In der vorliegenden Arbeit werden operative Vorgehensweisen bei Melanompatienten der Hautklinik des Universitätsklinikums Leipzig analysiert, die Adhärenz der aktuellen Melanom-Leitlinienempfehlung geprüft und Auswirkungen bei Abweichungen von dieser untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die „mikrografisch kontrollierte Chirurgie' (MKC) eine gute und gewebeschonende Alternative zur konventionellen Nachexzision mit 1cm oder 2cm Sicherheitsabstand darstellt. Der Sentinel-Lymphknoten-Entfernung (SLNE) konnte lediglich eine diagnostische Relevanz nachgewiesen werden. Die Durchführung einer Lymphknoten-Dissektion (LAD) zeigte keinen Vorteil hinsichtlich der 5-Jahres-Überlebenszeit. Zudem wurden hier mehr Rezidive als bei Ablehnung des Eingriffs beobachtet.:1. Einleitung 1 1.1 Geschichte und Epidemiologie 1 1.2 Ätiopathogenese und Risikofaktoren 2 1.3 Klinik und Subtypen 3 1.4 Diagnostik 6 1.5 Stadieneinteilung und Prognose 6 1.6 Therapie 11 1.6.1 Chirurgische Therapie 11 1.6.2 Medikamentöse Therapie 12 1.6.3 Weitere Therapieoptionen 14 1.7 Nachsorge 14 2. Ziel der Arbeit 16 3. Patienten und Methoden 17 3.1 Patientenauswahl 17 3.1.1 Einschlusskriterien 17 3.1.2 Ausschlusskriterien 18 3.2 Methoden 18 3.3 Statistische Auswertung 19 4. Ergebnisse 20 4.1 Analyse der Patienten und der Tumoreigenschaften 20 4.2 Metastasierungsverhalten des Melanoms 27 4.3 Todesfälle 30 4.4 Operative Versorgung der Melanome 32 4.4.1 Primärexzision extern und in der Universitätshautklinik Leipzig 32 4.4.2 Primäroperationen in der Hautklinik 32 4.4.3 Mikrografisch kontrollierte Chirurgie 34 4.4.4 Sicherheitsabstand 35 4.4.5 Sentinel-Lymphknoten-Entnahme 37 4.4.5.1 Sentinel-Lymphknoten-Entnahme und histologischer Befund 37 4.4.5.2 Lymphabfluss und Entnahmestelle des Sentinel-Lymphknotens 38 4.4.5.3 Einflussfaktoren für Sentinel-Lymphknoten-Entnahme und histologischer Befund 41 4.4.6 Lymphknoten-Dissektion 41 4.4.6.1 Lymphknoten-Dissektion und histologischer Befund 41 4.4.6.2 Entnahmestelle des Lymphknoten-Dissektats 43 4.5. Analyse der Leitlinienadhärenz 44 4.5.1 Sentinel-Lymphknoten-Entnahme (SLNE) 44 4.5.1.1 Indikation zur SLNE durch Ulzeration und/ oder Alter < 40 Jahren 46 4.5.1.2 Indikation zur SLNE durch Breslow- Index ≥ 1 mm 48 4.5.1.3 Leitliniengerechte vs. nicht leitliniengerechte Sentinel-Lymphknoten- Entnahme 52 4.5.2 Lymphknoten-Dissektion 53 4.5.2.1 Beurteilung der indizierten Dissektion nach Durchführung 54 4.5.2.2 Beurteilung der durchgeführten Dissektion nach Indikation 55 4.6 Überlebenszeitanalyse 56 4.6.1 5-Jahres-Rezidivfreiheit 56 4.6.1.1 Parameter mit Einfluss auf 5-Jahres-Rezidivfreiheit 57 4.6.1.2 Parameter ohne Einfluss auf 5-Jahres-Rezidivfreiheit 61 4.6.2 5-Jahres-Überlebenszeit 63 4.6.2.1 Parameter mit Einfluss auf 5-Jahres-Überlebenszeit 64 4.6.2.2 Parameter ohne Einfluss auf die 5-Jahres-Überlebenszeit 68 5. Diskussion 70 5.1 Charakterisierung der Patienten und Tumoreigenschaften 70 5.2 Charakterisierung von operativen Therapien 71 5.3 Identifizierung von Prognoseparametern der 5-Jahres- Rezidivfreiheit und 5-Jahres-Überlebenszeit 73 5.4 Abweichungen von der Leitlinie und potentielle Auswirkungen auf das rezidivfreie Überleben 76 6. Zusammenfassung der Arbeit 80 7. Literaturverzeichnis 83 8. Anlagen 97

Das maligne Melanom ist die aggressivste Form von Hautkrebs und verschiedene Familien von Rezeptortyrosinkinasen sind an der Entwicklung und der verstärkten Malignität beteiligt. Eph-Rezeptoren stellen die größte Klasse der Rezeptortyrosinkinasen dar und spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorangiogenese und -progression. Die Genexpression und Proteinsynthese verschiedener Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden ist bei vielen Tumorentitäten erhöht. Aus diesem Grund sollten sie sich als Zielproteine für die Entwicklung neuer Radiopharmaka eignen. Zudem zeigen Literaturbefunde einen Einfluss der hypoxischen Zellumgebung auf die Genexpression und die Proteinsynthese verschiedener Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden. Das Ziel dieser Arbeit war es, Regulationsmechanismen bei verschiedenen Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden aufzuklären, welche durch ein hypoxisches Umfeld hervorgerufen werden. Dazu wurde neben einem extrinsischen Hypoxiemodell an Monolayerzellkulturen auch ein intrinsisches Hypoxiemodell in Form von Tumorsphäroiden untersucht. Da die Genexpression und die Proteinsynthese von EphA2, EphB4, EphrinA1 und EphrinB2 laut Literatur vom Malignitätsgrad abhängig sind, wurden die metastatischen Melanomzelllinien A375, A2058 und MeWo und die prämetastatische Melanomzelllinie MEL-JUSO verwendet. Die Verifizierung der experimentellen Hypoxie erfolgte durch den etablierten Hypoxiemarker [18F]Fluormisonidazol, sowie dem Nachweis der VEGF-Genexpression unter den verwendeten Kulturbedingungen. Damit konnte die Eignung der hypoxischen Systeme gezeigt werden. Unabhängig vom Hypoxiemodell war in keiner der untersuchten Zelllinien ein Einfluss der Hypoxie auf die Genexpression und Proteinsynthese von EphA2, EphB4, EphrinA1 und EphrinB2 nachweisbar. Ein gesteigerter EphA2-Gehalt in Melanomzellen ist laut Literatur mit einer Erhöhung des Metastasierungspotentials verbunden. Um diesen Einfluss innerhalb einer Zelllinie zu untersuchen, wurden transgene A375-Zellen generiert. Mit dieser Zelllinie fanden Untersuchungen zu verschiedenen Metastasierungseigenschaften statt. Dabei wurde festgestellt, dass sich die Migration der Zellen durch den erhöhten EphA2-Gehalt verringerte, dabei war die hypoxische Umgebung ohne Einfluss. Weiterhin wurde festgestellt, dass der EphA2-Rezeptor das Adhäsionsverhalten von A375-Zellen nicht beeinflusst. Auch ein Einfluss auf das invasive Verhalten konnte nicht festgestellt werden. Eine hypoxische Umgebung war in beiden Fällen nicht von Bedeutung. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann geschlussfolgert werden, dass bei den untersuchten Melanomzelllinien keine Regulation der Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden durch ein hypoxisches Umfeld erfolgt. Durch die ausführliche Charakterisierung des EphA2-Rezeptors in der Arbeit kann jedoch geschlussfolgert werden, dass sich der Rezeptor als potentielles Zielmolekül für die Entwicklung neuer Radiotherapeutika und Radiodiagnostika eignet, nicht jedoch für die Detektion hypoxischer Bereiche in Tumoren. Durch die nunmehr etablierte Generierung von Sphäroiden und einer Zelllinie, welche den Rezeptor verstärkt exprimiert und synthetisiert, stehen nun Zellmodelle für die weiterführende Charakterisierung und Analyse neuer Radiodiagnostika und Radiotherapeutika auf der Basis von Inhibitoren und Antikörper gegen EphA2 zur Verfügung.

EINLEITUNG Das maligne Melanom stellt aufgrund seiner frühen Metastasierung und der Resistenz gegenüber den bisher bekannten Therapieansätzen eine der aggressivsten Tumorentitäten dar. Allerdings handelt es sich beim Melanom um einen antigenen und immunogenen Tumor. Dies schürt die Hoffnung, dass durch das bessere Verständnis der Mechanismen, die der Metastasierung, aber auch der Dysregulation des Immunsystems zugrunde liegen, Rückschlüsse auf neue Therapieansätze, beispielsweise unter Einbeziehung der Immunabwehr, gezogen werden können. Darüber hinaus würde die Entwicklung von Radiotracern, die eine frühzeitige Diagnose und möglicherweise auch die Auswahl von Patienten für eine personalisierte Tumortherapie ermöglichen, die Heilungschancen des malignen Melanoms wesentlich verbessern. Das Eph-Ephrin-System wiederum stellt ein vielfältiges Zellkommunikations-System dar, das sowohl in lebenswichtige als auch in pathologische Prozesse involviert ist. Beispielsweise nehmen Eph-Rezeptoren und Ephrine Einfluss auf die gerichtete Bewegung von neuronalen, endothelialen und inflammatorischen Zellen. Zudem beeinflussen sie die Bewegung von Tumorzellen und tragen so zur Tumorprogression bei. Ausgehend von diesem Hintergrund wurde die Hypothese formuliert, dass die Eph-Ephrin-vermittelte Interaktion von Melanomzellen und Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms beeinflusst. Im Speziellen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob der Rezeptor EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, aber über eine mutierte und damit funktionsunfähige Kinasedomäne verfügt, eine regulative Rolle übernimmt und antitumorigen wirkt. Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Bedeutung von EphB4, EphB6 und EphrinB2 beim malignen Melanom sollten zudem verschiedene Ansätze zur Bildgebung der oben genannten Eph-Rezeptoren und Ephrine mittels PET etabliert und geprüft werden. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass die Membranproteine EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei den ausgewählten humanen Melanomzellen und den inflammatorischen Zellen exprimiert werden und somit potentielle Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen darstellen. Infolge der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen, die als Modell für Tumor-assoziierte Makrophagen dienten, kam es zu einer verminderten Adhäsion und/oder Migration der Melanomzellen sowie im Falle der A375- und A2058-Melanomzellen zu einer verstärkten Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6. Aufgrund der breiten Wirkung von IL-6 ergeben sich daraus vielfältige Einflussmöglichkeiten auf das Tumormikromilieu. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht näher charakterisiert, da erste Ergebnisse eine Beteiligung des Eph-Ephrin-Systems ausschlossen. Während die Überexpression von EphB6 keinen Einfluss auf die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften der A375-Melanomzellen hatte, führte die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 zu einer verminderten Migration der Zellen im intakten Zellverband. Des Weiteren bewirkte EphB4 eine verstärkte Adhäsion der A375-Zellen an das Extrazellularmatrix-Protein Fibronektin, wodurch die Migration dieser Melanomzellen, im Sinne einer Metastasierung, zusätzlich beeinträchtigt wird. Die erhöhte mRNA-Expression des Liganden EphrinB2 in den A375-Melanomzellen führte zu einer verminderten chemotaktischen Migration der Zellen. Um den Einfluss von EphB4 auf die Tumorprogression und Tumorangiogenese beim malignen Melanom in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein murines Xenograft-Modell mit subkutanen A375 pIRES- bzw. A375 EphB4-Tumoren etabliert. Die Auswertung der Tumorvolumina sowie der [18F]FDG-, [18F]FMISO- und Hoechst 33342-Anreicherung in den Tumoren ergab, dass die erhöhte EphB4-Proteinbiosynthese zu tendenziell kleineren Tumoren führte. Diese waren zudem signifikant schwächer perfundiert und wiesen im Inneren größere hypoxische Areale auf als die A375 pIRES-Tumoren. Somit zeigte EphB4 neben seiner antimetastasischen Wirkung in vitro auch eine antitumorigene Wirkung in vivo, wobei letztere möglicherweise auf eine Störung der Gefäßbildung zurückzuführen ist. Da eine adäquate Blutversorgung der Tumoren für die Metastasierung von Tumorzellen von Bedeutung ist, könnte dies auch auf eine antimetastatische Wirkung in vivo hinweisen. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuer, 18F-markierter EphB4 Kinaseinhibitor (Verbindung [18F]2) getestet. Dieser zeigte im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell eine geringe Tumoranreicherung, die von der EphB4-Proteinbiosynthese in den Tumoren unabhängig war. Darüber hinaus kam es zur schnellen hepatobiliären Ausscheidung von Verbindung [18F]2, was deren radiopharmazeutischer Anwendung im Wege steht. SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Insbesondere die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 hatte im Falle der untersuchten A375-Melanomzellen zu einer verminderten Migration und zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen geführt. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass EphB4 die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Darüber hinaus deuteten Untersuchungen am A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell auf eine antitumorigene Wirkung des EphB4-Rezeptors in vivo hin. Aufgrund dessen muss der anfänglich formulierten Hypothese, dass EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert, widersprochen werden. Eine regulative Beteiligung des Kinase-defizienten Rezeptors EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings ergeben sich aufgrund der Expression der Rezeptoren EphB4 und EphB6 sowie deren Ligand EphrinB2 sowohl auf den untersuchten Melanomzellen als auch auf den verschiedenen Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen interessante Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen. Deren Einfluss auf die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell ermöglicht die In vivo-Charakterisierung von Radiotracer, die gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen im Allgemeinen oder aber selektiv gegen EphB4 gerichtet sind. Da Verbindung [18F]2 eine ungünstige Pharmakokinetik zeigte, was wahrscheinlich auf die hohe Lipophilie des Radiotracers zurückzuführen ist, sollten sich zukünftige Untersuchungen mit der chemischen Modifikation dieser Verbindung beschäftigen, mit dem Ziel die Lipophilie und damit die biologische Halbwertszeit des Radiotracers zu verbessern. Zusätzlich sollte die Entwicklung von Radiotracern auf der Basis von löslichen Eph-Rezeptoren und Ephrinen (sEph bzw. sEphrin) weiter vorangetrieben werden.:1 EINLEITUNG 1.1 Die Bedeutung des Tumor-Mikromilieus bei der Entstehung des malignen Melanoms 1.2 Die Metastasierung des malignen Melanoms als limitierender Einflussfaktor auf die Tumortherapie 1.3 Die Rolle des Eph-Ephrin-Systems bei der Tumorprogression und Metastasierung 1.4 Zielstellung 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Eukaryotische Zellen 2.1.2 Prokaryotische Zellen 2.1.3 Versuchstiere 2.1.4 Plasmide 2.1.5 Kits 2.1.6 Antikörper 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 2.1.8 Chemikalien, Medien und Enzyme 2.1.9 Puffer und Lösungen 2.1.10 Geräte 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 RNA-Isolierung aus Zellen 2.2.2 DNase-Behandlung 2.2.3 Quantitative Echtzeit RT-PCR (qRT-PCR) 2.2.4 Klonierung von humanem EphB4, EphB6 und EphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pIRES2-AcGFP1 2.2.4.1 Prinzip 2.2.4.2 Restriktionshydrolyse 2.2.4.3 Dephosphorylierung und Glättung der cDNA mittels Alkalischer Phosphatase und Klenow-Fragment 2.2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 2.2.4.5 Gelextraktion 2.2.4.6 Ligation 2.2.4.7 Herstellung Transformations-kompetenter E. coli 2.2.4.8 Transformation kompetenter E. coli 2.2.4.9 Plasmid-Isolierung 2.2.5 Klonierung von humanem sEphB4, sEphB6 und sEphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pSecTag2B 2.2.5.1 Prinzip 2.2.5.2 PCR zur Gewinnung der cDNA für sEphrinB2, sEphB4 und sEphB6 2.2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 2.2.5.4 TOPO-TA-Klonierung, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.2.5.5 Restriktionshydrolyse, Ligation, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.3 Zellbiologische Methoden 2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 2.3.2 Kontrolle von Zellkulturen auf Mykoplasmen-Kontamination 2.3.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen 2.3.4 Transfektion und Antibiotikaselektion von COS-7-Zellen 2.3.5 Transfektion und Antibiotika-Selektion von A375-Zellen 2.3.6 Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse und -sortierung (FACS) von transfizierten A375-Zellen 2.3.7 Fluoreszenzmikroskopie von transfizierten A375-Zellen 2.3.8 Bestimmung der Zellproliferation und Zellvitalität mittels Wachstumskurve 2.3.9 Differenzierung humaner THP-1-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen Zellen (THP-1(M)) 2.3.10 Differenzierung humaner HL-60-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen (HL-60(M)) und Granulozyten-artigen (HL-60(G)) Zellen 2.3.11 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) und anschließende Trennung mittels Magnet-aktivierter Zell Separierung (MACS) 2.3.12 Adhäsionsassay 2.3.12.1 Adhäsion an Fibronektin 2.3.12.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 2.3.13 Migrationsassay 2.3.13.1 Boyden-Kammer-Assay 2.3.13.2 Wundheilungsassay 2.4 Proteinbiochemische Methoden 2.4.1 Proteinisolierung aus Zellkulturen 2.4.2 Proteinisolierung aus Gewebeproben 2.4.3 Proteinbestimmung 2.4.4 SDS-PAGE 2.4.5 Western Blotting und Immundetektion 2.4.6 Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) 2.4.6.1 IL-6-ELISA 2.4.6.2 pEphB4-ELISA 2.4.7 Gewinnung und Reinigung der rekombinanten, löslichen Eph Rezeptoren sEphB4 und sEphB6 2.4.7.1 Gewinnung von COS-7-Zellkulturüberständen 2.4.7.2 Reinigung von sEphB4 und sEphB6 aus den COS-7-Zellkulturüberständen mittels Ni2+-Affinitätschromatographie 2.4.7.3 Regeneration der Ni2+-NTA-Agarose 2.4.7.4 Entfernung von Salzen und Imidazol mittels Schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) 2.4.7.5 Entfernung von Salzen und Imidazol mit Hilfe von Zentrifugalkonzentratoren 2.4.7.6 Gefriertrocknung 2.5 Tierexperimentelle Arbeiten 2.5.1 Etablierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 2.5.2 Fluoreszenz-Bildgebung 2.5.3 Magnet-Resonanz-Tomographie 2.5.4 Untersuchung der Tumorperfusion mittels Hoechst 33342 2.6 Radiochemische und Radiopharmakologische Methoden 2.6.1 Darstellung und Radiomarkierung von EphB4-Kinaseinhibitoren 2.6.2 Untersuchung des Einflusses der Verbindungen 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität mittels MTT-Test 2.6.3 Untersuchung der zellulären Bindung und Aufnahme der Verbindung [18F]2 2.6.4 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 2.6.5 Bioverteilung 2.6.6 Metabolitenanalyse 2.6.7 Autoradiographie 2.7 Histologische Methoden 2.7.