área de Lleida, éstos virus no se detectan y únicamente están presentes virus transmitidos por pulgones, siendo el virus del mosaico del pepino (CMV) el más abundante, junto con el virus del mosaico de la sandía cepa 2 (WMV-2) y el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV). En esta zona, los casos de amarilleo no asociados a virus son mayores cuando las muestras son recogidas al final del cultivo. Los estudios citopatológicos realizados con BPYV y CYSDV mostraron la presencia de alteraciones en las células del floema, en las que se observó la proliferación de vesículas membranosas citoplasmáticas con distinta morfología, grandes agregados de partículas virales, hipertrofia en mitocondrias y la desorganización de las membranas de los cloroplastos. Ninguno de los virus estudiados produce la formación de depósitos cónicos de material electrodenso en la zona del plasmalema característicos del virus del amarilleo infeccioso de la lechuga (LIYV), miembro tipo de los Crinivirus. Los resultados de las pruebas de IGL e IHS confirmaron la limitación de estos virus al floema. Las proteínas de cubierta de CYSDV y LIYV se detectaron en el citoplasma de las células acompañantes del floema; y mediante ISH, BPYV y CYSDV se localizaron en el citoplasma de estas células.El canal alimentario de T. vaporariorum presenta unas características anatómicas semejantes a las de B. tabaci, por lo que las diferencias en su comportamiento como insectos vectores no se pueden explicar con este tipo de observaciones. Las pruebas de IGL mostraron la localización tanto de CYSDV como de LIYV en los tramos iniciales del canal alimentario y del intestino anterior de su insecto vector, B. tabaci, descartándose la posible circulación de estos virus en el interior del cuerpo del insecto. En base a los resultados obtenidos, el modelo de transmisión que más se ajusta a la transmisión semipersistente de los Crinivirus por moscas blancas es el de ingestión-regurgitación. / CUCURBITS YELLOWING: DIAGNOSIS AND MICROSCOPY OF VIRUS-HOST AND VIRUS-VECTOR RELATIONSHIPSCucurbit yellowing disease, specially important in souteastern Spain, is caused by two Closteroviridae transmitted by whiteflies, Beet pseudo-yellows virus (BPYV) and Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV). BPYV is transmitted specifically in a semipersistent manner by Trialeurodes vaporariorum (Westwood) (Homoptera:Aleyrodidae) and CYSDV by Bemisia tabaci (Gennadius). In recent years, despite much progress in their knowledge at molecular level, some aspects of the relationships between viruses and their host, and vectors remain still unknown. The objective of this work was to study the relationships of BPYV and CYSDV with cucurbits and with whiteflies to adjust a described virus-host-vector model. Three groups of experiences were envisaged. (I) In the first one, with the goal to find a suitable procedure for detection of BPYV and CYSDV and to propagate these viruses, cucumber and melon plants with yellowing symptoms from southeastern Spain greenhouses and from melon crops growing open field in Lleida basin were collected for two years; different detection techniques were tested and vector transmission assays were made. (II) In the second one, virus-host relations were envisaged through cytopathological and localisation, by immunogold labelling (IGL) and in situ hibridisation (ISH) with ARN probes, studies. (III) And in the third group, virus-vector relationships were studied, a comparative study of the alimentary canal, that is related with virus transmission, of T. vaporariorum and B. tabaci was made; two embedding protocols for IGL were compared; and IGL and ISH were made.In southeastern Spain, yellowing symptoms are associated with BPYV and CYSDV infections. The number of CYSDV infected samples was larger than BPYV ones. In Lledia basin, BPYV and CYSDV were not detected, although aphid-transmitted viruses are present. Cucumber mosaic virus (CMV), Watermelon mosaic virus-2 (WMV-2) and Zucchini yellows mosaic virus (ZYMV) were the most abundant viruses found. Herein, the number of yellowing plants testing negative was higher when surveys were conducted at the end of the growing season.Ultrastructural changes induced by BPYV and CYSDV were detected in phloem cells, exhibiting formation of membranous cytoplasmic vesicles with different morphology, accumulation of virus particles in large masses, hypertrophied mitochondrion and degeneration of chloroplasts. No conical electrondense plasmalemma deposits, typical of Lettuce infectious yellows virus (LIYV) -the type member of the genus Crinivirus-; were observed in BPYV and CYSDV infections. IGL and ISH analyses confirmed that BPYV and CYSDV are phloem-limited. CYSDV and LIYV coat proteins were detected in the cytoplasm of companion cells cytoplasm; and by ISH, BPYV and CYSDV were localised in the cytoplasm.The alimentary canal of T. vaporariorum shows anatomical characteristics similars to those of B. tabaci, so their different vector behaviour could not be explained with this kind of observations. CYSDV and LIYV are detected in the initial part of the alimentary canal and foregut of B. tabaci, thus excluding the possible circulation of these viruses in the vector's body.The data obtained suggest that the most adapted transmission model to whiteflies transmitted Crinivirus in a semipersistent manner is the ingestion-regurgitation model, although some factors involved in this process are still unknown.

El decaïment de l'avet (Abies alba) va començar als anys 90 als Pirineus espanyols sense unacausa clara que l'expliqués. Les condicions climàtiques de la darrera part del segle XX semblen estar associades al començament d'aquest fenomen. Paral·lelament als processos de decaïment, apareixen nombroses alertes de plagues i patògens que afecten aquests boscos, fet que fa necessari conèixer la relació entre aquests agents biòtics i l'actual decaïment. Els Pirineus han estat utilitzats per l'home durant segles; la gestió i la dinàmica dels Pirineus, han de ser també considerats quan es pretén i) entendre si les condicions ambientals, la gestió i la dinàmica forestal estan associades a l'actual decaïment de l'avet, parant especial atenció al paper que determinats patògens com ara Viscum àlbum, Armillaria, Heterobasidion annosum i Melampsorella caryophyllacearum puguin tenir en el procés, mitjançant; ii) l'estudi de la seva epidemiologia i la identificació de quina és la gestió associada a la seva incidència i severitat.Es van mesurar 29 parcel·les escollides a l'atzar en avetoses dels Pirineus. A cada una de les parcel·les es va mesurar el decaïment dels arbres i la presència de patògens o plagues. Es vamesurar, també, la incidència d'Armillaria i H.annosum a l'interior dels arbres, mitjançant el cultiu de cilindres de fusta extrets de l'interior del tronc. Es va mesurar la presència de patògens a les soques i als arbres morts. Les soques i els arbres morts van ser utilitzats per estimar la composició d'espècies arbòries que hi havia en un passat. Es van mesurar 42 variables per tal de descriure els arbres, les condicions ambientals i la gestió que s'havia dut a terme en cada una de les parcel·les. Es van recollir mostres d' Armillaria i H. annosum, es van cultivar i es van identificar mitjançant tècniques moleculars d'anàlisi de l'ADN. Per examinar algunes de les hipòtesis plantejades va ser necessari emprar models mixtos no lineals a causa de la falta de normalitat i de la correlació espacial de les dades. Un 15% i un 10% dels avets dels Pirineus estaven defoliats i cloròtics, respectivament. Els arbres de l'estrat dominant eren els que presentaven més decaïment. Cap característica de la massa es va trobar associada al decaïment dels arbres. Es va observar que l'avet havia augmentat la seva àrea basimétrica en els últims anys i que els pins (Pinus sylvestris i P. uncinata) n'havien perdut. Les pèrdues d'àrea basimétrica de l'avet van ser, en la majoria dels casos, degudes a augments d'àrea basimétrica de faig (Fagus sylvatica); aquest fet es va trobar associat a la presència de danys sobre la regeneració d'avet produïts per ungulats. La presència de V. album es va veure associada a la mortalitat i al decaïment de l'avet. En boscos purs es va observar que V. album s'havia dispersat fàcilment entre i dins dels arbres, però en masses mixtes la dispersió de V. album semblava significativament reduïda. H. abietinum va ser identificat als Pirineus i la seva severitat a les soques era més alta en aquells boscos on les tallades havien afectat un major percentatge d'avet respecte a altres espècies forestals. La presència de H. abietinum es va veure associada amb la presència de V. album. La mortalitat d'avet era més gran quan els dos patògens apareixien junts. El rovell M. caryphyllacearum es va trobar associat al decaïment de l'avet. Aquest és un fong comú als Pirineus i la seva severitat era més alta en masses amb una major presència de plantes tolerants a l'ombra al sotabosc. A. cepistipes és l'espècie del gènere Armillaria més freqüent a les avetoses. A. ostoyae es va trobar més freqüentment en masses situades a major altitud, i on l'avet estava colonitzant més ràpidament altres tipus de bosc. El decaïment de l'avet és relativament baix i és més evident en els arbres dominants de la massa, cosa que suggereix que es podria tractar d'aquells arbres deixats després de les tallades com a arbres de llavor. V. album sembla ser el patogen amb un paper més important en el decaïment de l'avet. La seva severitat podria estar