O uso da XML (Extensible Markup Language) em aplicações envolvendo bancos de dados vem se consolidando nos últimos dois anos. Os principais sistemas de gerenciamento de banco de dados já incorporam essa tecnologia em suas mais recentes versões. Dentre diversas aplicações destaca-se a publicação de dados relacionais em visões XML. Diferentemente da XML, o Modelo Temporal de Versões (TVM) não apresenta suporte entre os bancos de dados atuais. Esse modelo, que une características temporais com o conceito de versão para projetar aplicações orientadas a objetos, precisa ser mapeado para ser adequadamente controlado em um SGBD (Sistema de Gerenciamento de Banco de Dados). Cumprida essa etapa, aplicações do TVM também podem gerar visões XML. Nesse trabalho é inicialmente apresentada uma forma de representar instâncias de aplicações do TVM em um formato XML. Os documentos definidos a partir desse formato de representação são utilizados como base para consultas. Em seguida, é proposta uma extensão de uma linguagem de consulta XML visando proporcionar recursos para a recuperação de informações temporais e de versão representadas em documentos XML. São definidas funções temporais e versionadas que são incorporadas à linguagem base. O funcionamento das funções e a especificação de consultas temporais versionadas são descritos em detalhes no decorrer do trabalho. Uma ferramenta que implementa a linguagem base é utilizada na realização de testes visando validar as novas funções. / The use of the XML in applications involving databases has grown in the last two years. Recent versions of the main database management systems already incorporate this technology. Publishing relational data in XML can be identified as one of the different applications of XML. The Temporal Version Model (TVM) has no support in current databases. This model matches temporal features with the version concept to project object-oriented applications and needs to be mapped to be managed in a DBMS (Database Management System). Once this mapping is achieved, TVM applications can also generate XML views. This work presents initially a way to represent TVM instances in a XML format. Thus, documents created following this representation may be used in queries. Afterwards, an extension of a XML query language is proposed, aiming to provide features for the retrieval of temporal and version information represented in XML documents. Temporal and version functions are defined and incorporated in a base language. The way functions are executed and the specification of temporal version queries are described in details. A tool that implements the base language is used to test the new functions, with the aim of validation.

Ambientes de Desenvolvimento Baseados em Gramática (ADBG) utilizam uma rigorosa semântica e sintaxe para prover poderosas ferramentas que são capazes de especificar com precisão as propriedades de um sistema visual interativo. Por intermédio destas ferramentas, os ADBGs auxiliam a edição de gramáticas e a partir destas gramáticas geram o sistema visual interativo especificado. Estes ambientes utilizam componentes dos mais diferentes espaços tecnológicos e esta tese em particular está focalizada no estudo da utilização de componentes da eXtended Markup language (XML) em ADBGs. Componentes XML oferecem inúmeras soluções que visam a interoperabilidade e armazenamento de dados. Porém, apesar de amplamente difundidos a complexidade destes componentes causa uma série de problemas que vão desde o baixo desempenho de processamentos até a inviabilização da implementação de operações mais elaboradas. Com o objetivo de diminuir esta complexidade, a presente tese propõe um conjunto simplificado de componentes XML. O conjunto dos componentes XML propostos e seus relacionamentos formam um framework que pode ser utilizado para se construir ADBGs. Após a definição do framework, o mesmo foi utilizado para se implementar o protótipo de um ADBG. A implementação e uso deste protótipo demonstrou concretamente a viabilidade e aplicabilidade das propostas desta tese. Já para demonstrar a referida diferença de complexidade, os componentes XML do framework proposto foram comparados com os componentes XML dos demais ADBGs. A comparação revelou que os componentes XML das demais abordagens têm entidades adicionais que não estão presentes nos componentes propostos. Este conjunto adicional de entidades comprovou a maior complexidade dos componentes XML utilizados nos demais ADBGs. Adicionalmente, a referida comparação demonstrou que mesmo sendo mais simples os componentes propostos mantêm as mesmas funcionalidades que os componentes atualmente utilizados. / Development Environments Based on Grammar (DEBGs) often rely on rigorous syntax and semantics, which provide powerful tools to fully specify visual interactive systems and its properties. Such environments provide to visual interactive