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 2.7.2 Nachweis von Hoechst 33342 in Gefrierschnitten 2.7.3 Anfertigung von Paraffinschnitten 2.7.4 Nachweis von EphB4 in Paraffinschnitten 2.8 Statistische Auswertung 3 ERGEBNISSE 3.1 Genexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.2 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.3 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) 3.3.1 Etablierung eines Kokultur-Modells mit anschließender Trennung der humanen Melanomzellen von den HL 60(M)-Zellen 3.3.2 Einfluss der Kokultur auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der humanen Melanomzellen 3.3.2.1 Adhäsionsassay 3.3.2.2 Migrationsassay 3.3.3 Einfluss der Kokultur auf die Sekretion von Interleukin-6 durch die humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.4 Überexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei A375 Melanomzellen 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie und FACS 3.4.2 mRNA-Expression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.3 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.4 Proliferationsverhalten 3.5 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten von A375-Melanomzellen 3.5.1 Einfluss auf die Adhäsion 3.5.1.1 Adhäsion an Fibronektin 3.5.1.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 3.5.2 Einfluss auf die Migration 3.5.2.1 Boyden-Kammer-Assay 3.5.2.2 Wundheilungsassay 3.5.3 Einfluss der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der A375-Melanomzellen 3.6 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das inflammatorische Potential von A375-Melanomzellen und HL 60(M)-Zellen 3.7 Charakterisierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 3.7.1 Charakterisierung des Tumorwachstums 3.7.2 Nachweis der EphB4-Proteinbiosynthese 3.7.3 Charakterisierung des Tumormetabolismus und der Tumorperfusion mit [18F]FDG 3.7.4 Charakterisierung der Tumorperfusion mit Hoechst 33342 3.7.5 Charakterisierung der CD31-Proteinbiosynthese 3.7.6 Charakterisierung hypoxischer Areale mit [18F]FMISO 3.8 Charakterisierung eines neuen, 18F-radiomarkierten EphB4-Kinaseinhibitors als Radiotracer zur Bildgebung von EphB4 mittels Kleintier-PET 3.8.1 Einfluss von Verbindung 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität 3.8.2 Einfluss von Verbindung 2 auf die EphB4-Phosphorylierung 3.8.3 Charakterisierung der Zellaufnahme von Verbindung [18F]2 3.8.4 Charakterisierung des In-vivo-Metabolismus von Verbindung [18F]2 im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell 3.8.4.1 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 3.8.4.2 Autoradiographie 3.8.4.3 Bioverteilung 3.8.4.4 Metabolitenanalyse 3.9 Reinigung und Charakterisierung rekombinanter, löslicher Eph-Rezeptoren 3.9.1 Proteinbiosynthese und Sekretion von sEphB4 und sEphB6 3.9.2 Reinigung von rekombinantem sEphB4 und sEphB6 aus COS-7-Zellkulturüberständen 4 DISKUSSION 4.1 Therapiemöglichkeiten und Bedeutung von Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen beim malignen Melanom 4.2 Vorkommen von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Melanomzellen und inflammatorischen Zellen 4.3 Einfluss der Kokultur von Melanomzellen mit HL-60(M) auf die metastatischen und inflammatorischen Eigenschaften der Zellen 4.4 Einfluss von EphB4 auf das Wachstum und die Vaskularisierung von A375-Tumoren in vivo 4.5 Kinaseinhibitoren als potentielle Radiotracer für die In vivo-Bildgebung von Eph-Rezeptoren 4.6 Entwicklung löslicher Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden als Grundlage für die In vivo-Bildgebung des Eph-Ephrin-Systems 5 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 DANKSAGUNG 9 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE

This thesis is focused on the epithelial mesenchymal interactions in tumors derived from squamous epithelium including tumors arising from minor cell population (melanocytes). This study is also reflecting aspects of epithelial glycobiology resp. the study of endogenous lectins, the galectins, in head and neck squamous carcinomas. Galectins represent, in the current concepts of cell and tumor biology molecules with a remarkable potential. Galectins participate, besides in regulation of pre- and postnatal homeostasis in normal tissues, also in many pathological processes such as autoimmune reactions or malignancies. In this thesis, we demonstrated the presence of galectin-1 and -2 and their glycoligands in interphasic and mitotic nuclei, which may contribute to regulation of the cell cycle. Furthermore, we demonstrated galectin-9 as a sensitive marker of transformation normal to the dysplastic squamous epithelium in head and neck. The epithelial mesenchymal interactions represent mechanisms, which are responsible for dynamic maintenance of the homeostasis of the organism during prenatal development, postnatal growth and during cyclic renewal of certain tissues. These interactions also participate in wound healing. On the other hand they play a crucial role in the process of tumor transformation,...

