Memoria para optar al titulo Profesional de Ingeniero Agrónomo / Los objetivos del presente estudio fueron determinar la incidencia de mastitis clínica (MC), prevalencia de mastitis subclínica (MSC), etiología bacteriana de ambos tipos de mastitis y estimar las pérdidas económicas que genera la mastitis en cuatros lecherías de la comuna de Purranque, X región. Estas lecherías fueron, Huillinco I, Huillinco II, Centinela y Estación Experimental Oromo. Esta última perteneciente a la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile. La población total de animales utilizados para el desarrollo del estudio fue de 1.286 vacas, con 820 de ellas en lactancia en el período de realización del estudio, comprendido entre el 7 de agosto y el 5 de septiembre de 2008. Para la determinación de la incidencia de MC se realizó un monitoreo diario de cada ordeña examinando las primeras emisiones de leche, para la prevalencia de MSC se realizó una toma de muestras al final del período, de una cantidad representativa de la población en lactancia. La etiología bacteriana fue determinada con cada muestra recolectada en cada uno de los casos. También se realizó un test de resistencia a los patógenos del género Staphylococci, para determinar su capacidad de resistencia a la penicilina y su producción de la enzima betalactamasa. Por último, la estimación de las pérdidas económicas para MSC, se realizó utilizando los controles lecheros de agosto y septiembre de 2008 (en Estación Experimental Oromo se usaron los controles de agosto de 2008 a marzo de 2009 dada la monoestacionalidad de la producción) y las pérdidas de MC, fueron estimadas utilizando los casos detectados durante el período de muestreo. La incidencia de MC mensual en las lecherías consideradas en el estudio fue de 3,7% y la prevalencia de MSC fue de un 38,9%. El patógeno más frecuentemente aislado, tanto para MC y MSC, fue Staphylococccus aureus, con un 39,6 y 68,6% respectivamente. La pérdida productiva, para los productores, que implica la presencia de MSC osciló entre un 1,86 y 18,35% por lactancia (91 y 1.335kg/lactancia) y para MC, la pérdida promedio por lactancia se estimó en 1.539 kg, lo que considerando el porcentaje de incidencia y un precio base por litro de leche de $131,33, genera pérdidas por $9.106.892 en las 4 lecherías. / The objectives of this study were to determine the incidence of clinical mastitis (CM), prevalence of subclinical mastitis (SCM), the bacterial cause of both types of mastitis and to estimate the economic loss generated by mastitis in four dairy farms in the commune of Purranque, X region. These dairies were Huillinco I, Huillinco II, Centinela and Oromo Experiment Station from the Faculty of Agricultural Sciences, University of Chile. The total population of animals used for the development of the study was of 1.286 cows, with 820 of them in nursing, which was conducted between August 7 and September 5, 2008. To determine the incidence of CM was carried out daily monitoring of each milking examining the first streams of milk. The prevalence of SCM was performed by sampling at the end of the period of the survey a representative number of cows from each farm. The bacterial etiology was determined by laboratory culture in each collected probe from every of the cases. It was also performed a test of resistance from pathogens of genus Staphylococci, to determine their ability to resist penicillin in cultures by production the enzyme betalactamase. Finally, the estimation of the economical loss by SCM, was calculated on dairy production tests in August and September of 2008 (for Oromo Experiment Station were used controls between August 2008 to March 2009, given the annual production system in this farm) and the CM loss were calculated using the cases detected in the survey period. The monthly incidence of CM in dairies considered in the study was 3,7% and the prevalence of SCM was 38,9%. The most common pathogen isolated, for both, CM and SCM, was Staphylococcus aureus with 39,6% and 68,6% respectively. The productive loss for the producers, due to the presence of SCM was between 1,86 and 18,35% per lactation (91 and 1.335kg/lactation) and in the case of the CM, the average loss per lactation was estimated at 1.539 kg. Considering the incidence rate and a base price per liter milk $131,33, the loss generated in the 4 dairies is $9.106.892.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las mastitis, en todas sus formas de presentación, es una enfermedad que generar numerosas pérdidas en la industria lechera. Estas pueden deberse a la menor cantidad de leche producida por parte de la vaca, la alteración en la calidad de ésta y los costos de tratamientos, eliminación y reemplazo de animales. La fertilidad en lecherías de alta producción es un aspecto muy importante de los manejos que se deben realizar en los predios. Esto se debe principalmente a que luego de paridas, es importante preñar a las vacas lo antes posible (siempre considerando un tiempo de espera voluntario) para que de esta manera se aproveche de manera más eficiente la curva de la lactancia de las vacas. Dicho de otra manera, es importante tener preñadas a las vacas para que su lactancia no se alargue demasiado y de esta manera no tener animales con bajas