system developers a set of editors to aid the grammar specification. From these grammars specifications the DEBGs can generate the specified visual interactive systems. Such environments can use components from several technological spaces. However this thesis is focused on the application of eXtended Markup language (XML) components in DEBGs. XML components provide many solutions in terms of interoperability and data storing. Despite of its widely application, the complexity of XML components is the cause of problems such as low processing performance and inviability of many implementations. Aiming to decrease such complexity, we propose a set of simplified XML components. The set of proposed XML components and its relationships compose a framework that can be used to develop DEBGs. After the framework specification, the framework was used to implement a DEBG prototype. Such prototype shows the viability and applicability our proposals. We demonstrate the referred complexity difference comparing the XML components proposed in this thesis with the XML components applied in others DEBGs. Basically, the XML component of others DEBGs has all entities of correspondent component proposed in this thesis more a set of extra entities. This set of extra entities demonstrates the greater complexity of other approaches. Additionally, the referred comparison demonstrates that despite of its simplifications, the proposed components have the same functionalities than the current components.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-02-05Bitstream added on 2014-06-13T20:34:32Z : No. of bitstreams: 1 santaremsegundo_je_me_mar.pdf: 3000027 bytes, checksum: 549f825ffec5cc70809e299d5095e31b (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A tecnologia trouxe à Ciência da Informação uma nova partícula em seu objeto de estudo - a informação na Web; trouxe, também, uma aproximação muito grande entre as Cências da Informação e da Computação. A Internet vem crescendo rapidamente, incrementando a explosão de informações, de forma a termos uma grande quantidade de informação disponível na Web. Desse modo, torna-se necessário investigar tecnologias para descrição e recuperação de informações que possibilitem a organização da informação digital no âmbito da World Wide Web. Valendo-se de pesquisa documental em fontes das áreas de Ciência da Computação e Ciência da Informação e da própria rede Internet foram analisadas as principais linguagens e os recursos para publicação de informações na Web, as formas de descrição e recuperação de informação, as propostas de novos padrões e de estrutura de dados e abordadas as novas ferramentas que vêm sendo discutidas e implementadas, objetivando a organização da informação digital. Verificou-se o delineamento de uma Web Semântica, que se trata de uma extensão da Web atual e que propõe uma nova arquitetura, de maneira que possamos dar significado a toda informação encontrada neste novo conceito de Internet. Tais aspectos permitem concluir que a criação da Web Semântica é uma questão de tempo e que, em breve, essa nova extensão da Web passará a ser um pedaço consistente e qualificado de informações dentro da Internet, possibilitando a várias comunidades a construção de conhecimento a partir de dados confiáveis encontrados na rede. / The technology brought to Information Science a new particle in its object of study - the information in the Web; it brought, also, a very great approach enters sciences of the Information and the Computation. The Internet comes growing of frightful form, developing the explosion of Information, of form the terms a countless amount of available information in the Web. In this way, one becomes necessary to investigate technologies for description and recovery of information that make possible the organization of the digital information in the scope of the World Wide Web. Using itself documentary research in sources of the areas of Computer Science and Information Science and proper net Internet had been analyzed the main languages and the resources for publication of information in the Web, the forms of description and recovery of information, the proposals of new standards and structure of boarded data and the new tools that they come being argued and implemented, objectifying the organization of the digital information.The delineation of a Semantic Web was verified, that if deals with an extension of the current Web and that it considers a new architecture, thus let us can give meant to all information found in this new concept of Internet. Such aspects allow to conclude that the creation of the Semantic Web is a time question and that, in briefing, this new extension of the Web will inside start to be a consistent and qualified piece of information of the Internet, making possible to some communities the construction of knowledge from found trustworthy data in the net.