Fibroblasts are stromal cells ubiquitously present in the human body. They often appear in a quiescent state and can become activated in response to tissue remodeling signals. Activated fibroblasts acquire biosynthetic, pro-inflammatory and contractile properties, key functions for wound healing. In addition, the presence of permanently activated fibroblasts is one of the hallmarks of cancer. The purpose of this work is to investigate the differences between newborn and adult fibroblasts and keratinocytes in their implication in scarless wound healing, the origin of cancer associated fibroblasts (CAF)s and the influence of fibroblasts in melanoma invasion. Evidence suggests that wounds heal almost without scar in newborns. To understand the mechanisms that contribute to scarless wound healing we focused on the differences between newborn and adult fibroblasts and keratinocytes, which are cells present in human skin and participating in wound healing process. A comparison of the expression profile between newborn and adult fibroblasts showed differentially regulated genes related to the acute phase of the inflammatory response and ECM organization, traits involved in wound healing. We also found that newborn fibroblast showed higher differentiation potential, exhibited markers of pluripotency and...

One of the most globally common types of cancer is skin cancer, where melanoma is the most deadly form. An important and promising tool for diagnosing diseases such as skin cancer is computer aided diagnostics, a tool which utilizes machine learning to predict and classify cancer. Limiting the complexity of the data, known as feature selection, can potentially improve classification accuracy. This report evaluates the accuracy of four different classifiers - Support Vector Machine, Naive Bayes, Decision Tree and Artificial Neural Network - with four different feature selection methods - Sequantial Forward Selection, Sequantial Backward Selection, Entropy and Principal Component Analysis - on the PH2 skin cancer dataset, containing dermoscopic images of skin lesions and their respective metadata. The findings reveal that all feature selection methods led to an improved accuracy rate on at least one classifier compared to not using feature selection. Furthermore, certain feature selection methods resulted in a significant gain in accuracy, indicating the potential value of feature selection techniques in improving the accuracy and efficiency of machine learning classifiers in computer-aided diagnosis systems for melanoma skin cancer detection. However, the results also underscore the importance of careful selection of the number of features to avoid adverse effects on model performance. This research contributes to the field by demonstrating the impact of feature selection methods on melanoma skin cancer detection and highlighting considerations for their application. / En av de globalt vanligaste typerna av cancer är hudcancer, där melanom är den mest dödliga typen. Ett viktigt och effektivt verktyg för att diagnostisera sjukdomar som hudcancer är datorstödd diagnostik, ett verktyg som använder maskininlärning för att förutse och klassificera cancer. Att begränsa komplexiteten i data, känt som attributurval, kan potentiellt förbättra klassificeringsnoggrannheten. Denna rapport utvärderar noggrannheten hos fyra olika klassificerare - ”Support Vector Machine”, ”Naive Bayes”, ”Decision Tree” och ”Artificial Neural Network” - med fyra olika attributurvalsmetoder - ”Sequantial Forward Selection”, ”Sequantial Backward Selection”, ”Entropy” and ”Principal Component Analysis” - på PH2 hudcancerdatasetet, som innehåller dermoskopiska bilder av hudlesioner och deras respektive metadata. Resultaten visar att alla attributurvalsmetoder ledde till en förbättrad noggrannhetsgrad på minst en klassificerare jämfört med att inte använda attributurval. Dessutom resulterade vissa attributurvalsmetoder i en betydande ökning i noggrannhet, vilket indikerar det potentiella värdet av attributurvalstekniker för att förbättra noggrannheten och effektiviteten hos maskininlärningsklassificerare i datorstödda diagnossystem för detektering av melanom hudcancer. Däremot understryker resultaten också vikten av noggrant urval av antalet attribut för att undvika negativa effekter på modellens prestanda. Denna forskning bidrar till fältet genom att demonstrera inverkan av attributurvalsmetoder på detektering av melanom hudcancer och belysa överväganden för deras tillämpning.

Eine Melanomerkrankung im metastasierten Stadium ist heute noch eine nicht heilbare und in den meisten Fällen tödlich verlaufende Erkrankung. Über 50% der Patienten mit metastasierendem malignen Melanom entwickeln Lungenmetastasen. Nach dem Auftreten von Lungenmetastasen beträgt die durchschnittliche Überlebenszeit noch 7,3 Monate. Demnach ist die Entwicklung von Therapiestrategien notwendig, um das Fortschreiten von Tumormetastasen oder sogar deren Entstehung zu verhindern. Die lokale Stimulation der angeborenen Immunabwehr durch Behandlung mit Toll-like-Rezeptor-Agonisten käme hierfür in Frage. Inhalative Behandlungen mit Immunmodulatoren, wie sie für IL-2 beschrieben wurden, könnten insbesondere für die Behandlung pulmonaler Metastasen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das pulmonale angeborene Immunsystem im Mausmodell durch den TLR2/6-Agonisten MALP-2 stimuliert und die Auswirkung dieser Immunstimulation auf experimentell induzierte pulmonale Melanommetastasen untersucht. Intratracheale Instillationen von 0,5 µg MALP-2 führten zu starker Einwanderung neutrophiler Granulozyten (6-fach) und Makrophagen (3,4-fach) in die Lunge von C57/BL6-Mäusen. Innerhalb von 24 h war das Maximum der Immunzelleinwanderung erreicht. Der Leukozyteneinstrom fiel dann innerhalb von 72 h wieder auf das Ursprungsniveau zurück. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass MALP-2 auch zu einer deutlichen Steigerung der Expression von VCAM-1 in pulmonalen Blutgefäßen führt. In vitro Experimente zeigten, dass dieses Adhäsionsmolekül die Bindung von B16-F10-Melanomzellen vermitteln kann.  Außerdem führte die MALP-2-Behandlung weder in vitro noch in vivo zu einer signifikanten Steigerung der Fähigkeit von Immunzellen, B16-F10-Melanomzellen zu lysieren.  So konnte, im Gegensatz zu Rückschlüssen aus früheren Publikationen, trotz der ausgeprägten Stimulation des pulmonalen Immunsystems und unabhängig vom Applikationsregime durch MALP-2 vor oder nach Tumorinokulation im Mausmodell keine signifikante Änderung der pulmonalen Metastasen erreicht werden. Durch Markierung von Melanomzellen, die stabil mit Green fluorescent Protein transfiziert waren, war es möglich, Melanomzellen kurz nach Tumorzellaussaat zu untersuchen. Eine lokale TLR2/6-Aktivierung durch MALP-2-Instillation 24 h vor Tumorinokulation führte aber in vivo zu keiner Beeinflussung des pulmonalen Melanomzellarrests im Mausmodell. Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch das „Boostern“ des Immunsystems durch wiederholte intratracheale MALP-2-Applikation an bereits etablierten pulmonalen Metastasen zu keiner Änderung des klinischen Gesamtresultates führt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass diese teilweise unerwarteten Ergebnisse deutlich machen, dass klinische Vorhersagen bezüglich immunmodulierender Therapien mit Vorsicht zu stellen sind, insbesondere, da multiple, sich wechselseitig beeinflussende Effekte durch die Immunstimulantien selbst das Gesamtergebnis einer Tumortherapie beeinflussen können.