associada a l'augment de la temperatura als Pirineus i podria haver estat afavorida per la presencia de H. abietinum. Armillaria sembla tenir un paper notable en la dinàmica dels boscos de pi i avet. M. caryophyllacearum sembla trobar unes millors condicions per infectar avets en masses tancades que en masses obertes. Un augment de la sequera als Pirineus sembla que ha incitatel decaïment de les avetoses. La gestió sembla que en general ha afavorit l'avet, però podria haver predisposat determinats arbres a decaure. L'augment de la diversitat d'espècies i la reducció de la competència s'haurien d'examinar com a possibles tècniques per augmentar la salut d'aquests boscos. / El decaimiento del abeto (Abies alba) empezó en los años 90 en los Pirineos sin una causa clara que lo explicara. Las condiciones climáticas de la última parte del siglo XX parecen asociadas al comienzo de este proceso. Paralelamente al proceso de decaimiento aparecieron numerosas alertas de plagas y patógenos que estaban afectando estos bosques. Los Pirineos han sido usados durante siglos por el hombre, la gestión y la dinámica de estos debe ser tenida en cuenta cuando se pretende i) entender si las condiciones ambientales, la gestión y la dinámica forestal están asociadas al presente decaimiento del abeto, haciendo hincapié en el papel que determinados patógenos como Viscum album, Armillaria, Heterobasidion annosum y Melampsorella caryophyllacearum podrían tener en el proceso, mediante ii) el estudio de su epidemiología y mediante la identificación de cual es la gestión asociada a su incidencia y severidad. Se midieron 29 parcelas escogidas al azar en abetales del Pirineo. En cada una de las parcelas se midieron los síntomas de decaimiento y la presencia de signos y síntomas de ataques de plagas y patógenos en todos los árboles vivos. Se midió también la presencia de Armillaria y H. annosum mediante el cultivo de cilindros de madera extraídos del interior del tronco. Se midió la presencia de patógenos y plagas en árboles muertos y tocones. Los árboles muertos y los tocones se usaron para estimar la composición de especies arbóreas que tenían las parcelas en el pasado. Se midieron 42 variables para describir los árboles, las condiciones ambientales y la gestión que se había practicado en las parcelas. Se recogieron muestras de Armillaria y H. annosum, se cultivaron y se identificaron mediante técnicas moleculares de análisis del ADN. En ciertos casos fue necesario usar modelos mixtos no lineales, debido a la falta de normalidad y a la correlación espacial de los datos. Un 15% y un 10% de los abetos del Pirineo fueron considerados defoliados y cloróticos, respectivamente. Los árboles del estrato dominante fueron aquellos que mostraron un mayor decaimiento. Ninguna característica de masa se vio asociada al decaimiento de los árboles. Se observó que el abeto había aumentado su área basimétrica en los últimos años, y que la de los pinos (Pinus sylvestris y P. uncinata) había disminuido. Las perdidas de área basimétrica del abeto se debieron en la mayoría de los casos a un aumento de área basimétrica del haya (Fagus sylvatica), este hecho se vio también asociado a la presencia de daños sobre la regeneración de abeto producidos por ungulados. La presencia de V. album se encontró asociada al decaimiento y a la mortalidad del abeto. En masas puras se vio que V. album se había dispersado fácilmente entre y dentro de los árboles, pero en masas mixtas esta dispersión se había visto significativamente reducida. H. abietinum fue identificado en los Pirineos y su severidad era mayor en aquellos bosques donde las cortas habían afectado a un mayor porcentaje de abeto respecto a otras especies forestales. La presencia de H. abietinum se vio asociada a la presencia de V. album y la mortalidad de abeto fue mayor donde ambos patógenos ocurrían juntos. La roya M. caryophyllacearum se vio asociada al decaimiento del abeto. Este hongo pareció ser común en los Pirineos, pero su severidad era más alta en aquellas masas con un sotobosque con un mayor porcentaje de plantas tolerantes a la sombra. A. cepistipes fue la especie del género Armillaria más frecuente en los abetales. A. ostoyae se observó más frecuentemente en masas situadas a mayor altitud, y en aquellas en las que el abeto estaba colonizando más rápidamente otros tipos de bosque.El decaimiento del abeto es relativamente bajo en los Pirineos, afecta a los árboles dominantesde la masa, lo que sugiere que podría tratarse de aquellos árboles dejados después de las cortas como árboles de semilla. V. album parece el patógeno con un papel más importante en el decaimiento del abeto. Su severidad podría estar asociada al aumento de temperatura registrado en los Pirineos, y podría haber estado favorecida por la presencia de H. abietinum. Armillaria parece tener un papel notable en la dinámica de los bosques de pino y abeto, y podría estar asociada al aumento de F. sylvatica observado en los abetales. M. caryophyllacearum parece encontrar mejores condiciones para infectar el abeto en masas cerradas que en masas abiertas. El aumento de la sequía registrado en el Pirineo parece que ha incitado el decaimiento en el Pirineo. La gestión en general ha favorecido al abeto, sin embargo podría haber predispuesto a determinados árboles a decaer. El aumento de la diversidad de especies así como una reducción de la competencia deberían examinarse como posibles técnicas para aumentar la salud de estas masas. / Silver fir (Abies alba) decline was reported in the 1990s in the Spanish Pyrenees without a clearexplanation of its occurrence. Climatic conditions of the last part of the 20th century seem associated with the onset of the decline. In parallel with the decline process numerous reports of high incidences of pest and pathogen appeared making necessary to understand the role of the biotic factors in this process. Pyrenean forests have been used for centuries by humans, the role of management and the dynamics of this forests should also be considered when aiming to i) elucidate whether the environmental conditions, the management and the forest dynamics are associated to the fir decline in the Spanish Pyrenees, paying special attention to the role of the critical pathogens Viscum album, Armillaria, Heterobasidion annosum and Melampsorella caryophyllacearum, by means of ii) studying their epidemiology and to identify the management practices that are associated to their incidence and severity. Twenty nine randomly selected stands were measured throughout the Pyrenees. In each stand all living trees were observed for symptoms of decline and for pathogen evidences. Armillaria and H. annosum incidence in living trees was also assessed by culturing inner wood cores. Stumps and dead trees were observed for the presence of pathogen signs, and were used for assessing the past species composition of present fir stands. Up to 42 variables were measured describing the trees characteristics and the environmental conditions and the management practised in the stands. Armillaria and H. annosum samples were collected, cultured and afterwards typed by molecular techniques. Hypotheses were often tested by means of non-linear mixed models due to the lack of normality and the spatial correlation of the data. Defoliation and chlorosis were observed in 15% and 10% of trees respectively. Decline symptoms appeared more often in the dominant layer trees. No stand variables seemed associated with the decline. Silver fir basal area increases were observed coupled with pines (Pinus sylvestris and P. uncinata) basal area losses. Fir losses were mostly due to beech (Fagus sylvatica) colonisations and correlated with ungulate browsing of fir seedlings. V. album correlated with both decline and mortality of fir. V. album was found spreading easily between and within trees in pure fir stands, whilst in mixed stands seemed to find significant difficulties of spread. H. abietinum was identified in the Pyrenees and its severity on stumps was higher where cuttings had focussed more in silver fir than in other tree species. H. abietinum presence related with V. album presence and the silver fir mortality was higherwhere both species appeared together. M. caryophyllacearum was also found associated to fir decline. This rust fungus was frequent in Pyrenees and its severity appeared associated with the presence of shade tolerant plants in the understory of the stands. A. cepistipes was the most frequent Armillaria species in silver fir stands. A. ostoyae was more frequent in higher elevations and related to the increase of silver fir against other tree species. Silver fir decline incidence is relatively low and is more evident on dominant trees. Their characteristics suggest that they were those left after cuttings. V. album was the most likely pathogen implied in the decline of silver fir. Its severity could associate to the warming conditions of Pyrenees, and might be enhanced by the presence of H. abietinum in the stands. Armillaria seems to play a role in the dynamics of silver fir-pine forests. M. caryophyllacearum infection could find better infection chance in thick than in open stands. Aridity conditions of the second half of the 20th century seem to have incited the onset of decline. Management practices seem to have favoured silver fir in the Pyrenees, but also might have predisposed some trees to decline.Altogether, either the promotion of mixed stands or the reduction of the competition could betested to improve the health of these forests.