Ambientes de Desenvolvimento Baseados em Gramática (ADBG) utilizam uma rigorosa semântica e sintaxe para prover poderosas ferramentas que são capazes de especificar com precisão as propriedades de um sistema visual interativo. Por intermédio destas ferramentas, os ADBGs auxiliam a edição de gramáticas e a partir destas gramáticas geram o sistema visual interativo especificado. Estes ambientes utilizam componentes dos mais diferentes espaços tecnológicos e esta tese em particular está focalizada no estudo da utilização de componentes da eXtended Markup language (XML) em ADBGs. Componentes XML oferecem inúmeras soluções que visam a interoperabilidade e armazenamento de dados. Porém, apesar de amplamente difundidos a complexidade destes componentes causa uma série de problemas que vão desde o baixo desempenho de processamentos até a inviabilização da implementação de operações mais elaboradas. Com o objetivo de diminuir esta complexidade, a presente tese propõe um conjunto simplificado de componentes XML. O conjunto dos componentes XML propostos e seus relacionamentos formam um framework que pode ser utilizado para se construir ADBGs. Após a definição do framework, o mesmo foi utilizado para se implementar o protótipo de um ADBG. A implementação e uso deste protótipo demonstrou concretamente a viabilidade e aplicabilidade das propostas desta tese. Já para demonstrar a referida diferença de complexidade, os componentes XML do framework proposto foram comparados com os componentes XML dos demais ADBGs. A comparação revelou que os componentes XML das demais abordagens têm entidades adicionais que não estão presentes nos componentes propostos. Este conjunto adicional de entidades comprovou a maior complexidade dos componentes XML utilizados nos demais ADBGs. Adicionalmente, a referida comparação demonstrou que mesmo sendo mais simples os componentes propostos mantêm as mesmas funcionalidades que os componentes atualmente utilizados. / Development Environments Based on Grammar (DEBGs) often rely on rigorous syntax and semantics, which provide powerful tools to fully specify visual interactive systems and its properties. Such environments provide to visual interactive system developers a set of editors to aid the grammar specification. From these grammars specifications the DEBGs can generate the specified visual interactive systems. Such environments can use components from several technological spaces. However this thesis is focused on the application of eXtended Markup language (XML) components in DEBGs. XML components provide many solutions in terms of interoperability and data storing. Despite of its widely application, the complexity of XML components is the cause of problems such as low processing performance and inviability of many implementations. Aiming to decrease such complexity, we propose a set of simplified XML components. The set of proposed XML components and its relationships compose a framework that can be used to develop DEBGs. After the framework specification, the framework was used to implement a DEBG prototype. Such prototype shows the viability and applicability our proposals. We demonstrate the referred complexity difference comparing the XML components proposed in this thesis with the XML components applied in others DEBGs. Basically, the XML component of others DEBGs has all entities of correspondent component proposed in this thesis more a set of extra entities. This set of extra entities demonstrates the greater complexity of other approaches. Additionally, the referred comparison demonstrates that despite of its simplifications, the proposed components have the same functionalities than the current components.

O uso da XML (Extensible Markup Language) em aplicações envolvendo bancos de dados vem se consolidando nos últimos dois anos. Os principais sistemas de gerenciamento de banco de dados já incorporam essa tecnologia em suas mais recentes versões. Dentre diversas aplicações destaca-se a publicação de dados relacionais em visões XML. Diferentemente da XML, o Modelo Temporal de Versões (TVM) não apresenta suporte entre os bancos de dados atuais. Esse modelo, que une características temporais com o conceito de versão para projetar aplicações orientadas a objetos, precisa ser mapeado para ser adequadamente controlado em um SGBD (Sistema de Gerenciamento de Banco de Dados). Cumprida essa etapa, aplicações do TVM também podem gerar visões XML. Nesse trabalho é inicialmente apresentada uma forma de representar instâncias de aplicações do TVM em um formato XML. Os documentos definidos a partir desse formato de representação são utilizados como base para consultas. Em seguida, é proposta uma extensão de uma linguagem de consulta XML visando proporcionar recursos para a recuperação de informações temporais e de versão representadas em documentos XML. São definidas funções temporais e versionadas que são incorporadas à linguagem base. O funcionamento das funções e a especificação de consultas temporais versionadas são descritos em detalhes no decorrer do trabalho. Uma ferramenta que implementa a linguagem base é utilizada na realização de testes visando validar as novas funções. / The use of the XML in applications involving databases has grown in the last two years. Recent versions of the main database management systems already incorporate this technology. Publishing relational data in XML can be identified as one of the different applications of XML. The Temporal Version Model (TVM) has no support in current databases. This model matches temporal features with the version concept to project object-oriented applications and needs to be mapped to be managed in a DBMS (Database Management System). Once this mapping is achieved, TVM applications can also generate XML views. This work presents initially a way to represent TVM instances in a XML format. Thus, documents created following this representation may be used in queries. Afterwards, an extension of a XML query language is proposed, aiming to provide features for the retrieval of temporal and version information represented in XML documents. Temporal and version functions are defined and incorporated in a base language. The way functions are executed and the specification of temporal version queries are described in details. A tool that implements the base language is used to test the new functions, with the aim of validation.