<p>Увод: Туморска лимфангиогенеза је подручје активног истраживања у циљу проналаска параметара који би омогућили прецизније предвиђање понашања меланома него што то омогућавају традиционални хистолошки и клинички параметри. Иако су импресивна открића о улози лимфангиогенезе у промовисању метастазирања меланома коже, ипак су остала отворена бројна питања и још увек нису усаглашене препоруке које би биле примењиване у дијагностици и терапији. Циљ истраживања је био испитати да ли параметри лимфангиогенезе и Шилдсов индекс имају значај за прогнозу код пацијената са меланомом коже. Материјал и методе: У истраживање је укључено 100 пацијената са меланомом коже (52 без метастаза и 48 са метастазама у лимфним чворовима). За приказ ендотела лимфних судова исечци тумора су бојени имунохистохемијском методом са D2-40 антителима. Квантитативни параметри лимфангиогенезе &ndash; густина и површина лимфних судова добијени су компјутерском морфометријском анализом. За детекцију инвазије лимфних судова туморским ћелијама меланома урађено је дупло бојење D2-40 и S-100 антигена. Имунохистохемијски је испитана експресија васкуларног ендотелног фактора раста (VEGF)-C и VEGF-D у туморским ћелијама, макрофагима и фибробластима меланома. Шилдсов индекс је рачунат као логаритам производа дебљине меланома, квадриране перитуморске густине лимфних судова (ГЛС) и броја 2 за присутну лимфатичну инвазију. Резултати: Параметри који су статистички значајно доприносили појави метастаза меланома у лимфним чворовима, на униваријантној анализи, били су интратуморска ГЛС, перитуморска ГЛС, експресија VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама, дебљина тумора, улцерација, дубља инвазија по Кларку, нодуларни тип меланома и мушки пол. Мултиваријантна анализа је показала да су значајни независни прогностички фактори за настанак метастаза позитивна експресија VEGF-C у туморским ћелијама, повећана дебљина тумора, повећана интратуморска ГЛС и перитуморска ГЛС. Као најјачи предиктор појаве метастаза показала се позитивна експресија VEGF-C у туморским ћелијама. Пацијенти са &lt;20% VEGF-C позитивних туморских ћелија имали су 20 пута већи ризик за развој метастаза него пацијенти са негативном експресијом. Параметри са утицајем на меланом-специфично преживљавање на униваријантној анализи су били интратуморска ГЛС, перитуморска ГЛС, експресија VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама, док је мултиваријантна анализа издвојила повећану интратуморску и перитуморску ГЛС као независне факторе ризика за смртни исход. Интратуморска и перитуморска површина лимфних судова, лимфатична инвазија и експресија VEGF-C и VEGF-D у макрофагима и фибробластима нису биле значајно повезане са појавом метастаза нити са краћим меланом-специфичним преживљавањем. Ниједан параметар лимфангиогенезе није био значајно повезан са краћим преживљавањем без рецидива болести. Анализа оперативне карактеристичне криве (ROC) је показала да је Шилдсов индекс веома добар параметар за процену настанка метастаза, са сензитивношћу 81,3% и специфичношћу 75%. Већа површина испод ROC криве код Шилдсовог индекса (0,857) у поређењу са површином код других параметара, указује да је индекс најтачнији прогностички параметар за настанак метастаза, затим следи интратуморска ГЛС (површина 0,795), перитуморска ГЛС (површина 0,772), дебљина меланома (површина 0,762) и American Joint Committee on Cancer систем класификације (површина 0,752). Закључак: Истраживање туморске лимфангиогенезе идентификује нове параметре као значајније предикторе исхода болести од дебљине тумора, улцерације и осталих клиничко-патолошких параметара. Помоћу интратуморске и перитуморске ГЛС, експресије VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама, као и прорачуна Шилдс индекса, може се предвидети метастатски капацитет меланома. Рутинска патохистолошка анализа меланома требало би да укључи квантитативну анализу мреже лимфних судова и семиквантитативну евалуацију експресије VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама.</p> / <p>Uvod: Tumorska limfangiogeneza je područje aktivnog istraživanja u cilju pronalaska parametara koji bi omogućili preciznije predviđanje ponašanja melanoma nego što to omogućavaju tradicionalni histološki i klinički parametri. Iako su impresivna otkrića o ulozi limfangiogeneze u promovisanju metastaziranja melanoma kože, ipak su ostala otvorena brojna pitanja i još uvek nisu usaglašene preporuke koje bi bile primenjivane u dijagnostici i terapiji. Cilj istraživanja je bio ispitati da li parametri limfangiogeneze i Šildsov indeks imaju značaj za prognozu kod pacijenata sa melanomom kože. Materijal i metode: U istraživanje je uključeno 100 pacijenata sa melanomom kože (52 bez metastaza i 48 sa metastazama u limfnim čvorovima). Za prikaz endotela limfnih sudova isečci tumora su bojeni imunohistohemijskom metodom sa D2-40 antitelima. Kvantitativni parametri limfangiogeneze &ndash; gustina i površina limfnih sudova dobijeni su kompjuterskom morfometrijskom analizom. Za detekciju invazije limfnih sudova tumorskim ćelijama melanoma urađeno je duplo bojenje D2-40 i S-100 antigena. Imunohistohemijski je ispitana ekspresija vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF)-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, makrofagima i fibroblastima melanoma. Šildsov indeks je računat kao logaritam proizvoda debljine melanoma, kvadrirane peritumorske gustine limfnih sudova (GLS) i broja 2 za prisutnu limfatičnu invaziju. Rezultati: Parametri koji su statistički značajno doprinosili pojavi metastaza melanoma u limfnim čvorovima, na univarijantnoj analizi, bili su intratumorska GLS, peritumorska GLS, ekspresija VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, debljina tumora, ulceracija, dublja invazija po Klarku, nodularni tip melanoma i muški pol. Multivarijantna analiza je pokazala da su značajni nezavisni prognostički faktori za nastanak metastaza pozitivna ekspresija VEGF-C u tumorskim ćelijama, povećana debljina tumora, povećana intratumorska GLS i peritumorska GLS. Kao najjači prediktor pojave metastaza pokazala se pozitivna ekspresija VEGF-C u tumorskim ćelijama. Pacijenti sa &lt;20% VEGF-C pozitivnih tumorskih ćelija imali su 20 puta veći rizik za razvoj metastaza nego pacijenti sa negativnom ekspresijom. Parametri sa uticajem na melanom-specifično preživljavanje na univarijantnoj analizi su bili intratumorska GLS, peritumorska GLS, ekspresija VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, dok je multivarijantna analiza izdvojila povećanu intratumorsku i peritumorsku GLS kao nezavisne faktore rizika za smrtni ishod. Intratumorska i peritumorska površina limfnih sudova, limfatična invazija i ekspresija VEGF-C i VEGF-D u makrofagima i fibroblastima nisu bile značajno povezane sa pojavom metastaza niti sa kraćim melanom-specifičnim preživljavanjem. Nijedan parametar limfangiogeneze nije bio značajno povezan sa kraćim preživljavanjem bez recidiva bolesti. Analiza operativne karakteristične krive (ROC) je pokazala da je Šildsov indeks veoma dobar parametar za procenu nastanka metastaza, sa senzitivnošću 81,3% i specifičnošću 75%. Veća površina ispod ROC krive kod Šildsovog indeksa (0,857) u poređenju sa površinom kod drugih parametara, ukazuje da je indeks najtačniji prognostički parametar za nastanak metastaza, zatim sledi intratumorska GLS (površina 0,795), peritumorska GLS (površina 0,772), debljina melanoma (površina 0,762) i American Joint Committee on Cancer sistem klasifikacije (površina 0,752). Zaključak: Istraživanje tumorske limfangiogeneze identifikuje nove parametre kao značajnije prediktore ishoda bolesti od debljine tumora, ulceracije i ostalih kliničko-patoloških parametara. Pomoću intratumorske i peritumorske GLS, ekspresije VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, kao i proračuna Šilds indeksa, može se predvideti metastatski kapacitet melanoma. Rutinska patohistološka analiza melanoma trebalo bi da uključi kvantitativnu analizu mreže limfnih sudova i semikvantitativnu evaluaciju ekspresije VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama.</p> / <p>Introduction: Tumor lymphangiogenesis is a field of active research with the aim of finding parameters which would enable the more precise prediction of melanoma behavior in comparison to the prediction of traditional histological and clinical parameters. Although scientific findings about the role of lymphangiogenesis in developing cutaneous melanoma are impressive, there are unresolved questions and recommendations to be applied in diagnostics and therapy, which are still not in compliance. The aim of this research is to examine if parameters of lymphangiogenesis and the Shields Index are important for the prognosis in patients with cutaneous melanoma. Material and methods: The research included a hundred patients with cutaneous melanoma (52 without metastasis and 48 with metastasis of lymphatic nodes). To present endothelial lymphatic vessels, specimens were stained by an immunohistochemical method with D2-40 antibodies. Quantitative parameters of lymphangiogenesis &ndash; lymphatic vessel density (LVD) and area (LVA) were calculated by computer-assisted morphometric analysis. In order to detect the invasion of lymphatic vessels by melanoma tumor cells, a double staining of D2-40 and S-100 antigens was performed. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D was tested by an immunohistochemical method in tumor cells, macrophages and fibroblasts melanoma. The Shields Index was calculated as a logarithm by multiplying the melanoma thickness, square of peritumoral LVD and the number 2 for present lymphatic invasion. Results:Parameters that statistically had a significant contribution to the emergence of melanoma metastases in lymph nodes, during the univariate analysis, were intratumoral LVD, peritumoral LVD, VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells, tumor thickness, ulceration, deeper Clarkꞌs level of invasion, nodular type of melanoma and a male sex. The multivariate analysis showed that positive expression of VEGF-C in tumor cells, tumor thickness, increased intratumoral LVD and peritumoral LVD are significant independent prognostic factors. The most important predictor of metastases is a positive expression of VEGF-C in tumor cells. Patients with &lt;20% VEGF-C positive tumor cells were 20 times more at risk of developing metastases than patients with a negative expression. Parameters that influence melanoma-specific survival at the univariate analysis were intratumoral LVD, peritumoral LVD, VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells, while the multivariate analysis singled out an increased intratumoral and peritumoral LVD as independent factors of the death risk. Intratumoral and peritumoral LVA, lymphatic invasion and VEGF-C and VEGF-D expression in macrophages and fibroblasts were not significantly correlated either with the emergence of metastases or with melanoma-specific survival. Non-parameter of lymphangiogenesis was significantly related with shorter disease-free survival. The analysis of receiver operator characteristic (ROC) curve showed that the Shields Index is a very good parameter for the estimation of the appearance of metastases, with the sensitivity of 81.3% and specificity of 75%. A bigger area under the ROC curve with the Shields Index (0.857) in comparison to the area in other parameters shows that the index is the most accurate prognostic parameter for an emergence of metastases, followed by intratumoral LVD (area 0.795), peritumoral LVD (area 0.772), the thickness of melanoma (area 0.762), and the American Joint Committee on Cancer classification system (area 0.752). Conclusion: The research of tumor lymphangiogenesis identifies new parameters as significant predictors of the disease outcome more so than the parameters like tumor thickness, ulceration, and other clinical-pathological parameters. By intratumoral and peritumoral LVD, VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells, as well as by the calculation of Shields Index, metastatic capacity of melanoma can be predicted. A routine pathohistological analysis of melanoma should include quantitative analysis of the lymphatic vessels network and semiquantitative evaluation of VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells.</p>

Melanomas are one of the most aggressive types of tumours, with increasing incidence, high mortality and high potential to metastasize to a variety of diverse locations. The aim of this thesis was to study the tumour as a complex structure consisting not only of tumour cells but also of tumour stroma. Stromal cells play a major role in cancer biology. This is well documented for example in squamous cell epithelium tumours of the head and neck. Similar mechanisms can be expected to occur in melanomas. In the first experiment, we simulated the conditions in vivo during the metastatic process and studied the influence of non-adhesive environment both with and without the influence of stromal fibroblasts. The presented data demonstrates a change of tumour cells' phenotype leading to increased plasticity of the melanoma cells in these conditions. It also indicates the crucial role of stromal fibroblasts in interactions with melanoma cells. Cancer cell lines show variability in their behaviour, which is in accordance with well-known melanoma heterogeneity in clinical practice. The previous experiments in our laboratory indicate that cancer associated fibroblasts are able to influence the phenotype of a tumour cell line and this effect is based on a tumour type-unspecific mechanism. In the second part of...