Las especies de pulgones más abundantes en los campos de maíz de Lleida sonRhopalosiphumpadi (L.), Sitobion avenas (F.) y Metopolophium dirhodum (Walker).La dinámica poblacional de los pulgones viene definida por tres fases, 1)Colonización: Desde la nascencia de las plantas de maíz hasta finales de junio esta fasey caracterizada por la presencia de las tres especies y colonias formadas por alados yninfas jóvenes. 2) Escasez de las poblaciones: Desde julio hasta mediados o finales deagosto. 3) Recuperación de las poblaciones de pulgones, con la presencia casi exclusivade R. padi.A lo largo de todo el ciclo se constató la presencia de fauna auxiliar formada enmayor número por depredadores polífagos. En las primeras semanas se contabilizanbásicamente arañas, carábidos y dermápteros, posteriormente el cultivo es colonizadopor heterópíeros, coccinélidos, neurópteros y otras especies de menor importanciarelativa (sílfidos, cecidómidos e himenópteros parasitoides).La importancia de los enemigos naturales en la dinámica de los pulgones esfundamental tal y como se demuestra en un experimento de exclusión en campo y untest de depredación en laboratorio. Esta importancia viene marcada por una presenciacontinua y abundante, por el carácter polífago de los depredadores, por la grancapacidad depredadora de algunos de ellos y por la capacidad de regular las poblacionesde pulgones.Otro elemento esencial en la evolución de las poblaciones de pulgones es latemperatura, siendo R. padi la especie más adaptada a las altas temperaturas, seguida deSLavenae y de M. dirhodum, lo que explicaría que R, padi es prácticamente la únicaespecie a partir de julio. La temperatura puede ser la responsable en mayor grado deldescenso poblacional en las últimas semanas de la primera fase de colonización de lospulgones y, sobre todo, en la fase de disminución o desaparición de las poblaciones depulgones.Las dos medidas de control estudiadas (tratamientos insecticidas al suelo ymanejo de la fecha de siembra) no parecen ser opciones idóneas para el control de lospulgones del maíz. En el primer caso por su escasa efectividad en el tiempo (máxima de8 días) y por provocar un aumento posterior de las poblaciones de pulgones, debido enparte a un efecto de los tratamientos insecticidas sobre los depredadores contabilizadosen las trampas de gravedad. En el caso del manejo de la fecha de siembra, se ha podidocomprobar que siembras tardías escapan parcialmente a la colonización de los pulgonesdel maíz, lo que podría ser interesante como medida de control de daños directosprovocados por los pulgones, pero probablemente de escasa eficacia en el caso delcontrol de las virosis transmitidas por los pulgones.

El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patógens enpostcollita de fruites i vegetals, conjuntament amb una preocupació creixent de lasocietat respecte als perills sanitaris i mediambientals que comporten els pesticides i elsseus residus, han generat un gran interès pel desenvolupament de mètodes alternatiusals productes químics de síntesi. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes antagònics s'ha presentat com una de les alternatives mésprometedores al control químic. L'esforç que la investigació dedica a aquesta àrea haincrementat d'una manera espectacular, i així s'està començant a reflexar en el nombred'agents de biocontrol disponibles en el mercat o en fase de recerca. Entre ells destacala soca CPA-1 del llevat Candida sake, aillada de la superfície de pomes en ellaboratori de Patologia del Centre UdL-IRTA. Aquesta soca ha demostrat tenir unabona capacitat antagònica enfront els principals fongs patògens en postcollita de fruitade llavor. Fins al moment, C. sake ha estat patentada a Espanya i cinc països més. Noobstant, cara a la comercialització d'aquest biofungicida és necessari obtenir unaformulació, que permeti una presentació adequada del producte, amb una alta viabilitati estabilitat en el temps i que faciliti la seva distribució i aplicació mitjançant lestécniques ja existents. Ademes, aquesta formulació ha de tenir una efectivitatcomparable a les cèl·lules fresques.L'objectiu de la present tesi ha estat l'estudi de les bases per a la formulació d'aquestagent de biocontrol. En primer lloc, es va estudiar la possibilitat de deshidratar aquestagent mitjançant la liofilització, avaluant els diferents factors que poden contribuir aincrementar la viabilitat, com el mètode de congelació i l'addició de substànciesprotectores (Capítol 3), i el medi utilitzat en la rehidratació de les cèl·lules liofilitzades(Capítol 4). També es va avaluar l'efectivitat de les cél·lules liofilitzades contraPínicillium expansion en pomes "Golden Delicious" i la seva estabilitat en condicionsd'emmagatzematge (Capítol 4). Ja que la manipulació fisiològica de les condicions decreixement pot afectar significativament la qualitat de les cél·lules i la sevacompetència ecològica, es van dur a terme estudis per avaluar l'efecte que té lamodificació de l'activitat aigua (ow) d'un medi de cultiu a base de melassa de sucre decanya en el potencial hídric de les cèl·lules (Capítol 5), en el creixement de C. sake, enl'acumulació de reserves endígenes i en la resistència a l'estrés hídric (Capítol 6).Finalment, basant-nos en aquests resultats, es va estudiar per primer cop la possibilitatde conservar les cèl·lules de C. sake en solucions líquides isotòniques (Capítol 7).Les cèl·lules de C. sake es van mostrar molt sensibles al procés de liofilització. La lleten pols desnatada, utilitzada al 10%, va presentar-se com un bon protector i va donarun producte sec porós i fàcilment rehidratable. Amb la utilització d'una solució protectora que contenia el 10% de llet en pols i el 10% de lactosa, es va aconseguiraugmentar la viabilitat de les cèl·lules fins el 40%. El medi de rehidratació també es vapresentar com un factor important per a la reactivado del llevat. Així, utilitzant el 10%de llet en pols com a medi de rehidratació enlloc de la solució amortidora de fosfat, laviabilitat va augmentar del 40 al 85%. Les cèl·lules liofòlitzades van reduir elpercentatge de podridures causades per P. expansion en pomes "Golden Delicious". Noobstant, la seva efectivitat va ser menor que la de les cél·lules fresques. La viabilitat delproducte liofòlitzat va disminuir fins el 10% després de 2 mesos de conservació a 4C.El potencial hídric de les cèl·lules crescudes en el medi a base de melassa amb awmodificada i sense modificar, va disminuir en disminuir l'aw del medi de cultiu.Ademes, aquesta modificació de l'aw del medi de cultiu va provocar un canvi en lesreserves endògenes de les cèl·lules de C. sake, sense afectar significativament el seucreixement quan l'aw del medi va ser de 0,98. Les cèl·lules crescudes durant 48 h en elmedi de melassa no modificat i els modificats a aw de 0,98 mitjançant l'addició deglicerol o NaCl, van presentar gran resistència a l'estrés hídric. Els principals solutsacumulats en les cèl·lules de C. sake quan Vaw del medi de cultiu es va reduir van ser elglicerol i l'arabitol.El medi de cultiu, el solut utilitzat per a disminuir el potencial hídric de les solucionslíquides i la temperatura de conservació, van influir en la viabilitat de C. sakeconservada en medi líquid, essent el medi de melassa no modificat i els modificats a aw0,98 amb glicerol o sorbitol els millors. S'ha aconseguit una formulació isotònica quedesprés de 7 mesos de conservació a 4C manté la seva viabilitat, i efectivitat contraP. expansion en pomes "Golden Delicious". Aquesta formulació es va preparar fentcrèixer les cèl·lules en el medi de melassa modificat amb sorbitol (aw 0,98) iconservant-les amb una solució isotònica de trealosa. / El desarrollo de resistencias a los fungicidas por parte de muchos patógenos,conjuntamente con un creciente interés social sobre los riesgos medioambientales ypara la salud que tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollode métodos alternativos a los productos químicos de síntesis. El control biológico delas enfermedades de postcosecha en fruta de pepita se ha mostrado como una de lasalternativas más prometedoras al control químico. El esfuerzo que la investigacióndedica a esta área ha incrementado de manera espectacular, y eso se está empezando areflejar en el número de agentes de biocontrol disponibles en el mercado o en fase deestudio. Entre ellos destaca la cepa CPA-1 de la levadura Candida sake aislada de lasuperfície de manzanas en el laboratorio de Patología del Centro UdL-IRTA. Esta cepaha demostrado tener gran actividad antagónica contra los principales patógenos de frutade pepita. Hasta el momento se ha patentado en España y cinco países más. Sinembargo, para su aplicación comercial, es necesario formular este agente de biocontrol,con la finalidad de presentar el producto, con una alta viabilidad y estabilidad a lo largodel tiempo y que facilite su distribución y aplicación con las técnicas ya existentes.Además, esta formulación ha de tener una efectividad comparable a la de las célulasfrescas.El objetivo de la presente tesis ha sido el estudio de las bases para la formulación deeste agente de biocontrol. En primer lugar se estudió la posibilidad de deshidratar esteagente mediante liofilización, evaluando los diferentes factores que puedan contribuir aincrementar su viabilidad, como el método de congelación y la adición de sustanciasprotectoras (Capítulo 3), y el medio utilizado para la rehidratación de las célulasliofilizadas (Capítulo 4). Se evaluó la efectividad de las células liofilizadas contraPínicillium expansion en manzanas "Golden Delicious" y su estabilidad encondiciones de almacenamiento (Capítulo 4). Como la manipulación fisiológica de lascondiciones de crecimiento pueden influir significativamente en la calidad de lascélulas y en su competencia ecológica, se llevaron a cabo estudios para evaluar elefecto que tiene la modificación de la actividad de agua (aw) de un medio de cultivo abase de melaza de azúcar de caña en el potencial hídrico de las células (Capítulo 5), enel crecimiento de C. sak�, en la acumulación de reservas endígenas y en la resistenciaal estrés hídrico (Capítulo 6). Finalmente, basándonos en estos resultados, se