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:06:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissECT.pdf: 1686156 bytes, checksum: b0ac8a0a204b32af0621b1d744787f9f (MD5) Previous issue date: 2002-02-21 / Oriented-Object Database Management Systems have been adopted for the management of multimedia applications, becoming possible to implement recovery forms that propitiate more expression capacity to the user if are foreseen metadata (information about the stored data) that assist in this task, providing a more natural and powerful form to find objects in the objects base. In this context project AMMO (Authoring and Manipulation of Multimedia Objects) appeared, aiming to provide an environment for support the authoring, storage and manipulation of multimedia applications. The developed work aims to implement automatic XML document creation for representation of multimedia data obtained as result of consultations to the Multimedia Objects Server (MmOS) of AMMO environment, preserving the advantages of this environment, as possibility of content-based search, semantics description of multimedia data and high reusability, associating them with XML advantages, as interchange facility, independence and flexibility in presentation form and semantics description of content. The XML concepts, the AMMO Project, the XML representation of multimedia data with semantic information, the creation and use of XML documents inside AMMO Project and some possible forms of visualization of the data through the XSL Style Sheets are presented. / Sistemas de gerenciamento de banco de dados orientados a objetos têm sido adotados para o gerenciamento de aplicações multimídia, tornando possível implementar formas de recuperação que propiciem maior poder de expressão ao usuário desde que sejam previstos metadados (informações sobre os dados armazenados) que auxiliem nesta tarefa, proporcionando ao usuário uma forma mais natural e poderosa para encontrar os objetos no banco de objetos. Nesse contexto surgiu o projeto AMMO (Authoring and Manipulation of Multimedia Objects), com o objetivo de prover um ambiente para suporte à autoria, armazenamento e manipulação de aplicações multimídia. O trabalho desenvolvido tem como objetivo implementar a criação automática de documentos XML para representação de dados multimídia obtidos como resultado de consultas ao Servidor de Objetos Multimídia (MmOS - Multimedia Objects Server) do ambiente AMMO, preservando as vantagens presentes nesse ambiente, como possibilidade de busca por conteúdo, descrição semântica dos dados multimídia e alta reusabilidade, associando-as às vantagens de XML, como facilidade de intercâmbio, independência e flexibilidade na forma de apresentação e descrição semântica de conteúdo. São apresentados os conceitos de XML, o Projeto AMMO, a representação em XML dos dados multimídia com informações semânticas, a criação e o uso dos documentos XML dentro do Projeto AMMO e algumas formas possíveis de visualização dos dados através do uso de Folhas de Estilo XSL.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 9976084 bytes, checksum: 20a2301e1cfe22a8f09300f65b107c6e (MD5) Previous issue date: 2013-11-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The production of interactive content may be performed in various ways using a variety of tools, from the most sophisticate, as the Eclipse, or even a writing pad. It can also be enhanced by techniques, such as the marking on video that facilitates access to interactive content. In the case of interactivity on TV, one should take into account the use of this technique in viewer satisfaction and better use of it to access interactive content. The marking technique video has been widely studied seeking to promote ease of access to interactive content. This technique can provide efficient access to content, whether for learning or entertainment. Applications of this nature can only be undertaken by trained personnel in computers, making them costly and dependent on these professionals. Thus, it is more beneficial for these applications to Interactive Digital TV may be produced by an appropriate tool to makers of content. This paper presents the MARKER tool for building interactive applications using labeling techniques in the context of video to T Learning. / A produção de conteúdo interativo pode ser realizada de diversas maneiras utilizando uma variedade de ferramentas, desde as mais sofisticadas, como a IDE Eclipse, ou até mesmo um bloco de notas. Ela pode também ser aprimorada por técnicas, como é o caso da marcação em vídeo que facilita o acesso ao conteúdo interativo. No caso da interatividade na TV, deve-se levar em conta a utilização desta técnica na satisfação do telespectador e melhor utilização da mesma para acessar conteúdo interativo. A técnica de marcação em vídeo vem sendo amplamente estudada buscando-se promover a facilidade de acesso ao conteúdo interativo. Esta técnica pode proporcionar eficiência no acesso a conteúdos, sejam estes para aprendizagem ou para entretenimento. Aplicações desta natureza só podem ser desenvolvidas por pessoal especializado em informática, tornando-as de custo elevado e dependentes destes profissionais. Assim, é mais proveitoso que estas aplicações para TV Digital Interativa sejam produzidas através de uma ferramenta adequada ao elaborador de conteúdo. Este trabalho apresenta a ferramenta MARKER para construção de aplicações interativas utilizando técnicas de marcação em vídeo para o contexto de T-Learning.

