Il existe deux catégories de techniques de vectorisation d’ADN, les vecteurs viraux et non viraux. Parmi les stratégies non virales, on peut distinguer celles basées sur des techniques physiques, celles utilisant des molécules non chargées, et celles qui sont les plus utilisées, à savoir les approches utilisant des composés cationiques. Les copolymères amphiphiles non chargés, constitués de motifs oxyde de polyéthylène (POE) et oxyde de polypropylène (PPO), sont capables d’améliorer l’efficacité de transfection dans le muscle. Afin de mieux comprendre quelles propriétés sont requises pour avoir un transfert de gènes efficace, nous avons décidé de faire une étude structure-activité. Nous avons montré que tous les poloxamères testés augmentent l'expression au niveau musculaire de manière significative comparé à l’injection d’ADN nu. Ceci montre qu’il n’existe pas un composé unique pour améliorer le transfert de gène dans le muscle mais qu’il existe une grande flexibilité en termes de poids moléculaire et de rapport hydrophile/hydrophobe. En parallèle, des études ont été menées in vitro afin d’évaluer la cytotoxicité de ces produits et de mieux comprendre le mécanisme d’action de ces molécules. Nos résultats indiquent que ces polymères sont peu toxiques et que l’amélioration du transfert de gènes ne se fait pas en perméabilisant la membrane des cellules musculaires. Enfin, l’étude de l’acide déoxycholique, un acide biliaire, a donné des résultats très encourageants en transfert de gènes dans le muscle puisqu’une efficacité égale, voire supérieure, à celle des poloxamères a été obtenue. Toutefois, ces résultats restent à démontrer plus clairement. / There are two types of vectorization techniques of DNA, viral vectors and nonviral. Among non-viral strategies, we can distinguish those based on physical techniques, those using uncharged molecules, and those that are most used, namely approaches using cationic compounds. The uncharged amphiphilic copolymers, composed of units of polyethylene oxide (POE) and polypropylene oxide (PPO), can improve the efficiency of transfection in muscle. To better understand what properties are required to have an efficient gene transfer, we decided to study structure-activity. We showed that all tested poloxamers increase expression in muscle significantly compared to injection of naked DNA. This shows that there is not a single compound to improve gene transfer into muscle but there is great flexibility in terms of molecular weight and ratio of hydrophilic / hydrophobic. In parallel, studies were conducted in vitro to evaluate the cytotoxicity of these products and to better understand the mechanism of action of these molecules. Our results indicate that these polymers are not toxic and that the improvement of gene transfer is not in permeabilizing the membrane of muscle cells. Finally, the study deoxycholic acid, a bile acid, has yielded very encouraging results in gene transfer into muscle since equally effective or even superior to that of poloxamers has been obtained. However, these results remain to be demonstrated more clearly.

Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent un nouvel outilbiologique au potentiel prometteur pour l’amélioration de la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application est dans un premier temps devenue possible grâce à l’utilisation de lignées de cellules souches embryonnaires humaines porteuses de mutation causale de pathologie, obtenues au cours d’un diagnostique pré-implantatoire. Mon travail de thèse s’est inscrit dans la validation de ce nouveau concept en utilisant des lignées de cellules souches embryonnaires humaines porteuses de la mutation causale de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Ces cellules, ainsi que leurs progenies neurales et mésenchymateuses représentent un modèle pertinent pour l’étude des conséquences physiopathologiques de la mutation DM1 dans la mesure où elles reproduisent certaines caractéristiques moléculaires connues de la pathologie. Mon projet a eu pour objectif de caractériser d’un point de vue moléculaire et physiopathologique deux nouvelles altérations géniques identifiées par transcriptome différentiel entre les cellules contrôles et DM1. Ainsi, ce travail nous a permis d’identifier un nouveau marqueur, le facteur de transcription ZNF37A, dont l’expression est diminuée en association avec la mutation DM1 et qui serait impliqué dans les défauts myogéniques caractérisant cette pathologie. Parallèlement nous avons identifié un nouveau défaut d’épissage alternatif d’un gène impliqué dans la guidance axonale, l’EphA5 qui pourrait être impliqué dans les défauts cognitifs des patients DM1. / Abstract not available