estudiópor primera vez la posibilidad de conservar las células de C. sak� en solucioneslíquidas isotónicas (Capítulo 7).Las células de C. sak� se mostraron muy sensibles al proceso de liofilización. La lecheen polvo desnatada utilizada al 10% se presentó como un buen protector. Además elproducto obtenido fue poroso y fácilmente rehidratable. Con la utilización de una solución protectora, que contenía el 10% de leche en polvo y el 10% de lactosa, seconsiguió aumentar la viabilidad de las células hasta el 40%. El medio de rehidratacióntambién se presentó como un factor importante para la reactivación de la levadura trassu Hofllización. Así, la viabilidad de las células de C. sake utilizando el 10% de lecheen polvo como medio de rehidratación en vez de tampón fosfato, aumentódel 40 al85%. Las células liofilizadas redujeron el porcentaje de podredumbre causado porP. expansum en manzanas "Golden Delicious". Sin embargo, su efectividad fue menorque la de las células frescas. La viabilidad del producto liofllizado disminuyó hasta el10% después de dos meses de conservación a 4C.El potencial hídrico de las células crecidas en un medio a base de melaza con awmodificada y sin modificar, disminuyó al disminuir la aw del medio de cultivo.Además, esta modificación de la aw del medio de cultivo, provocó un cambio en lasreservas endógenas de las células de C. sake sin afectar significativamente a sucrecimiento cuando la aw del medio de cultivo fue 0,98. Las células que crecierondurante 48 h en el medio de melaza no modificado y en los modificados a aw 0,98 conglicerol o NaCl presentaron una gran resistencia al estrés hídrico. Los principalessolutos acumulados en las células de C. sake cuando la aw del medio de cultivo seredujo fueron el glicerol y el arabitol.El medio de cultivo, el soluto utilizado para disminuir el potencial hídrico en lassoluciones líquidas y la temperatura de conservación, influyeron en la viabilidad deC. sake conservada en medio líquido, siendo los mejores el medio de melaza nomodificado y los modificados a aw 0,98 con glicerol o sorbito!. Se consiguió unaformulación isotónica que, después de 7 meses de conservación a 4C, mantuvo suviabilidad y efectividad contra P. expansum en manzanas "Golden Delicious". Estaformulación se preparó haciendo crecer las células en el medio de melaza modificadocon sorbitol (aw 0,98) y conservándolas con una solución isotónica de trealosa. / Biological control has emerged as the most promising alternative to chemicals incontrolling postharvest diseases of fruit and vegetables. The development of resistanceto many fungicides by major postharvest pathogens and concern for public safety havebeen the main driving force in the search for new and safer methods. The researcheffort expended in this area has increased dramatically and this is beginning to bereflected in the number of biocontrol agents available in the marketplace or in study.Among them stands out the strain CPA-1 of the yeast Candida sake, which wasisolated from the apple surface in the Pathology laboratory of the UdL-IRTA Centre.This strain has demonstrated to have antagonistic activity against the major postharvestpathogens of pome fruits. C. sake has been patented in Spain and in five othercountries. However, for commercial application, this antagonist should be formulatedin order to present the product in a usable form, with high viability, stability, safety,ease of distribution and application, and with retained biocontrol activity similar to thatof fresh cells.The objectives of the present work were to carry out fundamental and applied studiesto enable effective formulations of C. sake. Thus, dehydration of this biocontrol agentusing freeze-drying was studied. The effect of freezing method and protectants wasevaluated (Chapter 3), and the effect of rehydration media on viability examined(Chapter 4). Subsequently, the efficacy of such treatments against P�nicilliumexpansion on Golden Delicious apples, and stability of the freeze-dried C. sake cellswas also investigated (Chapter 4). Because physiological manipulation of growthconditions can significantly affect quality of cells and ecological competence studieswere carried out on the effect of different water activity (aw) treatments in molassesbasedmedia on changes in internal water potentials (Chapter 5), and on growthparameters, accumulation of endogenous reserves and water stress tolerance identified(Chapter 6). Finally, based on these studies the potential for preserving C. sake cells inisotonic solutions to conserve viability and shelf-life were evaluated for the first time(Chapter 7).C. sake cells were very sensitive to the freeze-drying process. Powdered skimmed milk(SM) used at 10% concentration was shown to give good protection to cells of C. sakeagainst freeze-drying, providing the freeze-dried product with a porous structure thatmade rehydration easier. The combination of 10% SM + 10% lactose was the bestcombination tested, with 40% of cells remaining viable after freeze-drying. Therehydration medium was shown to be a critical factor influencing the recovery ofC. sake cells. Using 10% SM as a rehydration medium instead of potassium phosphate,cell viability increased from 40 to 85%. Freeze-dried C. sake cells reduced theincidence of decay caused by P. expansum in Golden Delicious apples. However, itsefficacy was lower than that obtained with fresh cells. Stability of freeze-dried cellsdecreased during their preservation, and their viability was reduced to 10% after 2months storage at 4�C.Water potential of C. sake cells grown in molasses-based media with modified awdecreased with decreasing aw of medium. Moreover, modification of the a� of theculture medium changed the concentration of endogenous sugars and polyols withoutaffecting significantly its growth when the aw of the medium was 0.98. Cells grown for48 h in the unmodified molasses-based medium, and in those modified to 0.98 aw withthe addition of NaCl or glycerol showed high water stress resistance. The main solutesaccumulated in C. sake cells in response to lowered aw of molasses media wereglycerol and arabitol.Culture and preservation medium and temperature greatly influenced the viability ofC. sake cells in isotonic liquid solutions. Unmodified molasses medium and thosemodified to 0.98 aw with the addition of glycerol or sorbitol were shown to be the bestculture medium for cells of C. sake. This study enabled an isotonic liquid formulationof C. sake cells with retained viability and efficacy against P. expansum on GoldenDelicious apples after 7 months of storage at 4�C to be achieved. This formulation wasprepared by growing the cells in sorbitol-modified molasses medium (aw 0.98) andpreserving them in an isotonic trehalose solution.

El cor marró i la descomposició interna o llocat són dues importants alteracions fisiològiques que apareixen en la pera Blanquilla durant el període de frigoconservació. Aquests dos desordres es caracteritzen primer per l'enfosquiment del cor i després de la polpa. En el llocat aquest enfosquiment és de tipus humit i s'estén de forma ràpida a la totalitat de la polpa. En el cas del cor marró, la polpa presenta un aspecte sec i en aquesta hi ha grans i abundants cavitats.Encara es desconeixen els factors causants de l'aparició d'aquests dos desordres i els principals mecanismes bioquímics implicats en el seu desenvolupament. L'objectiu d'aquesta tesi ha estat conèixer aquests factors i caracteritzar la via o vies bioquímiques implicades en el desenvolupament del cor marró i del llocat en peres Blanquilla. Concretament, s'ha estudiat com incideixen en la seva aparició una alta concentració de CO2 i el grau de maduresa a la collita. Per a cadascuna d'aquestes condicions es va mesurar la incidència i la severitat del cor marró i del llocat, els productes i els enzims associats amb els metabolismes fermentatiu i antioxidatiu, així com el grau de peroxidació de les membranes. Finalment, es va utilitzar l'anàlisi multivariant per a caracteritzar i diferenciar aquestes dues alteracions en funció dels paràmetres esmentats. A més, amb les tècniques multivariants es pretenia complementar i confirmar els resultats interpretats bioquímicament.Les dues alteracions van aparèixer en l'atmosfera controlada (AC) d'alt contingut de CO2 però ambdues es van diferenciar en el temps d'aparició. El llocat va aparèixer aproximadament als tres mesos de conservació mentre que el cor marró es va manifestar després d'aquesta data. A més, el llocat també es va presentar en l'atmosfera de fred normal però al final del període de conservació. Els fruits conservats en AC d'alt nivell de CO2, al principi es van caracteritzar per una important disminució de l'àcid ascòrbic (AA) i, posteriorment, per un major estat de peroxidació de les membranes respecte a les altres dues atmosferes. El cor marró és conseqüència dels danys oxidatius que es donen en condicions d'alt CO2 (baix contingut d'AA i insuficient activitat dels enzims antioxidants, ascorbata peroxidasa i catalasa). En canvi, el llocat implica majoritàriament el metabolisme fermentatiu i està altament relacionat amb l'activitat de l'enzim alcohol deshidrogenasa i el contingut d'acetaldehid. També hi intervenen altres metabolismes com l'oxidatiu però en menor grau d'implicació que en el cor marró. L'anàlisi multivariant va confirmar els resultats obtinguts en l'anàlisi bioquímica: el cor marró i el llocat són dos desordres diferents que impliquen vies metabòliques similars però amb diferent grau d'implicació. Els models de predicció construïts a partir dels paràmetres de qualitat indiquen que cap d'aquests paràmetres no pot ser utilitzat com a marcador per a predir o detectar el cor marró i/o el llocat. En canvi, el contingut d'AA pot utilitzar-se com a marcador del cor marró. Aquest desordre es dóna quan s'arriba al contingut llindar d'AA que determina l'inici del desenvolupament però, aquest valor està encara per determinar en peres Blanquilla. Un avançat estat de maduresa a la collita i una atmosfera amb un alt contingut de CO2, determinen l'aparició del cor marró i incrementen les pèrdues d'AA, probablement degudes a la reducció de la seva capacitat