As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).

O trabalho ora apresentado foi concebido como tendo dois objetivos. O primeiro, mais geral, foi implementar uma nova metodologia para o estudo de mudanças conformacionais em proteínas, ou seja, de sua dinâmica estrutural. A técnica de marcação de spin sítio dirigida aliada à ressonância paramagnética eletrônica (SDSL-RPE) são os pilares desse novo método que faz, agora, parte do conjunto de técnicas disponíveis no Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas do Instituto de Física de São Carlos (USP). O segundo objetivo, mais específico, representou o caminho efetivamente tomado para que se alcançasse o objetivo geral. Para isso, foi proposto o estudo da correlação estrutura e função de dois sistemas biológicos muito interessantes. O primeiro deles envolveu o estudo do movimento das hélices que compõem a estrutura da proteína ligante de cálcio S100A12 humana (HS100A12) induzido pelos íons cálcio e zinco. Sabendo que a proteína S100A12 humana além de ligar íons Ca+2, apresenta afinidade por outros metais divalentes, como os íons Zn+2 e Cu+2, e que a formação de diferentes oligômeros da proteína é governada pela concentração dos íons Ca+2 e Zn+2, realizamos estudos espectroscópicos utilizando a técnica de dicroísmo circular a fim de investigarmos a estabilidade térmica da proteína HS100A12 na presença e ausência dos íons cálcio e zinco. Mudanças conformacionais na estrutura da HS100A12 foram monitoradas através da construção de uma série de mutantes (simples e duplos) em que resíduos nas hélices B, C e D foram trocados por cisteínas, subsequentemente marcadas com a sonda magnética MTSSL e submetidas às análises de SDSL-RPE. Estas consistiram na medida do espectro de RPE dos vários mutantes em temperatura ambiente para estudarmos os efeitos da presença dos íons sobre a dinâmica experimentada pela sonda nas diversas posições. Além disso, efetuamos medidas de distância entre duas sondas seletivamente inseridas na estrutura protéica, procurando assim complementar o entendimento acerca do efeito da presença dos íons sobre a proteína. Por fim, devido ao fato da proteína HS100A12 estar envolvida em alguns eventos de sinalização celular e interação com o receptor para produtos de glicosilação (RAGE), decidimos também, estudar a interação da proteína com modelos de biomembranas, utilizando monocamadas de Langmuir. O outro problema de interesse utilizou a lizosima do fago T4, uma proteína padrão, da qual uma variedade de mutantes é produzida rotineiramente a fim de obtermos mais detalhes a respeito da sua correlação estrutura e função e tornar mais sólido o entendimento da técnica SDSL. Inicialmente, realizamos um estudo com a suposta criação de uma cavidade no \"core\" hidrofóbico da porção C-terminal da enzima, quando mutamos a Leu 133 por Ala e/ou Gly, ou seja, quando trocamos um resíduo grande por um de menor volume, pois se acredita que a proteína sofra um reajuste estrutural com o intuito de preencher o espaço vazio criado por essa substituição. Para isso, propusemos estudar por SDSL o movimento da α-hélice H inserindo o marcador de spin na posição vizinha ao resíduo mutado. Adicionalmente, realizamos um experimento de \"transmutação\" com a enzima T4L, a fim de investigar a natureza das contribuições para os diferentes modos dinâmicos experimentados pelo marcador de spin quando introduzido em sítios topologicamente semelhantes. / The work presented here was conceived with two main objectives. The first one, more general, involved the implementation of a new methodology for the study of conformational changes in proteins, i.e., its structural dynamics. The technique of Site-directed Spin Labeling combined with Electronic Paramagnetic Resonance (SDSL-EPR) are the pillars of this new method, which is now part of the set of techniques available at the Grupo de Biofísica Molecular Sérgio Mascarenhas, Instituto de Física de São Carlos (USP). The second objective, more specific, represented the path actually taken to achieve the overall goal. Therefore, it was proposed to study the structure-function correlation in two interesting biological systems. The first involved the study of the movement of the helices that form the