La fusion membranaire est une étape essentielle du cycle infectieux du virus Influenza dont la compréhension est actuellement incomplète. La fusion nécessite la protéine de surface virale hémagglutinine et, en particulier, ses vingt acides aminés N-terminaux formant le peptide de fusion. Ce peptide a été démontré capable d’initier la fusion membranaire même lorsque séparé du reste de la protéine, mais le mécanisme moléculaire par lequel il y parvient reste méconnu. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons effectué des simulations de dynamique moléculaire du peptide de fusion, du mutant fusogène F9A et du mutant non fusogène W14A, dans des membranes modèles. Dans un premier temps, nous avons étudié la structure et la dynamique du peptide de fusion. Le peptide de fusion a adopté des conformations en hélice-a complète et en coude, et s’est positionné à l’interface membranaire presque parallèlement à la surface de la membrane. Les peptides mutants ont en plus adopté une structure en épingle. La dynamique des peptides a donc été associée à celle d’un V flexible, changeant de conformation par des mouvements de charnière. Dans un second temps, les perturbations membranaires induites par les peptides ont été étudiées par simulations. Ces perturbations incluent la protrusion des chaînes lipidiques et l’intrusion des têtes polaires. Ces deux perturbations ont été causées par des ponts hydrogène entre les phosphates lipidiques et les amides N-terminales des peptides s’insérant sous la surface de la membrane. La quantité d’intrusion des têtes polaires induite par les mutants en simulation était corrélée à leur activité fusogène expérimentale et à la profondeur d’insertion de leur extrémité N-terminale. Suivant ces résultats, nous proposons que l’intrusion des têtes polaires complémente la protrusion des chaînes lipidiques lors de la fusion membranaire en réduisant les forces répulsives entre les têtes polaires des membranes juxtaposées. Ce mécanisme modèle de fusion membranaire pourra avoir un impact sur les futures recherches d’antiviraux contre Influenza. / Membrane fusion is an essential step of the Influenza virus infectious cycle whose understanding remains incomplete. Fusion requires surface viral protein hemagglutinin and, in particular, its twenty N-terminal amino acids composing the fusion peptide. This peptide was shown to initiate fusion even when isolated from the rest of the protein, but the molecular mechanism by which it achieves membrane fusion is still misunderstood. To better understand this mechanism, we performed molecular dynamics simulations of the fusion peptide, fusogenic F9A mutant and nonfusogenic W14A mutant, in model membranes. First, we studied the structure and dynamics of the fusion peptide. The fusion peptide adopted straight a-helical and kinked conformations, and inserted at the membrane interface with an almost parallel orientation with the membrane surface. Mutant peptides additionaly adopted a hairpin structure. The dynamics of the peptides was hence compared to that of a flexible V, switching conformation by hinge movements. In a second step, fusion peptide-induced membrane perturbations were studied from simulations. Those perturbations include lipid tail protrusion and polar head intrusion. The two perturbations were caused by hydrogen bonding between lipid phosphates and membrane inserted peptide N-terminal amides. The amount of polar head intrusion induced by the mutant peptides in simulations was correlated to their experimental fusogenic activity and the insertion depth of their N-termini. Following those results, we propose that polar head intrusion would complement lipid tail protrusion during membrane fusion by reducing the repulsive forces between juxtaposed membranes polar heads. This model of membrane fusion mechanism may have an impact on future Influenza antiviral research.