antioxidant. / El corazón pardo y la descomposición interna son dos importantes alteraciones fisiológicas que aparecen en la pera Blanquilla durante su período de conservación. Estos dos desórdenes fisiológicos se caracterizan, primero, por un empardecimiento del corazón y, posteriormente, por el de la pulpa. En la descomposición interna este empardecimiento es de tipo húmedo y se extiende rápidamente a toda la pulpa. En cambio, en el corazón pardo los tejidos presentan un aspecto seco con grandes y abundantes cavidades en la pulpa. Se desconocen aún los factores causantes de la aparición de los dos desórdenes y los principales mecanismos bioquímicos implicados en su desarrollo. El objetivo de esta tesis ha sido conocer estos factores, así como caracterizar la vía o vías bioquímicas implicadas en el desarrollo del corazón pardo y de la descomposición interna en peras Blanquilla. Concretamente, se ha estudiado cómo inciden en su aparición una alta concentración de CO2 y el grado de madurez a la cosecha. Para cada una de estas condiciones se determinó la incidencia y la severidad de cada alteración, los productos y las enzimas asociadas con el metabolismo fermentativo y antioxidativo, así como el grado de peroxidación de las membranas. Finalmente, se utilizó el análisis multivariante para caracterizar y diferenciar las dos alteraciones en función de los parámetros citados. Además, con las técnicas multivariantes se pretendía complementar y caracterizar los resultados interpretados bioquímicamente. Las dos alteraciones aparecieron en la atmósfera controlada (AC) de alto nivel de CO2, pero se diferenciaron en el tiempo de aparición. La descomposición interna apareció aproximadamente a los tres meses de conservación, mientras que el corazón pardo se manifestó con posterioridad a esta fecha. Además, la descomposición interna también se presentó en la atmósfera de frío normal, pero al final del período de conservación. Losfrutos conservadoss en la AC de alto nivel de CO2, al principio se caracterizaron por una importante disminución del ácido ascórbico (AA) y, posteriormente, por un mayor estado de peroxidación de las membranas respecto a las otras dos atmósferas. El corazón pardo es consecuencia de los daños oxidativos que se dan en condiciones de alto CO2 (bajo contenido de AA e insuficiente actividad de las enzimas antioxidantes, ascorbata peroxidasa y catalasa). En cambio, la descomposición interna está altamente relacionada con la enzima alcohol deshidrogenasa y el contenido de acetaldehido y, por tanto, implica mayoritariamente el metabolismo fermentativo. Además, en su desarrollo intervienen otros metabolismos, como el oxidativo, pero en menor grado que en el corazón pardo. El análisis multivariante confirmó los resultados obtenidos en el análisis bioquímico: que el corazón pardo y la descomposición interna son dos desórdenes fisiológicos distintos que implican vías metabólicas similares, pero con diferente grado de implicación. Los modelos de predicción construídos a partir de los parámetros de calidad indican que ninguno de estos parámetros puede utilitzarse como marcador para predecir y/o detectar ni el corazón pardo ni la descomposición interna. En cambio, el contenido de AA sí puede utilizarse como marcador del corazón pardo. Esta alteración se manifiesta cuando el contenido de AA disminuye por debajo de un determinado nivel, valor que en peras Blanquilla aún está por determinar. Un avanzado estado de madurez a la cosecha y una AC de alto contenido de CO2 determinan la aparición del corazón pardo e incrementan las pérdidas de AA, probablemente debidas a la reducción de su capacidad antioxidante. / Brown heart and core browning are two important post harvest disorders that occur in Blanquilla pear during storage. These two disorders are characterised by browning first the core and later the flesh. Core browning appears as brown areas in the mid-cortex of the flesh and the lesions subsequently tend to extend and may affect the entire pulp. In the case of brown heart, the tissue is dry and large and/or numerous cavities are formed in the pulp. The factors and the underlying biochemical mechanisms involved in the development of these disorders remain unclear. The aim of this thesis was to determine and characterise the biochemical pathways involved in the development of brown heart and core browning in Blanquilla pears. More exactly, we studied the effects of high CO2 concentration and harvest date on the disorders incidence. For each condition, the incidence and the damage percentage for each kind of disorder was correlated with the products and the enzymes involved in fermentative and oxidative metabolism. Multivariate analysis was used to characterise and differentiate the two disorders and was used to complement and confirm the biochemical results. Core browning and brown heart were observed when the fruits were stored at high CO2 concentration but appeared at different time. Core browning appeared first, after 3 months of storage and brown heart later. Fruits kept in air developed core browning but at the final of storage. Fruits stored at high CO2 concentration, exhibited first an important decrease in ascorbate level (AA), and later lipid peroxidation. Brown heart is the consequence of oxidative damage which appeared at high CO2 (low level of ascorbate and insuficient activity of antioxidants enzymes, ascorbate peroxidase and catalase). In contrast, core browning correlated with alcohol deshidrogenase activity and acetaldehyde content, a result that showed that fermentation is probably an underlying metabolism in the core browning incidence. Oxidative process could also be involved in core browning, but to a lesser extent than in brown heart. Multivariate analysis confirm these biochemical results and indicate that core browning and brown heart are two different disorders involving similar metabolic pathways but at a different level. According to the prediction model obtained using quality parameters, we conclude that none of these parameters may predict brown heart and core browning disorders. However, the AA level can be a marker of brown heart. This disorder is initiated when an AA dropped below a certain threshold, which remain to be determined in Blanquilla pears. Advanced maturity of fruits at harvest and storage in high CO2 determine the appearance of brown heart and increase the loss of AA, perhaps through a reduction in antioxidant capacity.

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Es van mostrejar volàtils de pomera i noguer emesos per branques intactes en camp, rodejadesper bosses de plàstic, al matí i al crepuscle en diferents moments de la campanya. Aquestes mostres esvan analitzar per cromatografia de gasos-espectrometria de masses (GC-MS) i cromatografia de gasoselectroantenodetecció(GC-EAD) fent servir antenes de mascles de Cydia pomonella. Es van detectar 44compostos en pomera i 90 en noguer per mitjà de la GC-MS. Les emissions d'ambdues espècies vanvariar clarament, tant quantitativament com qualitativa. Els compostos alifàtics eren majoritaris en lesemissions de pomera, mentre les terpens ho eren a les de noguer. Es va trobar activitat EAD per 5compostos a les mostres de pomera i 10 a les de noguer. Posteriors proves d'electroantenografia (EAG)amb mascles i femelles van revelar una forta activitat EAG per nombrosos volàtils emesos per pomera.En aquests assajos la resposta dels mascles va ser sempre igual o superior a la de les femelles, excepte pelβ-mircè. Entre els compostos actius en les anàlisis de GC-EAD, el butanoat d'hexil era específic depomera, 3 compostos eren específics de noguer (al·loocimè, pinocarvona, i òxid de cariofil·lè) i la restaeren comuns entre ambdues espècies de planta. La 2-ciclopentilciclopentanona, un compost emès per lesbosses de plàstic, també va provocar intenses respostes EAG en antenes d'ambdós sexes.El (E,Z)-2,4-decadienoat d'etil (èster de pera), i el (E)-β-farnesè van ser completament atraientsen camp, però no van estimular contactes amb la font en túnel de vent, suggerint que d'altres estímulssensitius estan relacionats amb el seu funcionament en camp. La preexposició a la feromona sexual,(E,E)-8,10-dodecadien-1-ol, va disminuir la resposta dels mascles a aquesta en túnel de vent, però vaincrementar la resposta a l'èster de pera; i no va tenir cap efecte sobre les femelles. De forma semblant,les captures en camp amb èster de pera van ser superiors sota confusió sexual. L'èster de pera va actuarcom antagonista de la feromona sexual en barrejar-se a altes quantitats. No obstant, l'antagonisme vadesaparèixer en presentar ambdós compostos en septes separats; i els mascles van ser incapaços dediscriminar entre la feromona sexual sola i la barreja antagonista quan ambdues es van oferir una al costatde l'altra.Assajos d'oviposició i aparellament van demostrar que la temperatura modula el moment del díaen que aquests comportaments tenen lloc. En camp, l'oviposició es va avançar a temperatures baixes; i vaser màxima al 3r i 4t dies de vida. En laboratori, l'oviposició també es va avançar a temperatures mésbaixes, però per la majoria de temperatures assajades, el pic d'oviposició va tenir lloc durant la primerahora de l'escotofase. A 12ºC no hi va haver oviposició, i la fecunditat va ser màxima a 22 i 27ºC. Per undia determinat. L'activitat diària d'aparellament tenia lloc abans que la d'oviposició.Paraules clau: Cydia pomonella, volàtils de planta hoste, comportament, EAG, GC-EAD, GC-MS,Lepidoptera, Tortricidae, preexposició a la feromona, èster de pera, (E)-β-farnesè, vol orientat, feromonasexual, noguer, pomera, variació diària, temperatura, activitat diària, intensitat lumínica. / Se recogieron colecciones de volátiles de manzano y de nogal emitidos por ramas intactas encampo, con hojas y frutos, rodeadas por bolsas de plástico, por la mañana y en el crepúsculo en diferentesmomentos de la campaña. Estas muestras se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometríade masas (GC-MS) y cromatografía de gases-electroantenodetección (GC-EAD) usando antenas demachos de Cydia pomonella. Se detectaron 44 compuestos en manzano y 90 en nogal por GC-MS. Lasemisiones de ambas especies variaron ampliamente, tanto cuantitativa como cualitativamente. Loscompuestos alifáticos fueron mayoritarios en las emisiones de manzano, mientras que los terpenos lofueron en las de nogal. Se observaron variaciones entre periodos tanto para la campaña como para el día.Se encontró actividad EAD para 5 compuestos en las muestras de manzano y 10 en las de nogal.Posteriores pruebas de electroantenografía (EAG) con machos y hembras revelaron una fuerte actividadEAG para múltiples volátiles emitidos por manzano. En estos ensayos la respuesta de los machos fuesiempre igual o superior a la de las hembras, con la excepción del β-mirceno. Entre los compuestosactivos en los análisis de GC-EAD, el butanoato de hexilo fue específico de manzano, 3 compuestosfueron específicos de nogal (aloocimeno, pinocarvona, y óxido de cariofileno) y los restantes erancompartidos por ambas especies de planta. 