Der monoklonale Antikörper SM5-1 wurde in Vorarbeiten mittels eines Immunisierungsprotokolls (Kooperation Prof. Guo, Cleveland, USA) von einer humanen Melanom-Zell-Linie gewonnen. In der vorliegenden Arbeit wurde an nicht-melanozytären benignen Geweben, 16 Nävi, 84 nicht-melanozytären Tumoren sowie 745 Melanomproben das Färbeverhalten von SM5-1 mittels Immunhistochemie charakterisiert. SM5-1 wurde zunächst mit HMB-45 und anti-S100 an 250 primären und 151 metastasierten Melanomen und in einer zweiten Stichprobe mit Antikörpern gegen Melan-A/MART-1 (A103) und Tyrosinase (T311) an 101 primären und 243 metastasierten Melanomen verglichen. Es zeigte sich, dass SM5-1 für normale Zellen negativ ist. SM5-1, anti-S100 und HMB-45 färbten 100% der Nävi und 97 - 99% der 250 primären Melanome. Während SM5-1 und anti-S100 96% der 151 Melanommetastasen korrekt identifizierten, waren für HMB-45 nur 83% der Proben positiv. Alle HMB-45 negativen Metastasen reagierten mit SM5-1. Weder SM5-1 noch HMB-45 färbten nicht-melanozytäre Tumore, wohingegen der unspezifischere Antikörper anti-S100 21 von 84 dieser Tumore färbte. Insgesamt wurde beim primären und metastasierten Melanom für SM5-1 eine Sensitivität von 98%, für HMB-45 von 93% und für anti-S100 von 97% beobachtet. Im Vergleich der Antikörper SM5-1, A103 und T311 färbten SM5-1 92,4%, A103 82,9% und T311 71,2% der insgesamt 344 primären und metastasierten Melanome. SM5-1 zeigte innerhalb einer Tumorzellpopulation ein homogeneres Färbeverhalten und eine höhere Färbeintensität bei den 243 Melanommetastasen als A103 und T311. Der monoklonale Antikörper SM5-1 zeigte gegenüber den gebräuchlichen Antikörpern erhebliche Vorteile bei der immunhistochemischen Beurteilung des Melanoms, insbesondere bei dessen Metastasen. Somit kann er als Marker der ersten Wahl bei der immunhistochemischen Diagnostik von Melanomen empfohlen werden. Um die Rolle des durch SM5-1 erkannten Antigens zu verstehen, sind jedoch noch weitere Untersuchungen notwendig. / Antibodies such as HMB-45 and anti-S100 protein have been widely used as markers of malignant melanoma. Using a subtractive immunization protocol in preliminary works (cooperation Prof. Guo, Cleveland, USA), the monoclonal antibody SM5-1 was generated from a mouse model of human melanoma. The immunhistochemical staining of SM5-1 was studied in paraffin-embedded specimens of normal non-melanocytic tissue, melanocytic nevi of the skin (n = 16), non-melanocytic neoplasms (n = 84) and 745 melanomas. 250 primary melanomas and 151 metastases were compared with HMB-45 and anti-S100 staining. Further 101 primary melanomas and 243 metastases were compared with Melan-A/MART-1 (A103) and tyrosinase (T311). Staining of normal cells for SM5-1 was found to be negative. SM5-1, anti-S100 and HMB-45 reacted with nevi and 97 - 99% of 250 primary melanomas. Whereas SM5-1 and anti-S100 showed a high degree of positive staining in 96% of 151 metastases, only 83% reacted with HMB-45. All HMB-45-negative melanoma metastases were found to be positive for SM5-1. Whereas neither SM5-1 nor HMB-45 stained any of 84 specimens from non-melanocytic neoplasms, anti-S100 was positive in 21/84. Altogether SM5-1 has a sensitivity of 98%, HMB-45 of 93% and anti-S100 of 97% for primary and metastatic melanomas. SM5-1 stained 92,3%, A103 82,9% and T311 71,2% of 344 primary and metastatic melanomas. SM5-1 showed a stronger and more homogeneous reactivity as A103 und T311 in metastases (n = 243). All tested antibodies had a comparable staining intensity for primary melanomas (n = 101). The monoclonal antibody SM5-1 appears to have advantages for the immunhistochemical analysis of melanoma over currently available antibodies, especially for melanoma metastases. Therefore it is useful as a first line reagent in immunohistochemistry of melanoma. Further studies are needed to elucidate the exact nature of the antigen recognized by SM5-1.