Le but de ce travail était de développer une méthodologie de quantification de la microviscosité membranaire en se basant sur la technique de résonance paramagnétique électronique (RPE) associée au marquage de spin. La méthode a consisté à étalonner les spectres RPE dacides doxylstéariques présentant un groupement nitroxyle à différentes positions de leur chaîne hydrocarbonée dans des mélanges de glycérol/éthanol de viscosité connue. Des courbes étalons, reliant la viscosité au temps de corrélation (τc) et au paramètre dordre (S), ont ainsi été établies. Elles ont, ensuite, été utilisées pour létude de plusieurs systèmes membranaires (micelle, liposome, cellule). En premier lieu, la valeur de la viscosité locale au sein des micelles de détergents synthétiques (SDS, DTAB et CTAB) a été mesurée. Lévolution de cette microviscosité en fonction de la concentration en détergent a permis de donner une approche du phénomène dagrégation de ces micelles. De la même manière, les micelles de deux sels biliaires, le taurocholate et le taurodeoxycholate de sodium, ont été étudiées. Ces dernières présentent un corps micellaire beaucoup plus visqueux que leur région interfaciale hydrophile. En second lieu, la microviscosité à différentes profondeurs dans la bicouche lipidique des liposomes de DMPC a pu être quantifiée. Elle diminue en allant de la surface hydrophile vers le centre hydrophobe de la bicouche. Les effets de la température, du cholestérol et du propofol (PPF), agent hypnotique utilisé en anesthésie générale, sur la fluidité de la bicouche ont aussi été étudiés. Lincorporation du cholestérol dans la bicouche lipidique la stabilise et atténue, voire fait disparaître, la transition de phase. En revanche, le propofol fluidifie la bicouche lipidique. La technique de mesure de la microviscosité par RPE ne permet de mettre en évidence la fluidification quaux fortes concentrations en PPF (≥10-4 mol dm-3). La spectroscopie dabsorption de la mérocyanine 540 (MC540) a permis de montrer qualitativement que leffet existe également aux plus faibles concentrations en PPF (10-7 - 10-6 mol dm-3) qui correspondent aux concentrations atteintes en clinique. Leffet du PPF dans une de ces formulations commerciales Diprivan® sur la fluidité du DMPC na pas pu être étudié en raison de la présence de vésicules dintralipide dans sa composition. Ces vésicules perturbent à la fois les mesures RPE et celles dabsorption. Enfin, la microviscosité des membranes dérythrocytes et de cellules neuronales (Neuro-2a) a pu être quantifiée. A la température physiologique (37°C), la valeur de la microviscosité au centre de la membrane avoisine les 100 cP. Le PPF fluidifie les membranes cellulaires surtout au niveau de la surface de la bicouche lipidique. Cet effet est observable à partir dune concentration en PPF de 10-4 mol dm-3 dans les membranes des érythrocytes, et dès une concentration de 10-5 mol dm-3 dans les membranes des cellules Neuro-2a.

L'implication des métalloprotéases de la matrice extracellulaire (MMPs) lors de plusieurs étapes de la progression tumorale, telles que l'angiogenèse, l'invasion et la prolifération des cellules tumorales est clairement établie. Une MMP de forme membranaire, la MT1-MMP, est reconnue pour jouer un rôle clé dans ces processus. Elle est responsable de l'activation de la proMMP-2, dégrade plusieurs composantes de la matrice extracellulaire, induit la formation de réseaux de type capillaires, augmente le potentiel migratoire des cellules endothéliales et tumorales et joue un rôle dans la signalisation cellulaire. La surexpression de la MT1-MMP, fréquente chez les cellules cancéreuses, induit des changements dans la morphogenèse, l'adhésion et la migration des cellules, mais le mécanisme impliqué demeure encore mal compris. La kinase d'adhésion focale (FAK), principale protéine responsable de la régénération des complexes d'adhésion focale, est aussi impliquée dans la formation et la progression tumorale. L'objectif de cette étude était de déterminer si la MT1-MMP s'associe à FAK ainsi qu'à d'autres protéines des complexes d'adhésion et de déterminer le rôle que jouent ces associations, particulièrement lors du phénomène de l'angiogenèse. L'approche expérimentale utilise des immunoprécipitations sur des lysats de protéines isolées de lignées cellulaires endothéliales (HUVEC et BAEC). Les données obtenues démontrent une forte association de la MT1-MMP avec FAK, p130cas, Src et vinculine, mais pas avec les protéines actine et paxilline. Ces interactions sont dépendantes de stimulations à la sphingosine-1-phosphate (S1P) et au facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). Les domaines structuraux de la MT1-MMP nécessaires