2-Ciclopentilciclopentanona, un compuesto emitido por lasbolsas de plástico, también provocó intensas respuestas EAG en antenas de ambos sexos.(E,Z)-2,4-Decadienoato de etilo (éster de pera), y (E)-β-farneseno fueron completamenteatrayentes en campo, pero no provocaron contactos con la fuente en túnel de viento, sugiriendo que otrosestímulos sensoriales están relacionados con su funcionamiento en campo. La preexposición a laferomona sexual, (E,E)-8,10-dodecadien-1-ol, disminuyó la respuesta a ella de machos en túnel de viento,pero incrementó la respuesta al éster de pera; y no tuvo efecto alguno sobre las hembras. De formasimilar, las capturas en campo con éster de pera fueron superiores en confusión sexual. El éster de peraactuó como antagonista de la feromona sexual al mezclarlo con ésta en cantidades elevadas. No obstante,el antagonismo desapareció cuando ambos compuestos se presentaban en septos separados; y los machosno discriminaron entre la feromona sexual sola y la mezcla antagonista cuando ambas se ofrecieron una allado de la otra.Los ensayos de oviposición y apareamiento demostraron que la temperatura modula el momentodel día en que estos comportamientos tienen lugar. En campo, la oviposición se avanzó a temperaturasmás bajas; y fue máxima en el 3º y 4º días de vida. En laboratorio, la oviposición también se avanzó contemperaturas más bajas, pero para la mayoría de temperaturas ensayadas, el pico de oviposición tuvolugar durante la primera hora de la escotofase. A 12ºC no hubo oviposición, y la fecundidad fue máxima a22 y 27ºC. Para un día determinado. La actividad diaria de apareamiento tenía lugar antes que la deoviposición.Palabras clave: Cydia pomonella, volátiles de planta huésped, comportamiento, EAG, GC-EAD, GCMS,Lepidoptera, Tortricidae, preexposición a la feromona, éster de pera, (E)-β-farneseno, vueloorientado, feromona sexual, nogal, manzano, variación diaria, temperatura, actividad diaria, intensidadlumínica. / Volatile compounds from apple and walnut trees were collected in the field from attachedbranches, bearing leaves and fruits, enclosed in plastic bags in the morning and at dusk, in differentperiods of the season. Collections were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS),and gas chromatography-electroantennodetection (GC-EAD) using antennae of male Cydia pomonella.Forty four compounds in apple and 90 in walnut were detected by GC-MS. Emissions of both plantspecies widely differed both qualitatively and quantitatively. Apple emissions were dominated byaliphatic compounds, whereas walnut ones by terpenes. Diel and seasonal variations were found inemissions of both plant species. GC-EAD revealed activity for 5 compounds in apple collections and 10in walnut ones. Further electroantennographic (EAG) analyses with males and females revealed importantEAG-activity for many other volatiles emitted by apple. In these analyses male responses were equal to orhigher than those of female for all compounds, except for β-myrcene. Amongst the EAD-activecompounds in the GC-EAD analyses, hexyl butanoate was apple-specific, 3 compounds were walnutspecific(alloocimene, pinocarrvone, and caryophyllene oxide), and the remaining were shared by bothplant species. 2-Cyclopentylcyclopentanone, a compound emitted by the plastic bags, also elicited strongEAG responses in antennae of both sexes.Ethyl (E,Z)-2,4-decadienoate (pear ester), and (E)-β-farnesene were fully attractive for C.pomonella in field trapping. However, they did not elicit source contacts in wind tunnel, suggesting thatother sensory cues are involved in their field attractiveness. Pre-exposure to the sex pheromone, (E,E)-8,10-dodecadien-1-ol (codlemone), decreased male upwind flight to itself in wind tunnel, but increasedpear ester attractiveness; and had no effect on females. Similarly, trap captures with pear ester were foundto increase under mating disruption. Pear ester acted as a codlemone antagonist when blended at largeamounts. However, this effect disappeared when both compounds were loaded onto different septa; andmales were unable to discriminate amongst codlemone and the antagonistic blend when offered side-byside.Oviposition and mating assays showed that C. pomonella diel oviposition and mating timings aremodulated by temperature. In the field, oviposition activity was advanced by lower temperatures; and wasmaximum in the 3rd and 4th days of life. In the laboratory, oviposition was also advanced by lowertemperatures, but for most of the assayed temperatures it peaked in the first hour of the scotophase.Oviposition did not take place at 12ºC, and fecundity was maximum at 22 and 27ºC. Mating activityoccurred before than oviposition activity in a given day.Keywords: Cydia pomonella, host-plant volatiles, behavior, EAG, GC-EAD, GC-MS, Lepidoptera,Tortricidae, pheromone pre-exposure, pear ester, (E)-β-farnesene, upwind flight, sex pheromone, walnut,apple, diel variation, temperature, diel activity, light intensity.

Desde 1988, año en que se descubrieron las fumonisinas, toxinas de origen füngicoproducidas básicamente por especies del género Fusarium, numerosos estudiostoxicológicos han puesto de manifiesto su implicación en la problemática para la saludanimal que se deriva del consumo de piensos y otros productos agrícolas contaminados porFusarium sección Liseola por parte del ganado. Asimismo, se ha llegado a asociar de algunamanera el consumo directo de maíz contaminado, con el desencadenamiento de cánceresofágico en humanos, sin embargo la relación causa-efecto no ha sido demostrada.Si bien la contaminación masiva de materias primas por fumonisinas por lo general se asociaa países subdesarrollados del continente africano, asiático y Sudamérica, estudios deincidencia llevados a cabo en otros muchos países han demostrado que en mayor o menorcantidad, las fumonisinas se hallan presentes en la mayoría de muestras de maíz paraalimentación animal ensayadas. Este hecho ha dado lugar a la proliferación de estudios detodo tipo, dentro de los cuales se enmarca esta tesis, encaminados a dilucidar en quémomento y bajo qué condiciones se producen estas micotoxinas.Los objetivos de la presente tesis han sido en primer lugar, determinar el impacto que, la aw,la temperatura y los conservantes químicos, como factores abióticos, ejercen sobre lagerminación, crecimiento y producción de FB] por F. monili/orme y F. proliferatum enmaíz. En segundo lugar se ha determinado el efecto de las interacciones rungicas, es decir,cómo influyen cepas füngicas propias del maíz sobre el desarrollo y producción de FB] porlas cepas de Fusarium, y su relación con el resto de factores abióticos. Posteriormente, a lavista de estos resultados, se ha pasado a evaluar el potencial que la manipulación de losfactores abióticos puede tener como sistema de control del grano almacenado. Por último, sehan ensayado la cuantificación de la producción de enzimas hidrolíticos por Fusariumsección Liseola, como método alternativo de detección de su presencia en grano, así como ladeterminación del valor calórico del grano contaminado por estas mismas cepas, comométodo alternativo de cuantificación de la pérdida de calidad del grano.Se ha demostrado que a pesar de que las cepas de Fusarium son capaces de crecer endiferentes substratos, la producción masiva de fumonisinas únicamente se da en el maíz. Seha visto que sobre este cereal la germinación de estas cepas es posible entre 5 y 37°C y a awà 0,88, el intervalo se estrecha ligeramente para el crecimiento (7-37°C, arw ä 0,90), y porúltimo, y lo que es más importante, la producción de FBt solo es posible entre 10 y 37°C y aaw > 0,93, con las consecuencias que este dato reporta desde el punto de vista del control enmaíz y productos derivados. Se ha demostrado que los conservantes a base de propionatosexistentes en el mercado son útiles para el control del crecimiento de Fusaríum spp. in situ,pero para el control de la producción de FBi sólo es eficaz a concentraciones > 0,07%.La presencia de otras cepas füngicas en cultivos mixtos, en general, inhibió el desarrollo deFusarium, siendo A. flaws y A. niger las especies que causaron mayor impacto. Su efecto,sin embargo, dependió de los factores abióticos involucrados. En general, las especies deFusarium compitieron con éxito a aw altas, y mejor a temperaturas cercanas a los 15°C. Sinembargo, se observó que a a^ altas, la producción de FBi podía verse potenciada pordeterminadas especies, principalmente A. niger.Finalmente, además de la determinación de fumonisinas en materias primas, se ha visto quela monitorización de la actividad enzimàtica en el grano, y de la pérdida de valor calórico delmismo pueden ser buenos índices de la infección del grano por Fusarium. +En conclusión, de la presente tesis se deriva que, en condiciones normales, el control de lacontaminación por fumonisinas del grano en post-cosecha puede llevarse a cabo con éxitopor el simple control de la ÜTW; en esta etapa la flora acompañante puede incluso actuar comofactor adicional de control. Sin embargo, cabe resaltar que a partir de estos mismosresultados se puede deducir que la presencia de fumonisinas en maíz puede ser ya muy altaen el campo, y que años lluviosos puedan provocar niveles altos de las mismas antes delsecado.

