Die effiziente Präsentation von Tumorepitopen stellt einen kritischen Faktor zur Eliminierung von Tumorzellen durch die CD8+ cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) vermittelte Immunantwort dar. Eine wichtige Rolle spielt in diesem Zusammenhang die effiziente Generierung von Tumorepitopen durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS). Veränderungen von Komponenten des UPS, die an der Degradation und Prozessierung von Antigenen beteiligt sind, können daher zur Immunevasion von Tumorzellen gegenüber CTL führen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei unterschiedliche UPS-assoziierte Immunevasionsmechanismen des malignen Melanoms identifiziert, die auf einer ineffizienten Präsentation des immundominanten Tumorepitops Melan-A26-35 basieren. Ein Mechanismus beruht auf den unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften von Proteasomsubtypen, deren Expression durch INFgamma induziert wird. Proteasomen, die einerseits die Immunountereinheiten beta1i und/oder beta2i beinhalten, oder anderseits mit dem Proteasomaktivator 28 (PA28) assoziiert sind, führen zu einer drastisch reduzierten Generierung des Tumorepitops Melan-A26-35. In beiden Fällen ist dies auf eine ineffiziente Prozessierung des N-Terminus des Epitops zurückzuführen. Der andere Immunevasionsmechanismus steht im Zusammenhang mit der ER-assoziierten Degradation (ERAD), die den retrograden Transport von Proteinen aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) ins Cytosol zur proteasomalen Degradation beinhaltet. Durch Immunselektion mittels Melan-A26-35-spezifischen CTL wurden cytolyseresistente Melanomzellen identifiziert, deren Resistenz auf eine defiziente ER-assoziierte Degradation zurückzuführen ist. Dieser Defekt beruht auf einer verminderten Expression von ERAD-Komponenten, deren Reduktion die Verfügbarkeit des Antigens Melan-A zur proteasomalen Degradation und Generierung des immundominanten Epitops Melan-A26-35 wesentlich limitiert. / Efficient presentation of tumor epitopes by MHC class I molecules on the cell surface is a prerequisite for the elimination of tumor cells by cytotoxic CD8+ T lymphocytes. The generation of these epitopes requires the degradation and processing of proteins by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore alterations of UPS components can lead to tumor escape from immune recognition as a result of decreased epitope generation. In the present thesis two different UPS connected immune escape mechanisms of melanoma cells were identified. Both are based on an impaired generation of the immunodominant epitope Melan-A26-35 derived from Melan-A/MART-1 tumor antigen. One mechanism is mediated by the expression of different INFgamma-inducible proteasome immunosubunits leading to the formation of intermediate proteasome subtypes, which differ in their cleavage site preferences. Purified proteasomes harboring the immunosubunits beta1i and/or beta2i show a dramatic decrease in the generation of the Melan-A26-35 epitope. In addition, the INFgamma induced association of proteasomes with the proteaosome activator 28 (PA28) results in a reduced epitope generation. Both mechanisms are induced by an inefficient processing of the epitope’s N-terminus. The second immune escape mechanism is caused by defects of the ER-associated degradation pathway (ERAD). ERAD mediates the transport of ER-proteins back to the cytosolic compartment for proteasomal degradation. Via immunselection of tumor cells with Melan-A26-35 specific CTL, cytolysis resistant cells were identified. Resistance to CTL mediated lysis was shown to be connected to a decreased expression of ERAD components. This defect of the ERAD pathway limits the availability of the Melan-A protein and as consequence the generation of the immunodominant Melan-A26-35 epitope by proteasomes.