aux associations dépendent du temps de stimulation des cellules. En effet, la portion catalytique a été trouvée essentielle aux associations décrites lors de stimulations de courtes durées (5 minutes) à la S1P, alors que la portion cytoplasmique semble jouer un rôle prédominant lors de stimulations de 48 heures en présence de sérum et avec surexpression de Src. Il a également été observé que la cavéoline-1 agit comme régulateur négatif de ces associations. En bref, la MT1-MMP s'associe avec plusieurs composantes des complexes d'adhésion focale, ce qui suggère qu'elle permet la régénération de ces structures cellulaires. Le résultat global obtenu, au niveau de la cellule, est une migration cellulaire accrue et une induction de l'angiogenèse chez les cellules endothéliales. En perspective, des études de colocalisation en microscopie sont également envisagées. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cancer, angiogenèse, MT1-MMP, complexes d'adhésion focale, cavéoline-1

Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences animales : Toulouse, INPT : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 295 réf.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Lintégrité de la structure et de la dynamique de la membrane plasmatique est essentielle à la fonction de la cellule. Cette intégrité peut être évaluée par la mesure de la fluidité membranaire globale, reflet de lensemble des mouvements des éléments membranaires au sein de la bicouche phospholipidique. Or lintégrité de la membrane est menacée, entre autre, par les modifications de la structure lipidique résultant de lipoperoxidations. Ces peroxidations lipidiques résultent des attaques radicalaires par des espèces oxygénées activées (EOA) produites lors dagression oxydante sur les acides gras membranaires. Nous posons lhypothèse que les conditions doxygénations extrêmes, qui peuvent être rencontrées lors dune anesthésie ou lors dun stress oxydant induit par lexercice chez le cheval, peuvent affecter la fluidité membranaire des érythrocytes et que ces variations peuvent être modulées par la modification de la structure membranaire du globule rouge par un supplément antioxydant oral adéquat. Lobjectif de ce travail est donc dévaluer les effets de différentes conditions doxygénation et doxydation in vitro (par contact avec différents mélanges gazeux), puis in vivo sous anesthésie générale (en faisant varier la fraction inspirée en oxygène) et à lexercice, et enfin dévaluer les effets dune supplémentation enrichie en acides gras de type oméga-3 sur la fluidité membranaire du globule rouge. Les faibles pressions partielles en oxygène dans le sang artériel (PaO2), obtenues in vitro par contact du sang avec un gaz anoxique et in vivo sous anesthésie par inspiration dair ambiant (<45mmHg et <60mmHg respectivement), nont pas eu deffet sur la fluidité ni sur la structure de la membrane érythrocytaire. On peut supposer que le stimulus est insuffisant ou que la protection de la membrane résulte dune capacité antioxydante du plasma et de défenses cellulaires suffisantes. Les pressions partielles élevées en oxygène dans le sang, obtenues in vitro par contact du sang avec de loxygène pur (PaO2>500mmHg), ont induit un stress oxydant modéré qui na pas affecté la structure phospholipidique de la membrane malgré la peroxidation des acides gras de type oméga-6. La fluidité membranaire na pas été affectée par ces facteurs. In vivo, les pressions partielles élevées en oxygène observées dans le sang (>200mmHg) ont été insuffisantes pour induire des peroxidations significatives et des modifications de la fluidité membranaire. En revanche, les valeurs élevées de PaO2 ont augmenté la sensibilité du sang à lhémolyse dans un premier temps, puis sa résistance 24 heures après un retour à la normoxie. Dans ces conditions aucun effet na été noté sur la viscosité du sang ni la perfusion musculaire. Par ailleurs, lexercice intense semble diminuer la fluidité membranaire du globule rouge chez le cheval de sport. Cette diminution sobserve dès 15 minutes après larrêt de lexercice et persiste 24 heures après. Il existe également des corrélations entre certains de ces marqueurs indirects et la fluidité membranaire. La supplémentation na pas eu deffet significatif direct sur lévolution de la fluidité membranaire observée au repos. Mais elle a pourtant influencé la structure de la membrane. En effet, la complémentation a induit une augmentation du pourcentage dacides gras de type oméga-3 contenus dans la membrane érythrocytaire ainsi que du ratio oméga-3/oméga-6 pendant la période de repos. Cela résulte de lincorporation sélective dans la membrane de lacide eicosapentaénoïque (EPA) et de lacide