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El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patògens enpostcollita de fruita i vegetals, una manca d'adequats substituts pels fungicides iuna preocupació creixent de la societat respecte als perills sanitaris imediambientals que comporten els pesticides i els seus residus, han generat ungran interès pel desenvolupament de mètodes alternatius, efectius però mésrespectuosos amb el medi ambient. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes ha sorgit com una de les alternatives més prometedores. La socaCPA-1 del llevat Candida sake, el qual s'ha aïllat de la superfície de,mançanes alnostre laboratori, ha demostrat tenir una bona capacitat antagònica enfront elsprincipals fongs patògens en postcollita de fruita de llavor. L'aplicaciód'antagonistes en precollita per controlar les malalties de la fruita de llavor enpostcollita podria ser un mètode avantatjós ja que podria prevenir infeccionslatents, permetria una menor manipulació de la fruita i disminuiria potencialmentels danys i ferides que es donen durant qualsevol dels tractaments de postcollita.Així mateix, es reduiria el període entre la collita i l'emmagatzemament en fred is'evitaria la contaminació addicional per patògens que suposa el tractament químicde la fruita en el "drencher". No obstant, fins ara l'aplicació d'agents de biocontrolen el camp s'ha vist limitada per la sensibilitat que aquests tenen a l'estrèsmediambiental, ja que els microorganismes tenen uns intervals de creixement moltlimitats tant pel que fa a la temperatura com a la humitat.Els objectius del present estudi han estat la determinació de la dinàmicapoblacional de la microflora natural de les mançanes "Golden Delicious" durantdiferents estadis de desenvolupament (Capítol 2), durant la conservació en fred idurant el període de simulació de la comercialització o "shelf life" de la fruita, iavaluar l'efecte que té el tractament amb C. sake en la microflora pròpia de lesmançanes (Capitol 3). D'altra banda, volia avaluar-se el potencial pràctic de lautilització de l'antagonista al camp per aconseguir un bon control de l'agentcausant de la principal malaltia en postcollita de mançanes, Pénicillium expansum(Capitol 4). Tantmateix, els estudis detallats sobre l'ecofisiologia de C. sake hanpermès identificar mètodes per millorar la tolerància de les cèl·lules a l'estrèsmediambiental, la seva viabilitat i adaptació (Capítols 5 i 6); i, mitjançant lamanipulació del contingut de les reserves endògenes acumulades, millorar elcreixement en el camp i aconseguir un bon nivell de biocontrol de la podriduracausada per Pénicillium mitjançant el tractament a camp (Capítol 6).La població microbiana total va variar segons l'estat de desenvolupament del fruit,així com també amb les condicions climàtiques. La microflora predominant en lesmançanes durant el seu desenvolupament van ser les floridures Cladosporium,Alternaria spp. i els llevats blancs. D'altra banda, les floridures patògenes mésimportants en postcollita, P. expansum i Botrytis cinérea, rarament es van aïllardurant el desenvolupament del fruit. En canvi, la presència del gènere Pénicilliumen les mançanes va esdevenir important durant la seva conservació en fred i durantel període de "shelf life" després de la conservació. La població bacteriana va sermàxima a l'estadi de borró i va disminuir durant el període de desenvolupamentdel fruit, essent rarament aïllades durant la collita i la conservació en fred.L'aplicació de C. sake en mançanes, dos dies abans de la collita, va reduirsignificativament la població de Cladosporium i Pénicillium spp. al final de laconservació en fred i durant el període de simulació de la comercialització. Noobstant, l'aplicació del llevat antagonista en precollita, en mançanes foradades iinoculades artificialment va resultar menys efectiva contra la podridura perP. expansum que el tractament en postcollita amb C. saké. La població del'antagonista aplicada en precollita sobre mançanes "Golden Delicious" i ambdanys artificials, disminueix abans i més ràpidament que quan es tracta enpostcollita. Es fa necessària doncs, més recerca per entendre la raó per la qual esdóna aquesta supervivència més baixa de C. sake quan s'aplica en precollita idesprés s'emmagatzema en fred.Es van dur a terme estudis detallats d'ecologia i fisiologia de C. sake per aidentificar l'efecte de l'activitat d'aigua (ow), temperatura, pH i la seva interaccióen el seu creixement per així identificar els seus límits de creixementmediambientals. Es va trobar que les condicions mediambientals en les que l'agentde biocontrol pot desenvolupar-se estan limitades per una aw mínima entre 0.90 i0.92. C. sake va resultar tolerant a un ampli rang de pH (entre 3 i 7),independentment de l'aw i la temperatura.Els polihidroxialcohols i els sucres que es van acumular en major proporció en lescèl·lules de C. sake crescudes en medi basal no modificat (NYDB) van ser arabitol,trealosa i glucosa, amb petites quantitats de glicerol i eritritol. En experimentsin vitro, el creixement de C. sake en medi amb aw reduïda (0.96) va resultar en unamodificació d'aquestes reserves endògenes i una millora de la viabilitat a baixaowquan es compara amb cèl·lules no modificades. En assaigs de laboratori, lescèl·lules de C. sake modificades van mantenir la seva efectivitat i fins i tot la vanmillorar enfront la podridura causada per P. expansum en mançanes "GoldenDelicious". En assaigs de camp, però, no es van observar millores significatives enel control de la podridura per P. expansum en postcollita de mançanes foradadesartificialment i infectades quan comparem cèl·lules no modificades i cèl·lulestolerants a aw baixes. Immediatament després de l'aplicació de l'antagonista enprecollita, es va observar que les cèl·lules no modificades es van adherir millor a lasuperfície de la poma que no pas les modificades. No obstant, després d'unes horessota condicions de camp, la població de cèl·lules aw-tolerants va augmentarsignificativament, mentre que la població de cèl·lules no modificades va romandreconstant. És possible que els requeriments energètics per a la producció d'elevadesconcentracions de reserves endògenes puguin resultar en una modificació de laconcentració o característiques de la matriu extracel.lular del llevat.Probablementuna millora de l'adherència de les cèl·lules modificades podria donar lloc amillores en l'efectivitat.Així doncs, aquest enfoc es presenta com una via interessant per a poderaconseguir alguns avantatges en la formulació dels antagonistes, intentant fer-losmés tolerants a baixes aw permetent-los-hi així, un establiment més efectiu al camp,conservant l'eficàcia com a agents de biocontrol. En aquest aspecte, l'estudi vademostrar que existeix un gran potencial per a la utilització de mitjansecofisiològics que millorin l'adaptació ecològica dels agents de biocontrol aplicatsal camp. / El desarrollo de resistencia a los fungicidas por parte de muchos patógenos depostcosecha de frutas y vegetales, la falta de substitutos adecuados a losfungicidas, y el creciente interés social sobre los peligros ambientales y de saludque tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo demétodos de control alternativos que sean ambientalmente más favorables. Elcontrol biológico empleando microorganismos ha surgido como una de lasalternativas más prometedoras. La levadura Candida sake (cepa CPA-1), aislada ennuestro laboratorio a partir de manzanas, ha demostrado tener actividad antagónicafrente a los principales patógenos de postcosecha en fruta de pepita. Su aplicaciónen precosecha para el control de las enfermedades presentes en fruta de pepita enpostcosecha sería beneficiosa por varias razones. En primer lugar conseguiríamosuna prevención de infecciones latentes, además se requeriría una menormanipulación de la fruta y disminuiría la posibilidad de daños y heridas durante lostratamientos de postcosecha. Los períodos de tiempo entre la cosecha y laconservación en frío se reducirían y finalmente se evitaría la contaminaciónadicional debida a patógenos fúngicos procedentes de los tratamientos químicos dela fruta en el "drencher". Sin embargo, la aplicación de agentes de biocontrol encampo se ve limitada por la sensibilidad de los microorganismos al estrésambiental, especialmente a la humedad relativa y a la temperatura.Los objetivos del presente estudio han sido, la determinación de la dinámica depoblación microbiana propia de las manzanas "Golden Delicious" a lo largo de lasdiferentes fases de su crecimiento (Capítulo 2), durante la conservación en frío y elperíodo de vida útil o "shelf life", y la evaluación del efecto del tratamiento deC. sake sobre la microflora natural (Capítulo 3) . También se han llevado a caboestudios de la aplicabilidad del agente de biocontrol en precosecha; para ello serealizaron inoculaciones en campo del antagonista con el fin de lograr un controladecuado del agente causal de la principal enfermedad de postcosecha demanzanas, P. expansum (Capítulo 4). Los estudios detallados de la ecofisiología deC. sake han fijado los métodos para mejorar la tolerancia de las células al estrésambiental, su viabilidad y adaptación ecológica (Capítulos 5, 6) y, mediantemanipulación del contenido de azúcares y polialcoholes intracelulares, el aumentode su crecimiento en campo y el mantenimiento del biocontrol de la podredumbrede Pénicillium en el tratamiento en precosecha (Capítulo 7).Se ha encontrado que la población microbiana total varía con el estado dedesarrollo de la fruta y con las condiciones climáticas. La flora predominantedurante el desarrollo de las manzanas fueron los mohos filamentososCladosporium y Alternaria spp. y las levaduras blancas. Sin embargo, los patógenos más importantes en