Maspin (Mammary Serine Protease Inhibitor) was first reported in 1994 as a serpin with tumor suppressive properties. Maspin was initially isolated through subtractive hybridization and differential display analysis as a 42kDa protein that is expressed in normal mammary epithelial cells but reduced or absent in breast carcinomas. Further research led to maspin's characterization as a class II tumor suppressor based on its ability to inhibit cell invasion, promote apoptosis and inhibit angiogenesis. Since then, efforts have been made to characterize maspin's tumor suppressive mechanisms. In particular, researchers have studied maspin localization, the regulation of maspin expression, and more recently, maspin protein interactions. We employed a maspin-baited yeast two-hybrid system and subsequently identified Interferon Regulatory Factor 6 (IRF6) as a maspin-binding protein. Whereas many of the IRF family members have been well characterized, IRF6 remains poorly understood. In this dissertation, we elucidate some of the complex mechanisms involved in maspin activity, specifically relating to IRF6 regulation and function. We have examined the expression of IRF6 in breast cancer cells and we show that, similar to maspin, IRF6 is reduced or absent in breast carcinomas. We further show that the re-expression of IRF6 in breast cancer cells results in genotypic and phenotypic changes which can be abrogated in the presence of maspin. We identify ERK1/2 as a kinase involved in IRF6 phosphorylation, and we demonstrate a possible role for toll-like receptor signaling in the activation of IRF6. We also evaluate the differential expression of maspin and IRF6 during murine mammary gland development and we show that both maspin and IRF6 are maximally expressed during lactation. These studies have increased our understanding of the complex, pleiotropic nature of maspin and provide an avenue to develop maspin's potential as a diagnostic marker for cancer progression and as a potentially powerful therapeutic agent in the fight against breast cancer.

Maspina (SERPINB5) é um potencial gene supressor de tumor com atividades biológicas pleiotrópicas, incluindo a regulação da proliferação, morte, adesão e migração celular e a expressão gênica e a resposta ao estresse oxidativo. O mecanismo molecular subjacente a sua função é pouco conhecido. Vários estudos sugerem que a localização subcelular de maspina tem um papel essencial na sua função biológica e sua atividade supressora de tumor. A maspina nuclear tem sido associada a um bom prognóstico, enquanto que a sua localização núcleocitoplasmática tem sido correlacionada à progressão tumoral. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar o mecanismo molecular da translocação nuclear de maspina. Assim, identificamos um sinal de localização nuclear (NLS) bipartido na sequência de maspina usando um software de predição de NLS. Deleção do NLS resulta em diminuição dos níveis de maspina nuclear. No entanto, observamos que maspina também é capaz de se difundir ao núcleo em células HeLa permeabilizadas com digitonina. Porém, estudos prévios indicaram que a localização subcelular de maspina é regulada na célula intacta. Assim, para poder distinguir o transporte regulado do passivo, fusionamos a sequência inteira de maspina e do seu NLS a 5GFPs (MaspinFL e 5GFPs-MaspinNLS, respectivamente). Foi observado que o NLS de maspina, mas não a sequência inteira da proteína, foi capaz de translocar a proteína quimérica ao núcleo, o que sugere que a disponibilidade do NLS de maspina pode ser regulada na sua estrutura nativa. Além disso, foi observado que a translocação nuclear de 5GFPs-MaspinNLS foi inibida pela co-transfecção com mutantes de Ran-GTPase, indicando que o processo depende de Ran-GTPase e portanto ocorre ativamente. Não observamos uma interação do NLS de maspina com carioferina alfa 2 (KPNA2) nem uma inibição do transporte nuclear de maspina ao tratar células com importazole, um inibidor da via clássica, o que sugere que maspina transloca para o núcleo de uma forma não convencional. / Maspin (SERPINB5) is a potential tumor suppressor gene with pleiotropic biological activities, including regulation of cell proliferation, death, adhesion, migration, gene expression and oxidative stress response. The molecular mechanism underlying maspin function is poorly understood. Several studies suggest that subcellular localization plays an essential role on maspin biological function and tumor suppression activity. Nuclear maspin has been associated with a good prognostic, whereas nucleocytoplasmic localization correlates with tumor progression. The objective of this project was to investigate the mechanism underlying maspin nuclear translocation. We identified a bipartite Nuclear Localization Signal (NLS) in maspin protein sequence using an NLS prediction software. Deletion of maspin NLS leads to decrease in maspin nuclear levels. However, we also observed that maspin diffuses into the nucleus of digitoninpermeabilized cells. Still, previous studies indicated that maspin subcellular localization is regulated in the intact cell. Considering this, in order to distinguish between regulated and passive nuclear transport, maspin NLS sequence and full-length protein sequence were fused to 5GFPs (5GFPs-MaspinNLS and MaspinFL, respectively). We observed that MaspinNLS, but not MaspinFL, was able to drive 5GFPs nuclear translocation, suggesting that the availability of maspin NLS may be regulated in the native maspin structure. Furthermore, 5GFPs-MaspinNLS nuclear translocation was abrogated by mutant Ran-GTPase co-transfection, indicating that this process depends on Ran-GTPase and it occurs actively. An interaction between Maspin NLS and karyopherin alpha 2 (KPNA2) was not detected neither an inhibition of maspin nuclear transport when cells were treated with importazole, an inhibitor of the classic nuclear import pathway. These data suggest that maspin may be translocating to the nucleus in a nonconventional manner.