Daten des humanen Genomprojektes zeigen, dass ca. 8% des gesamten humanen Genoms aus retroviralen Sequenzen besteht. Der überwiegende Teil dieser Proviren ist aufgrund verschiedener Mutationen defekt. Im Gegensatz zu allen anderen HERV Proviren scheinen einige HERV-K Proviren intakt zu sein und besitzen offene Leserahmen für alle viralen Proteine. Die Familie des humanen endogenen Retrovirus K HML2 umfasst ca. 30 eng verwandte Proviren. Zusätzlich zu den Strukturproteinen Gag und Env und der Reversen Transkriptase, exprimiert HERV-K zwei regulatorische Proteine, Rec und Np9. Beide sind im Nukleus lokalisiert und tumorigene Eigenschaften bzw. eine Expression in Assoziation mit Tumorgeweben wurde nachgewiesen. Neben Zelllinien, wie die Teratokarzinomzelllinie GH und einigen Brustkrebszelllinien, für die die Expression von HERV-K mRNA und die Produktion von Viruspartikeln bekannt ist, konnte die Expression von HERV-K Proteinen und Partikeln für Melanomzellen gezeigt werden. Volllängen mRNA von HERV-K war in allen untersuchten humanen Proben nachweisbar. Gespleißtes env und rec war in 39% der Gewebe und in 38% der Melanomzelllinien exprimiert. Zusätzlich werden HERV-H, -R und -W exprimiert. Von den auf spezifische Antikörper gegen HERV-K Proteine untersuchten Seren der Melanompatienten waren 16% positiv für das transmembrane Hüllprotein, jedoch reagierte kein Serum mit Re oder Np9. Da im Zuge der Entstehung von Tumoren immer auch eine Dedifferenzierung der entarteten Zellen diskutiert wird, wurde die Expression von HERVs in undifferenzierten, embryonalen Stammzellen bestimmt. In den untersuchten embryonalen Stammzellen lässt sich Volllängen mRNA, sowie gespleißte env, rec und np9 mRNA nachweisen. Während der Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen sinkt die Expression jedoch wieder auf ein mit normalen Zellen vergleichbares Niveau. Obwohl gespleißte RNA und virale Proteine von HERV-K vor allem in Tumoren und Tumorzelllinien exprimiert werden, ist deren Funktion während der Tumorentstehung noch immer ungeklärt. Auch die Bedeutung der HERV-K Expression in humanen Stammzellen ist noch unklar, insbesondere in Hinblick auf eine mögliche Tumorigenität. / In contrast to all other human endogenous retroviruses, proviruses of the human endogenous retrovirus family HERV-K have maintained open reading frames for all viral proteins. Although most proviruses are defective, structural proteins Gag and Env, the reverse transcriptase and two regulatory proteins, Rec and Np9, have been described. Rec resembles the Rev protein of HIV and tumourigenic potential was confirmed. Np9 as well is located in the nucleus and expression in association with tumour tissues was observed. Additionally to cell lines known to produce HERV-K virus particles, such as the teratocarcinoma cell line GH and breast cancer cell lines, recently melanoma cells were described to express HERV-K proteins and particles. In order to study the expression of HERV-K, -H, -R and -W, in melanoma cell lines and biopsies primer sets were used. Antisera specific for HERV-K proteins were used for immunohistochemistry and sera from melanoma patients were investigated for HERV-K specific antibodies. Full length mRNAs of all HERVs were found in all human cells. Spliced env and rec of HERV-K were detected in 39% of the melanoma biopsies and in 38% of the melanoma cell lines. Expression of HERV-K in situ was shown by immunohistochemistry. In addition, 16% of the patients sera tested showed antibodies against the HERV-K transmembrane envelope protein, but no antibodies against Np9 or Rec could be detected. A certain dedifferentiation of cells as a consequence of tumour development is discussed. Therefore the expression of HERV-K in undifferentiated embryonic stem cells was investigated. The investigated stem cells showed expression of HERV-K full length, env, rec and np9 mRNA. Although the expression decreased with differentiation to neuronal precursor cells. Even though HERV-K mRNA and proteins were expressed in a high percentage of melanomas their function in tumour development is still unclear. As well as the meaning of the HERV-K expression in embryonic stem cells, particularly for a tumourigenic potential.

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Beside tumor cells themselves, tumors consist of many non-malignantly transformed cellular elements and an extracellular matrix. This so-called tumor microenvironment, or stroma, significantly influences the biological properties of the tumor through intercellular interactions. In this thesis I have focused on the study of tumor-associated fibroblasts in squamous cell carcinomas of the head and neck, malignant melanoma and glioblastoma. The data show the presence of cells with mesenchymal characteristics, present even in the glioblastoma stroma, which could potentially have a positive effect on proliferative activity and invasiveness of glioblastoma cells. In malignant melanoma, the presence of keratinocytes should also be considered, as they are the major cells of the epidermis influencing tumor melanocytes. The conditioned medium from UVB irradiated keratinocytes and non-irradiated fibroblasts stimulates the invasion of malignant melanoma cells. Targeting the tumor stroma may be a new direction in oncological therapy, so we have focused on the influence of synthetic polyamine on the formation of myofibroblasts, which are an active part of the population of tumor-associated fibroblasts. The tested polyamine prevents the formation of myofibroblasts but has no effect on those already formed nor on...

Background: Patients diagnosed with melanoma frequently search the internet for treatment information, including novel and complex immunotherapy. However, health literacy is limited among half of the German population, and no assessment of websites on melanoma treatment has been performed so far. Objective: The aim of this study was to identify and assess the most visible websites in German language on melanoma immunotherapy. Methods: In accordance with the common Web-based information-seeking behavior of patients with cancer, the first 20 hits on Google, Yahoo, and Bing were searched for combinations of German synonyms for “melanoma” and “immunotherapy” in July 2017. Websites that met our predefined eligibility criteria were considered for assessment. Three reviewers independently assessed their quality by using the established DISCERN tool and by checking the presence of quality certification. Usability and reliability were evaluated by the LIDA tool and understandability by the Patient Education Materials Assessment Tool (PEMAT). The Flesch Reading Ease Score (FRES) was calculated to estimate the readability. The ALEXA and SISTRIX tools were used to investigate the websites’ popularity and visibility. The interrater agreement was determined by calculating Cronbach alpha. Subgroup differences were identified by t test, U test, or one-way analysis of variance. Results: Of 480 hits, 45 single websites from 30 domains were assessed. Only 2 website domains displayed a German quality certification. The average assessment scores, mean (SD), were as follows: DISCERN, 48 (7.6); LIDA (usability), 40 (2.0); LIDA (reliability), 10 (1.6); PEMAT, 69% (16%); and FRES, 17 (14), indicating mediocre quality, good usability, and understandability but low reliability and an even very low readability of the included individual websites. SISTRIX scores ranged from 0 to 6872 and ALEXA scores ranged from 17 to 192,675, indicating heterogeneity of the visibility and popularity of German website domains providing information on melanoma immunotherapy. Conclusions: Optimization of the most accessible German websites on melanoma immunotherapy is desirable. Especially, simplification of the readability of information and further adaption to reliability criteria are required to support the education of patients with melanoma and laypersons, and to enhance transparency.

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Das S100A4-Protein ist für die Manifestierung eines metastatischen Phänotyps bei vielen Tumorarten von enormer Bedeutung. Die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und der Interaktionspartner von S100A4 stellt daher einen vielsprechenden Forschungsansatz dar, um neue Erkenntnisse über das Verhalten von Tumorzellen während des Metastasierungsprozesses zu erhalten. Darauf aufbauend können neue Ansatzpunkte für die Therapie metastasierender Krebserkrankungen gewonnen werden. In dieser Hinsicht ist das bisher einer Behandlung kaum zugängliche maligne Melanom als besonders aggressiver und frühzeitig metastasierender Tumor ein ideales Modell zur Aufklärung der zellulären und molekularen Prozesse, über die S100A4 seine Metastasen-fördernden Wirkungen ausübt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung der S100A4-RAGE-Interaktion sowie die Untersuchung der Beteiligung von S100A4 an Prozessen der Metastasierungskaskade in vitro und in vivo. Dies erforderte die Herstellung von rekombinantem S100A4-Protein und die Generierung von stabil mit S100A4-transfizierten Melanomzellen, die damit eine heraufregulierte S100A4-Proteinbiosynthese aufweisen. Die Gewinnung von rekombinantem S100A4 in biologisch funktioneller Form unter Verwendung eines prokaryotischen Expressionssystems erfolgte mit einem Reinheitsgrad von ca. 92%. Das rekombinante S100A4-Protein wurde mit dem Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat radioaktiv markiert und charakterisiert. Es wurde die Interaktion zwischen S100A4 bzw. 18F-markiertem S100A4 und der löslichen RAGE-Isoform sRAGE mit einer moderaten Bindungsaffinität im µM-Bereich nachgewiesen. Des Weiteren erfolgte erstmals die Analyse der radiopharmakologischen Eigenschaften von 18F-S100A4 mittels Untersuchungen zur zellulären Assoziation sowie zur metabolischen Stabilität, Bioverteilung und zu In-vivo-Interaktionen mittels Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie in der Ratte. Die In-vitro-Experimente wurden an Endothelzellen (HAEC) und an stabil mit RAGE-transfizierten A375-, A375-mock bzw. nicht transfizierten A375-Melanomzellen durchgeführt. Die A375-hRAGE-Zellen zeigten eine deutlich heraufregulierte RAGE-Proteinbiosynthese während die Endothelzellen eine vergleichsweise geringe intrazelluläre RAGE-Proteinkonzentration aufwiesen. Bei den Melanomzellen kann aufgrund der höheren Assoziation von 18F-S100A4 an A375-hRAGE-Zellen auf eine selektive Bindung von 18F S100A4 an RAGE-Rezeptoren auf der Zelloberfläche geschlossen werden. Die Assoziation von 18F S100A4 an Endothelzellen war bei 37°C in Gegenwart von nicht markiertem rekombinantem S100A4 signifikant vermindert, dementsprechend findet eine spezifische Interaktion von 18F-S100A4 mit Zelloberflächenrezeptoren der Endothelzellen statt. Dieses Ergebnis und die insgesamt höhere Bindung von 18F S100A4 an Endothelzellen im Vergleich zur Assoziation an Melanomzellen lassen neben RAGE noch andere Rezeptoren wie z. B. internalisierende Scavenger-Rezeptoren vermuten. Die In-vivo-Stabilitätsuntersuchungen verdeutlichen einen proteolytischen Abbau von 18F S100A4, allerdings belegen das Vorhandensein von 67% intaktem 18F-S100A4-Protein nach einer Stunde, die Stabilität von 18F-S100A4 in vivo. Die Bioverteilungs- bzw. PET-Untersuchungen zeigen eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende hohe Akkumulation in den Nieren und verdeutlichen somit die renale Ausscheidung von 18F S100A4. Die maßgeblichen Anreicherungen in Milz, Leber, Blut, Lunge und Nebennieren lassen Interaktionen mit Oberflächenrezeptoren dieser Gewebe erkennen. Die temporäre Retention von 18F-S100A4 in der Lunge, dem Hauptsyntheseorgan von RAGE, und die verminderte 18F-S100A4-Akkumulation in Gegenwart des spezifischen RAGE-Liganden glykLDL ist ein Hinweis dafür, dass S100A4 in vivo in der Lunge an RAGE bindet. Die Aktivitätsanreicherungen in Milz, Leber und Nebenniere deuten aufgrund der geringeren RAGE-Synthese in diesen Organen auf die Interaktion von 18F-S100A4 mit anderen Zelloberflächenrezeptoren z. B. aus der Familie der Scavenger-Rezeptoren hin. Die Beteiligung von S100A4 an Metastasierungsprozessen des malignen Melanoms wurde an stabil mit S100A4-transfizierten A375-Melanomzellen, die eine Heraufregulierung der humanen bzw. murinen S100A4-Proteinbiosynthese im Vergleich zu A375-mock- (Vektor-Kontrolle) und nicht-transfizierten A375-Zellen zeigen, untersucht. Die A375-hS100A4-Zellen sezernierten zudem eine signifikant höhere S100A4-Proteinkonzentration in das umgebende Zellkulturmedium im Vergleich zu den Kontrollen. In dieser Hinsicht konnte bei den A375-hS100A4-Zellen, vermutlich aufgrund der höheren extrazellulären S100A4-Konzentration, eine gesteigerte Proliferations-, Motilitäts-, Migrations- und Invasionsrate gegenüber den A375-mock- und A375-Zellen nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang stehen ebenso die gesteigerte RAGE-Proteinbiosynthese und die signifikant höhere Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB bei A375-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Kulturmedium der A375-hS100A4-Zellen. Demnach wirkt vermutlich das extrazelluläre S100A4-Protein als autokriner bzw. parakriner Regulator von RAGE und NF κB. Die subkutane Injektion der A375- und stabil transfizierten A375-Melanomzellen in Nacktmäuse führte zur Entwicklung subkutaner Tumore an der Injektionsstelle. Bereits zwei Wochen nach der Injektion etablierten die A375-hS100A4-Zellen die signifikant größeren Tumore im Vergleich zu den A375-mS100A4-, A375-mock und A375-Zellen. Nach Injektion der Zellen in die Schwanzvene der Nacktmäuse konnte keine Entwicklung von Metastasen im Tierkörper festgestellt werden. IN DER VORLIEGENDEN ARBEIT WURDE NACHGEWIESEN: • RAGE ist ein Rezeptor für das S100A4-Protein. Allerdings gibt es eindeutige Hinweise für weitere S100A4-Zielproteine an der Zelloberfläche. • Die bedeutende Rolle von extrazellulärem S100A4 bei wichtigen zellulären Metastasierungsprozessen sowie bei der Aktivierung von Signalproteinen wie NF-κB und RAGE beim malignen Melanom. Die weitere Aufklärung der S100A4-spezifischen Signalkaskaden und Rezeptoren bei metastasierenden Tumorerkrankungen sowie die Charakterisierung von S100A4 als klinischen Parameter bei Patienten mit malignem Melanom stellen hoch interessante Aspekte in der Krebsforschung dar.