postcosecha, P. expanswn y Botrytis cinérea,raramente fueron aislados de manzanas durante los diferentes estadios dedesarrollo. Por el contrario, la presencia del género Pénicillium llegó a serimportante en las manzanas durante las etapas finales de la conservación en frío yen el período de "shelf life". La población bacteriana fue máxima en el estadio deyema y disminuyó durante el período de desarrollo de las manzanas, aislándoseraramente en el momento de la cosecha y durante la conservación en frío. Laaplicación en precosecha de C. saké a las manzanas dos días antes de surecolección disminuyó significativamente las poblaciones de Cladosporium yPénicillium spp. al final de las condiciones de conservación en frío y durante elperíodo de vida útil ambiental. Sin embargo, la aplicación en precosecha de lalevadura antagonista fue menos efectiva contra la podredumbre de Pénicillium enmanzanas artificialmente heridas e inoculadas que el tratamiento de postcosechacon C. sake. Las poblaciones de C. sake aplicada en precosecha sobre manzanas"Golden Delicious" y con daños artificiales, disminuyen antes y más rápidamenteque cuando el tratamiento es en postcosecha. Por esta razón se necesita unainvestigación adicional que permita entender por qué C. sake presenta una menorsupervivencia cuando la aplicación se realiza en precosecha y posteriorconservación en frío. Para ello, se llevaron a cabo estudios de la ecología yfisiología de C. sake con el fin de determinar el efecto de la actividad de agua (a .),temperatura, pH y su interacción en el crecimiento del microorganismo, y poder asífijar los límites ambientales del antagonista. Se encontró que las condicionesambientales en las cuales este agente de biocontrol crece efectivamente estabanlimitadas por una aw entre 0.90 - 0.92. C. sake fue tolerante a un amplio intervalode pH (3-7), independientemente de la temperatura y de la aw.Los principales polihidroxialcoholes y los azúcares intracelulares acumulados enC. sake crecida en un medio base no modificado (NYDB) fueron el arabitol, latrealosa y la glucosa junto con pequeñas cantidades de glicerol y eritritol. Enexperiencias in vitro la producción de C. sake en un medio con aw reducida (0.96)dio como resultado una modificación significativa de estas reservas endógenas yuna mejora en la viabilidad a baja aw, comparada con células no modificadas. Elbiocontrol de P. expansum en .manzanas "Golden Delicious" se mantuvo con esteinoculo modificado tolerante a baja a , y en algunos casos, incluso fue mejor enensayos de laboratorio. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas en elbiocontrol en postcosecha de la podredumbre de P. expansum en manzanasartificialmente heridas e inoculadas en ensayos de campo con células de C. sake« .-tolerantes y no modificadas. Inmediatamente después de la aplicación enprecosecha del antagonista se observó una mejor adherencia a la superficie de lamanzana de las células de levadura no modificadas frente a las del inoculo modificado. No obstante, después de unas pocas horas en condiciones de campolas poblaciones del inoculo aw-tolerantes aumentaron significativamente, mientrasque las poblaciones del tratamiento no modificado permanecieron sin cambios.Estos resultados nos hacen pensar que la energía necesaria para la producción dealtas concentraciones de reservas endógenas pueda producir una modificación dela concentración o características de la matriz extracelular de la levadura.Probablemente una mejora en la adherencia de las células modificadas podríatraducirse en una mayor efectividad.Así pues, algunas de estas ventajas ecológicas deberían ser aprovechadas en laformulación del inoculo tolerante a aw bajas para de esta forma lograr unaestabilidad más efectiva en el campo, conservando su eficacia en el biocontrol.Este aspecto del estudio demostró que el empleo de medios ecofisiológicos paramejorar la adaptación ecológica de los agentes de biocontrol y para su aplicaciónen campo es altamente prometedora, y que ésto podría tener un profundo impactoen el desarrollo de agentes de control biológico efectivos en precosecha. / The development of resistance to fungicides by many postharvest pathogens offruits and vegetables, a lack of adequate fungicide replacements, and growingpublic concern over health and environmental hazards from pesticides, havetogether generated new interest in the development of alternative moreenvironmentally friendly control methods. Biological control usingmicroorganisms has emerged as one of the most promising alternatives. The yeastCandida sake (strain CPA-1), which was isolated from the apple surface in ourlaboratory, has been demonstrated to have antagonistic activity against the majorpostharvest pathogens of pome fruits. Preharvest antagonist application forpostharvest control of pome fruit diseases would be advantageous as latentinfections may be prevented, less fruit manipulation would be required, and itwould decrease the potential for damage and injuries during any postharvesttreatments. The time periods between harvest and cold storage would be reducedand additional contamination by pathogenic fungi from drenching solutions usedduring chemical treatments would be avoided. However, application of biocontrolagents in the field has been limited by sensitivity to environmental stressesincluding a narrow relative humidity and temperature range.The aims of the present study were to determine the microbial population dynamicson Golden Delicious apples during different developmental stages (Chapter 2),during cold storage and the ambient shelf-life period, and evaluate the effect ofC. sake treatment on the resident microflora (Chapter 3). Studies of the practicalpotential of using field inoculation of the antagonist to achieve good control theresponsible agent of the major postharvest disease of apples in Spain, Pénicilliumexpansum, was investigated (Chapter 4). Detailed studies of the ecophysiology ofC. sake identified methods for improving the environmental stress tolerance ofcells, their viability and ecological fitness (Chapters 5, 6); and by manipulation ofintracellular sugar alcohol and sugar content, to enhance growth in the field andconserve biocontrol of Pénicillium rot by field treatment (Chapter 7).Total microbial populations were found to vary with development stage, and withprevailing climatic conditions. The predominant mycoflora on apples duringdevelopment were the filamentous fungi Cladosporium mú Alternaria spp. andwhite yeasts. However, the most important postharvest pathogens/1, expansum andBotrytis cinérea were seldom isolated from ripening apples. On the contrary, thepresence of the Pénicillium genus became important on apples during later coldstorage and ambient shelf-life period. Bacterial populations were maximum at thebud stage and decreased during the development period of apples, isolated at harvest and during cold storage. Preharvest application of C. sake toapples two days before harvest significantly decreased populations ofCladosporium and Pénicillium spp. by the end of cold storage conditions andduring ambient shelf-life period. However, preharvest application of theantagonistic yeast was less effective against Pénicillium rot in artificiallyinoculated and wounded apples than postharvest treatment with C. sake. C, sakepopulations decreased faster after preharvest application than when appliedpostharvest during subsequent cold storage. Further research was thus needed tounderstand the reason for the lower survival of C. sake, when applied preharvestduring subsequent cold storage. Detailed studies were carried out on the ecologyand physiology of C. sake to identify the effect water activity (aw), temperature, pHand their interaction on growth and identify environmental limits of the antagonist.The environmental niche within which this biocontrol agent will effectively growwas found to be limited by about 0.90-0.92 aw. C. sake was tolerant of a wide rangeof pH levels (3-7) regardless of aw and temperature. The major intracellularpolyols/sugars accumulated in C. sake cells grown on unmodified basal medium(NYDB) were arabitol, trehalose and glucose with small amounts of glycerol anderythritol. Production of C. sake in reduced aw media (0.96) resulted in asignificant modification of these endogenous reserves and an improvement inviability at lowered aw when compared to unmodified cells in in vitro experiments.Biocontrol of P. expansum on Golden Delicious apples by these modified low owtolerantinocula was maintained, and in some cases improved in laboratory assays.However, no significant improvements were observed in postharvest biocontrol ofP. expansum rot in apples artificially wounded and infected in field trials with tocompare unmodified and aw-tolerant cells of C. sake. Immediately after preharvestapplication of the antagonist it was notable that unmodified yeast cells adheredbetter to the apple surfaces than the modified inocula. However, after a few hoursunder field conditions populations of the ow-tolerant inocula increasedsignificantly, while those of unmodified treatment populations remainedunchanged. It is also possible that the energy requirements for the production ofhigh concentrations of endogenous reserves could result in a modification of theconcentration or characteristics of the matrix. Some ecological advantages may begained in formulating low-aw tolerant inocula for more effective establishment inthe field, while conserving biocontrol efficacy. This aspect of the studydemonstrated that great potential exists for using ecophysiological means forimproving the ecological fitness of biocontrol agents applied in the field, and thiscould have a profound impact on the development of effective preharvestbiological control agents for use in the field.