Maspina, proteína da família das serpinas, tem um único gene descrito, porém diversas funções biológicas foram observadas: modulação da adesão; inibição do crescimento, da angiogênese e da invasão tumoral; efeito pró-apoptótico entre outras. Está no núcleo, no citoplasma e na membrana plasmática. Tantas funções e localizações não podem ser justificadas apenas por sua estrutura primária. Maspina pode sofrer modificações pós-traducionais controlando sua atividade, localização subcelular e interações proteicas. Propôs-se assim, caracterizar a modificação de maspina pela adição de SUMO. Dois prováveis sítios de sumoilação, nas lisinas 47 e 277 e um provável motivo de interação com SUMO entre aminoácidos 156 e 159 foram encontrados pelos programas de predição SUMOplot, SUMOsp e GPS-SBM. A estrutura 3D de maspina dessas regiões mostra que são compatíveis e coerentes com sumoilação. Ensaio de imunoprecipitação sugere que maspina endógena é sumoilada na linhagem MCF-10A. Esses dados sugerem que sumoilação pode ser importante na regulação das funções biológicas de maspina. / Maspin, a protein from the serpin family, has only one gene described, but diverse biological functions observed: adhesion modulation; inhibition of growth, of angiogenesis and of tumoral invasion; pro-apoptotic effect and others. It is in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane. Those many functions and localizations cant be justified only by its primary structure. Maspin could suffer posttranslational modifications controlling its activity, subcellular localization and protein interaction. So, we propose to characterize maspin modification by the addition of SUMO. Two possible sumoylation sites in lisines 47 and 277 and a possible SUMO interacting motif between amino acids 156 and 159 were found by prediction programs SUMOplot, SUMOsp and GPS-SBM. The 3D structure of maspin in those regions shows that they are compatible and coehrent with sumoylation. Immunoprecipitation assay suggests that endogenous maspin is sumoylated in MCF-10A cell line. This data suggest that sumoylation could be important in the regulation of maspin biological functions.

Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

Maspina, uma proteína supressora de tumor de 42 kDa, pertence à superfamília das serpinas (inibidores de serina protease), no entanto, seu mecanismo de ação independe da inibição de proteases. Maspina é expressa por epitélio de diferentes órgãos e apresenta regulação diferencial durante a progressão tumoral. Entre suas atividades biológicas, foram descritas a regulação da adesão celular, migração, morte, expressão gênica e resposta ao estresse oxidativo. A localização subcelular de maspina está relacionada a regulação de suas funções biológicas. Estudos clínicos recentes indicam que é a localização nuclear de maspina, ao invés de seus níveis de expressão, correlaciona-se com bons fatores prognósticos e sobrevida global em alguns tipos de câncer, incluindo câncer de mama. No entanto, pouco se sabe sobre como a localização subcelular de maspina é regulada. A maioria dos estudos sobre maspina é conduzido em linhagens de células tumorais, que apresentam uma grande variabilidade no contexto celular. Portanto, é importante usar uma linhagem celular não transformada para esta abordagem. Nesse trabalho investigamos fatores solúveis, interação célula-célula e interação célula-substrato como possíveis reguladores da localização de maspina na célula e as vias de sinalização envolvidas nesta regulação. Usando a linhagem celular epitelial mamária não transformada MCF10A como modelo, observamos por experimentos de imunofluorescência que o Fator de Crescimento Epidermal (EGF) promove a localização nuclear de maspina. EGF também altera a fosforilação da proteína conforme mostram nossos experimentos de 2D-SDS-PAGE e gel contendo Phostag. A fosforilação ocorre em resíduos de serina e a desfosforilação em resíduos de tirosina. À procura por vias de sinalização a jusante de do receptor de EGF envolvidas na regulação da localização subcelular de maspina, identificamos as vias de PI3K e Stat3 . Além disso, a adesão célula-célula parece bloquear a localização nuclear de maspina. Na tentativa de investigar funções celulares relacionadas à regulação de maspina por EGFR, identificamos proteínas que co-imunoprecipitam com maspina após o tratamento com EGF. O agrupamento funcional dessas proteínas sugere que a maspina pode estar envolvida em metabolismo de RNA, adesão celular e citoesqueleto. Desta forma, este trabalho identificou diferentes mecanismos que regulam a localização subcelular de maspina, que dependem da ativação das vias de PI3K e AKT pela via de EGFR. / Maspin, a 42 kDa tumor suppressor protein, belongs to the serpin (serine protease inhibitors) superfamily, however, its mechanism of action does not depend on protease inhibition. Maspin is expressed by epithelium of different organs and presents differential regulation during tumor progression. Among its biological activities, regulation of cell adhesion, migration, death, gene expression and oxidative stress response were described. Subcellular localization of maspin is related to the regulation of its biological functions. Recent clinical studies indicate that nuclear localization of maspin, not its expression levels, correlates with good prognostic factors and overall survival in some types of cancer, including breast cancer. However, little is known about how maspin subcellular localization is regulated. Most studies on maspin are conducted in tumor cell lines, which show great variability in cell context. Therefore, it is important to use a nontransformed cell line for this approach. Here we investigated soluble factors, cell-cell interaction and cell-substrate interaction as possible regulators of maspin subcellular localization and the signaling pathways involved. Using the MCF10A untransformed mammary epithelial cell line as a model system, we observed by immunofluorescence experiments that the Epidermal Growth Factor (EGF) promotes nuclear localization of maspin. EGF also alters the phosphorylation of the protein as observed by 2D-SDSPAGE and gel containing Phos-tag. Phosphorylation occurs on serine residues and dephosphorylation, on tyrosine residues. Looking for signaling pathways downstream of EGF receptor involved in regulation of maspin subcelular localization, we identified the PI3K and STAT3 pathways. On the other hand, cell-cell adhesion seems to block nuclear localization of maspin. In an attempt to investigate cellular functions related to regulation of maspin by EGFR, we identified proteins that co-immunoprecipitate with maspin in EGF-treated cells. The functional grouping of these proteins suggests that maspin may be involved with RNA metabolism, cell adhesion and cytoskeleton. Thus, this study identified different mechanisms that regulate subcellular localization of maspin, which depends on PI3K and STAT3 activation downstream of EGFR pathway.

Maspina, proteína da família das serpinas, tem um único gene descrito, porém diversas funções biológicas foram observadas: modulação da adesão; inibição do crescimento, da angiogênese e da invasão tumoral; efeito pró-apoptótico entre outras. Está no núcleo, no citoplasma e na membrana plasmática. Tantas funções e localizações não podem ser justificadas apenas por sua estrutura primária. Maspina pode sofrer modificações pós-traducionais controlando sua atividade, localização subcelular e interações proteicas. Propôs-se assim, caracterizar a modificação de maspina pela adição de SUMO. Dois prováveis sítios de sumoilação, nas lisinas 47 e 277 e um provável motivo de interação com SUMO entre aminoácidos 156 e 159 foram encontrados pelos programas de predição SUMOplot, SUMOsp e GPS-SBM. A estrutura 3D de maspina dessas regiões mostra que são compatíveis e coerentes com sumoilação. Ensaio de imunoprecipitação sugere que maspina endógena é sumoilada na linhagem MCF-10A. Esses dados sugerem que sumoilação pode ser importante na regulação das funções biológicas de maspina. / Maspin, a protein from the serpin family, has only one gene described, but diverse biological functions observed: adhesion modulation; inhibition of growth, of angiogenesis and of tumoral invasion; pro-apoptotic effect and others. It is in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane. Those many functions and localizations cant be justified only by its primary structure. Maspin could suffer posttranslational modifications controlling its activity, subcellular localization and protein interaction. So, we propose to characterize maspin modification by the addition of SUMO. Two possible sumoylation sites in lisines 47 and 277 and a possible SUMO interacting motif between amino acids 156 and 159 were found by prediction programs SUMOplot, SUMOsp and GPS-SBM. The 3D structure of maspin in those regions shows that they are compatible and coehrent with sumoylation. Immunoprecipitation assay suggests that endogenous maspin is sumoylated in MCF-10A cell line. This data suggest that sumoylation could be important in the regulation of maspin biological functions.

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

Magister Scientiae (Medical Bioscience) - MSc(MBS) / Purpose: Breast cancer is one of the most frequent and fatal diseases women all around the globe are challenged with today. In women, breast cancer has the highest mortality rate of all cancers and the incidence rate is on the increase. It is estimated that by the year 2025, 19.3 million women will become a victim of this grave health problem. This disease is a result of the formation of malignant tumours caused by genetic alterations that are involved in the proliferation of cells, cellular differentiation and the disturbance in homeostasis which subsequently leads to the abnormal multiplication and growth of cells. Breast cancer is considered a multifactorial disease with various risk factors such as age, radiation exposure, hormone therapy, oral contraceptives, dietary factors, environmental exposure and genetic predispositions. Breast cancers can be subdivided and classified based on their cellular surface receptors such as Estrogen Receptors, Progesterone Receptors and Human Epidermal Growth Factor Receptor 2. Of the various subtypes, the triple-negative breast cancer subtype which is negative for all 3 surface receptors and presents as the most aggressive form of breast cancer with a poor prognosis. Between 10-20% of all breast cancer cases are classified as triple-negative breast cancer. Due to the hormonal status of triple-negative breast cancer, treatment options are limited and thus of great concern. Chemotherapy remains the most common treatment modality, but prognosis is poor with relapse within years ultimately leading to poor survival outcome. Due to this lack of effective treatment plans, an alternative treatment with minimal side effects and better survival remains an imperative area to explore. A wide scope of literature highlights red palm oil and its health benefits, with its growth inhibitory potential drawing great attention. Red palm oil, extracted from the Elaeis guineensis palm tree is red in colour due to the abundance of carotenoids, tocotrienols and tocopherols found in the oil. Various compounds make up the oil such as lycopene, carotenes, vitamin E and coenzyme Q10. Most studies have researched the effects of vitamin E extracted from the oil as a contributor to its growth inhibitory activity. This study focuses on the effects of the commercial red palm oil as a whole with all its compounds on the proliferation of breast cancer cells as well as the effect it has on various genes associated with breast cancer. Method: This study investigated the effect of red palm oil concentrations (1, 10, 100, 500 and 1000 μg/ml) on breast cancer cells—MCF-7 and MDA-MB-231 with comparison to a non-cancerous cell line—MCF-12A for 24-, 48- and 72-hour treatment periods. The parameter investigated was cell proliferation through the CCK-8 cell proliferation assay and the morphology following red palm oil treatment was observed and captured. Additionally, this study also investigated the effect of red palm oil on the expression of Human Mammaglobin (hMAM) and Maspin genes through the PCR assay and results visualised through agarose gel electrophoresis. Data was statistically analysed using GraphPad version 6.0 software. Results: Following treatment of red palm oil, no apparent changes in the cell morphology was observed despite using variable treatment concentrations over variable times for MCF-7, MDA-MB-231 and MCF-12A cells relative to their respective controls. Immortalised MCF-12A cells showed a significant increase in proliferation with the varying treatment concentrations, but more prominently with the highest concentration at 24, 48 and 72 hours. MCF-7 cells showed significant decreases at 24 and 72 hours. Decreased proliferation was observed at all dosages used, particularly at 10, 100, and 500 μg/ml. Furthermore, MDA-MB-231 cells demonstrated a gradual increase in cell proliferation for the 3 selected time periods in the varying concentrations. Additionally, red palm oil did not alter the gene expression of Maspin at any of the varying treatments for MDA-MB-231 nor MCF-7 cells. However, changes in hMAM gene expression were observed at treatment concentration of 100 μg/ml in MDA-MB-231 cells that were incubated for 24 and 48 hours. However, the hMAM expression was not affected in treated MCF-7 cells. Conclusion: Red palm oil, as an alternative dietary oil, seems to have potential growth inhibitory properties as demonstrated by the change in the cell proliferation of the MCF-7 cells. Literature show that various individual compounds extracted from red palm oil have anti-proliferative and inhibitory effects on breast cancer cells making them good candidates for therapy. However, this study concludes that red palm oil as a whole component would not be a suitable therapeutic agent for highly aggressive triple-negative breast cancer.