producciones producto de lactancias muy largas. Algunos autores han propuesto que la mastitis podría tener un efecto en la fertilidad de las vacas lecheras de alta producción. Esto sería válido para el cuadro clínico y subclínico de la enfermedad. Por lo tanto el presente estudio tuvo como propósito determinar el efecto de alteraciones en la sanidad mamaria (mastitis clínica o subclínica) en la fertilidad a la inseminación de vacas lecheras de alta producción. Para este estudio se utilizaron los registros de más de 5000 inseminaciones provenientes de 2 predios lecheros ubicados en la región de Valparaíso. Para el caso de las mastitis clínicas se consideraron inseminaciones que estuvieran asociadas a un caso de mastitis entre 10 días previos a ésta y entre la IA y el diagnóstico de gestación. Se dividieron los datos de acuerdo al periodo en que se presentó el caso en relación a la IA en antes de la IA, durante la IA y después de la IA. También se analizó el efecto de la severidad del cuadro sobre la fertilidad a la IA. Para analizar el efecto de la mastitis subclínica sobre la fertilidad se utilizó el puntaje lineal de células somáticas como indicador de mastitis subclínica (≥ 4,5) y se registró este puntaje en el control más cercano a la IA considerando que para ambos predios se realizaban muestreos periódicamente (cada 30 días aproximadamente). Para analizar los datos se compararon las tasas de concepción de animales que presentaron la enfermedad (el cuadro clínico y subclínico por separado) con animales sanos mediante el método de chi cuadrado. Además se realizaron análisis de regresión logística para determinar si existía un efecto de la enfermedad en la probabilidad de preñez comparado con animales sanos. Para el caso de la mastitis clínica los resultados mostraron que cuando se consideraba a las inseminaciones asociadas a mastitis en un período 10 días antes de la IA hasta el diagnóstico de gestación no se presentaron diferencias significativas en la tasa de concepción (TC) de animales sanos comparado con animales enfermos (TC= 35,4% vs 32,8% respectivamente; p=0,13). Para determinar de mejor manera el efecto que podría tener la mastitis se decidió restringir el periodo en que se consideraban inseminaciones asociadas a mastitis entre los 5 días previos a la IA y los 20 días posteriores a ésta. Esta vez los resultados mostraron que existía un efecto marcado de la enfermedad en la tasa de concepción (35,6% en animales sanos vs 29,7% para vacas enfermas; p=0,002) y en la probabilidad de preñez (OR: 0,76; IC 95%= 0,64 - 0,91; p=0,002). Otros parámetros estudiados, una vez restringido los periodos seleccionables para considerar una inseminación asociada a mastitis clínica, fueron el efecto del momento de presentación del cuadro y la severidad de éste. Para el efecto del momento de presentación de la enfermedad sobre la fertilidad se pudo apreciar que animales enfermos tenían menores tasas de concepción cuando la enfermedad se presentaba durante la IA y después de ésta (Durante: TC=25,7%, p= 0,006; Después: TC=30,7%, p= 0,05 comparado con TC=35,6% de animales sanos). Para la severidad de la mastitis se vio que las mastitis grado 2 y 3 presentaban menores tasas de concepción comparado con la ausencia de mastitis (Grado 2: TC=29%, p=0,006; Grado 3: TC=29,7%, p=0,05). Los resultados para el análisis de la mastitis subclínica no arrojaron diferencias significativas en la tasa de concepción vacas con mastitis subclínica comparado con animales sanos (TC= 35,8 vs. 35,4 respectivamente; p=0,61). El análisis de regresión logística tampoco mostró diferencias significativas en la probabilidad de preñez de animales sanos comparado con animales enfermos (OR: 0,94; IC 95% = 0,76 - 1,18; p=0,6). Existiría un efecto negativo de la mastitis clínica en la tasa de concepción de vacas lecheras, en un periodo cercano a la IA. También se aprecia un efecto negativo dependiendo del momento de presentación de la enfermedad en la tasa de concepción. La severidad del cuadro también afectó negativamente la fertilidad a la inseminación. Para el caso de la mastitis subclínica no existiría un efecto negativo de esta en la tasa de concepción de vacas lecheras

El presente Trabajo de Tesis se desprende como una línea de investigación del grupo de la UNRC dedicado al estudio de la problemática de la mastitis bovina tanto en aspectos básicos como aplicados con estudios genéticos, epidemiológicos y de virulencia de los principales microorganismos involucrados en la mastitis bovina. Staphylococccus coagulasa negativo (SCN) es un grupo bacteriano formado por varias especies que por lo general eran considerados flora oportunista de la piel y agentes patógenos menores de mastitis bovina sobre todo en comparación con los principales agentes patógenos tales como Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae, e incluso con frecuencia ignorados en el marco del control de la mastitis. En estos últimos años están emergiendo como potenciales bacterias responsables de infecciones intramamarias (IIM) en las explotaciones lecheras modernas, siendo frecuentemente los más aislados. Existen claras evidencias, principalmente en casos subclínicos, como también mastitis clínicas leves y subclínica de larga duración que ocasionan una reducción en la producción de leche además de un daño en los tejidos secretores. Por lo tanto, este trabajo de tesis intenta dilucidar algunos aspectos relacionados con la metodología de diagnóstico fenotípica y genotípica, los factores de virulencia que contribuyen a la patogenicidad, persistencia de las infecciones, y a la susceptibilidad de los distintos antimicrobianos, como así también los genes asociados a la formación de biofilm y los relacionados con los antibióticos β-lactámicos. En resumen, esta tesis intenta profundizar el conocimiento del rol de los SCN dentro de las IIM, en especial la significancia clínica de cada especie, contribuyendo al desarrollo de estrategias de control y prevención de la mastitis por SCN.