structure of the human calcium binding protein S100A12 (HS100A12) induced by calcium and zinc ions. Knowing that, besides Ca+2, human S100A12 has also affinity for other divalent metals, such as Zn+2 and Cu+2 ions, and that the formation of different protein oligomers is governed by the concentration of Ca+2 and Zn+2, we performed spectroscopic studies using circular dichroism (CD) to investigate the thermal stability of protein HS100A12 in the presence and absence of calcium and zinc. Conformational changes in the structure of HS100A12 were monitored by producing a series of mutants (singles and doubles) in which residues in helices B, C and D were replaced by cysteine and subsequently labeled with a magnetic probe MTSSL and then analyzed via SDSL-EPR. The latter consisted of the EPR spectra measurement of many mutants at room temperature to study the effects of the presence of ions on the dynamics experienced by the probe in different positions. In addition, we performed measurements of the distance between two probes inserted in the protein structure, thereby, seeking to improve the understanding of the effect of the ions presence on the protein. Finally, due to the fact that HS100A12 is involved in some events of cell signaling and interaction with the Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE), we also decided to study the interaction of protein with models of biomembranes using Langmuir monolayers. In the other problem of interest, we used a variety of mutants of the enzyme T4 lysozyme, a protein standard, in order to obtain more details about its structure-function correlation and make more solid the understanding of SDSL technique. Initially, we conducted a study about the alleged creation of a cavity in the hydrophobic C-terminal portion of the enzyme, when we replaced the Leu 133 by Ala and/or Gly, or when we changed a large residue for a smaller one, because it is believed that the protein undergoes a structural adjustment in order to fill the gap created by this substitution. For this, we studied by SDSL the α-helix H motion, inserting the spin label in a neighbor position of the mutated residue. Additionally, we performed an experiment of \"transmutation\" with the enzyme T4L in order to investigate the nature of contributions for different dynamic modes experienced by the spin label when it is introduced in topologically similar sites.

A presença de redes cerebrais funcionais ativadas durante o repouso é bem conhecida e verificada por diferentes técnicas de imagens, como as Imagens por Ressonância Magnética funcionais (IRMf) baseadas no contraste dependente do nível de oxigenação do sangue (BOLD, Blood Oxygenation Level Dependent). Entretanto, apesar de ser atualmente o método não invasivo convencional para tais estudos, o contraste BOLD é sensível a diferentes parâmetros hemodinâmicos (fluxo sanguíneo cerebral, CBF; volume sanguíneo cerebral e extração de oxigênio), cuja relação não é completamente conhecida em diversas patologias. Por outro lado, o método de Marcação dos Spins Arteriais (ASL) é uma técnica de IRM não invasiva que fornece mapas quantitativos de CBF e pode ser usada para avaliar as redes de repouso. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar a viabilidade de usar sequências de ASL (pulsada e pseudocontínua), disponíveis para o uso na rotina clínica, para o estudo da conectividade funcional do cérebro em estado de repouso. Imagens de ASL e BOLD, de 23 indivíduos jovens e saudáveis, foram adquiridas em um equipamento de 3T. Após o pré-processamento usual das imagens e cálculos dos mapas de perfusão, CBF e pseudo-BOLD (pBOLD), a partir das imagens de ASL, as redes cerebrais de repouso foram obtidas pela Análise de Componentes Independentes (ICA) e pelo método baseado em semente. Utilizando ICA, a análise em grupo conjunta de pBOLD e BOLD identificou cinco redes: rede de modo padrão (DMN), visual, auditiva, saliência e motora. Quando analisados separadamente, os dados de pBOLD mostraram apenas as redes DMN e visual, enquanto os dados de BOLD mostraram também as redes auditiva, saliência, motora, atentiva e frontoparietais direita e esquerda. Para ambas as análises, comparações entre as redes de pBOLD e BOLD apresentaram similaridades de moderadas a altas. Entretanto, nenhuma rede foi observada utilizando os dados de perfusão e CBF. Já as análises baseadas em sementes mostraram correlações significativas, para as séries temporais de pBOLD e CBF, entre regiões que constituem algumas redes de repouso conhecidas (DMN, visual, sensorial-motora, atentiva e frontoparietal). Os valores obtidos para a força das conectividades nas redes de pBOLD e CBF se correlacionaram com aqueles obtidos nas redes de BOLD. As diferenças no desempenho de ASL e BOLD devem-se a uma combinação de fatores, como relação sinal ruído e resolução temporal. Além disso, a natureza dos sinais não é a mesma. O sinal BOLD é influenciado por diferentes parâmetros fisiológicos e é proveniente principalmente de grandes veias; enquanto o sinal de ASL é proveniente da rede de capilares, fornecendo especificidade espacial mais alta para a atividade neuronal, além de permitir a quantificação do CBF, que está relacionado mais diretamente ao metabolismo cerebral. Portanto, o presente estudo mostrou ser possível investigar a conectividade funcional do cérebro no estado de repouso com uma sequência comercial, apesar das limitações técnicas da ASL. Além disso, as séries temporais de CBF e BOLD refletem diferentes aspectos do cérebro em repouso, fornecendo informações complementares dos seus processos fisiológicos / The presence of functional brain networks activated during resting state is well known and has been verified by different imaging techniques, such as the functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) based on the Blood Oxygenation Level-Dependent (BOLD) contrast. Although BOLD-fMRI is currently the conventional non invasive method for such studies, BOLD contrast is sensitive to different hemodynamic parameters (Cerebral Blood Flow, CBF; cerebral blood volume and oxygen extraction fraction), whose relationship is not fully understood in several pathologies. In contrast, the Arterial Spin Labeling (ASL) MRI technique is a non invasive tool for CBF quantification and can be used to investigate resting-state networks. Therefore, the goal of the present study was to investigate the feasibility of using ASL sequences (pulsed and pseudocontinuous), available for clinical routine use, for the study of functional connectivity of the brain at rest. ASL and BOLD images of 23 healthy young subjects were acquired in a 3T machine. After the usual image pre-processing and quantification of perfusion, CBF and pseudo-BOLD (pBOLD) maps, from ASL images, resting-state brain networks were obtained by Independent Component Analysis (ICA) and a seed-based method. Five networks were identified in a joint analysis of pBOLD and BOLD: Default Mode Network (DMN), visual, auditory, salience, and motor. When analyzed separately, pBOLD showed only the DMN and visual networks, while BOLD also showed auditory, salience, motor, attentive, right and left frontoparietal networks. For both analyses, comparisons between pBOLD and BOLD networks showed from moderate to high similarities. However, no network was obtained from perfusion and CBF time series. Seed-based analysis showed significant correlations, for pBOLD e CBF time series, between regions that integrate some known networks (DMN, visual, sensorial-motor, attentive and frontoparietal). Functional connectivity strength obtained from pBOLD and CBF networks correlated with the ones from BOLD data. Differences in performance with ASL and BOLD are due to a combination of factors, such as SNR and temporal resolution. Moreover, the nature of the signals is not the same. BOLD signal is influenced by different physiologic parameters and comes mainly from large veins; while ASL signal comes from small capillaries, providing higher spatial specificity regarding neural activity, in addition to allow the quantification of CBF, which is closer related to the cerebral metabolism. In conclusion, the present study showed the feasibility of investigating functional connectivity of the brain at rest using a commercial ASL sequence, even with its technical limitations. Moreover, CBF and BOLD time series reflect different aspects of the resting-state brain and provide complementary information on its physiological processes