docosahéxaénoïque (DHA) apportés par voie orale. Mais aucune corrélation na été observée dans notre étude entre la composition en acides gras de la membrane et le marqueur de la fluidité membranaire. La supplémentation na pas eu deffet significatif direct sur lévolution de la fluidité membranaire observée à lexercice, mais en a limité la diminution immédiate. Il résulte des études menées que : les conditions doxygénation les plus extrêmes qui peuvent être rencontrées en conditions atmosphériques ne semblent pas affecter la fluidité de la membrane. En revanche, un exercice intense, associé à une demande énergétique accrue, peut induire une diminution de la fluidité membranaire en corrélation avec les marqueurs du stress oxydant. Des modifications de la structure membranaire en acides gras polyinsaturés à longue chaîne de type oméga-3 naffectent pas la fluidité membranaire mais modulent les effets du stress oxydant lors de lexercice. La fluidité membranaire des érythrocytes pourrait être considérée comme un marqueur direct du stress oxydant dans certaines conditions. Mais ce marqueur semble moins sensible et global que dautres marqueurs du stress cellulaire tels que le test dhémolyse ou la mesure de la concentration plasmatique de peroxydes lipidiques spécifiques. The maintenance of plasmatic membrane integrity is mandatory for cell function. This integrity can be assessed by the measurement of global membrane fluidity which is proportional to the whole rotational and lateral diffusion rates of membrane components within the phospholipid bilayer. Membrane integrity could be threatened by changes in lipid structure as a result of lipid peroxidation by free radical species during oxidative stress. We hypothesize that extreme oxygenation status present during anesthesia or during exercise-induced oxidative stress in the horse can alter erythrocyte membrane fluidity (EMF), and that these changes in fluidity depend on variations in erythrocyte membrane structure under the action of an appropriate oral anti-oxidant supplementation. The aims of the study was: to assess the effect(s) of various oxygenation and oxidative conditions firstly created in vitro (by contact between erythrocyte and different gaz mixtures), and secondly in vivo during general anesthesia (with varying inspired oxygen fractions) as well as during exercise. To assess the effects of an omega-3 fatty acid-enriched supplementation on EMF. Low partial oxygen pressures, both obtained in vitro and in vivo under anesthesia (respectively <45 and <60 mmHg) did not have any effect on EMF or membrane structure. Erythrocyte membrane may have been protected by an increase in plasmatic anti-oxidative capacity and cellular defenses. High partial oxygen pressures (>500 mm Hg) obtained in vitro induced a moderate oxidative stress which did not alter the phospholipidic structure of the membrane despite peroxidation of omega 6 fatty acids. Partial oxygen pressures obtained in vivo (>200 mm Hg) were unable to induce significant peroxidation and alteration in membrane fluidity. However, high PaO2 values initially increased sensitivity of blood to hemolysis, followed by a tendency towards resistance to hemolysis after 24hours. Intense exercise decreases EMF in the sports horse. This was observed as soon as 15 minutes after exercise and persisted during the recovery period 24 hours later. Correlations were found between oxidative stress indirect markers and membrane fluidity. Supplementation did not affect membrane fluidity but influenced membrane structure by increasing the pourcentage of omega-3 fatty acids and the omega3/omega6 ratio at rest. These changes resulted from selective incorporation into the membrane of orally provided EPA and DHA . However, we could not evidence a correlation between membrane composition and the marker of membrane fluidity (correlation-relaxation time Tc). During exercise, supplementation had no direct effect on variations of membrane fluidity but tapered its immediate decrease. In conclusion, our studies show that the most extreme conditions encountered under atmospheric conditions do not appear to affect EMF. However intense exercise combined with increased energetic requirements induces a decrease in EMF which correlates with variations in markers of oxidative stress. Modifications of membrane composition in long-chain omega-3 polyinsaturated fatty acids do not affect EMF but modulate oxidative stress during exercise. EMF could be a direct marker of oxidative stress under certain conditions but appears less sensitive and comprehensive than other markers of celllular stress such as the hemolysis test or the concentration in specific lipidic peroxidation products.