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención ciencias animales. / Escherichia coli es un importante agente causal de mastitis clínica y es el principal causante de mastitis sobreaguda durante el periodo de transición. Dado que las vacunas actualmente disponibles para prevenir la mastitis coliforme han mostrado eficacia limitada, este estudio evaluó una nueva vacuna en base a proteoliposomas bacterianos, formulados a partir de una cepa de campo y emulsionados en hidróxido de aluminio. Tras estandarizar un modelo murino de mastitis clínica coliforme aguda, ratonas BALB/c fueron vacunadas por vía subcutánea con 2 dosis separadas por 21 días. A los 7–10 días post parto, las ratonas fueron desafiadas por vía intramamaria con una cepa homóloga, evaluando la respuesta inmune y eficacia de la formulación vacunal. Tras la administración de la vacuna, las ratonas no mostraron signos clínicos deletéreos ni alteraciones en los parámetros reproductivos. Ya desde el día 21 post vacunación, las ratonas inmunizadas mostraron un marcado aumento en los niveles sanguíneos de IgG (P < 0,0001), IgG1 (P < 0,0001) e IgG2a (P = 0,0054) antígeno específicas. Tras el sacrificio a las 48 horas post desafío, los tejidos mamarios mostraron un marcado aumento en los niveles de IgG, IgG1 e IgG2a (P = 0,0012; para los 3 isotipos), no detectándose diferencias en los niveles de IgA especifica ni en los niveles de inmunoglobulinas totales. La evaluación clínica a las 20, 30 y 48 horas post desafío demostró que las ratonas vacunadas fueron protegidas del desarrollo de un cuadro clínico agudo y severo (P < 0,0001; P = 0,0009 y P = 0,0001; respectivamente). Además, tras el análisis bacteriológico de los tejidos mamarios, se observó que las ratonas vacunadas mostraron una disminución de 5,419 log10 UFC/g en el recuento bacteriano tisular (P = 0,0012), respecto a las ratonas no vacunadas. El análisis histopatológico sólo reveló cambios inflamatorios leves a moderados y el recuento de células totales en secciones mamarias fue la mitad del observado en las ratonas no inmunizadas (P = 0,0025). En base a los resultados obtenidos, la vacuna en base a proteoliposomas bacterianos fue segura, altamente inmunógena y eficaz, alzándose como una segura y eficaz herramienta para el control de infecciones bacterianas. / Escherichia coli is an important etiological agent of clinical mastitis and the main cause of severe acute mastitis during the transition period. Given that the currently available vaccines for coliform mastitis have shown limited efficacy, this study evaluated a new vaccine based on bacterial proteoliposomes, formulated from a field bacterial strain and emulsified in aluminum hydroxide. After standardizing a murine model of acute coliform clinical mastitis, BALB/c female mice were subcutaneously vaccinated with 2 doses separated by 21 days. At 7–10 days postpartum, the mice were intramammary challenged with homologous strain, evaluating the immune response and efficacy of the vaccine formulation. After the administration of vaccine, the mice did not show deleterious symptom or alterations in reproductive parameters. Already from day 21 post vaccination, the immunized mice showed marked increase of specific IgG (P < 0.0001), IgG1 (P < 0.0001) and IgG2a (P = 0.0054) in blood. After sacrifice at 48 hours post challenge, mammary tissues showed a marked increase in IgG, IgG1 and IgG2a levels (P = 0.0012), without differences in specific IgA or total immunoglobulin levels. Clinical evaluation at 20, 30 and 48 hours post challenge showed that vaccinated mice were protected from development of acute and severe clinical disease (P < 0.0001, P = 0.0009 and P = 0.0001, respectively). Additionally, after bacteriological analysis of mammary tissues, vaccinated mice showed at decrease of 5.419 log10 CFU/g in the tissue bacterial count (P = 0.0012) respect to unvaccinated mice. Histopathological analysis revealed only slight to moderate inflammatory changes and total cells count in mammary sections was half that detected in non–immunized mice (P = 0.0025). Based on the obtained results, vaccine based on bacteriological proteoliposomes was safe, highly immunogenic and effective, rising as a safe and effective tool for the control of bacterial infections. / Financiamiento: Proyecto FIA-PYT-2012-0055.

Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos. / In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds.

Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos. / In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds.