Il existe deux catégories de techniques de vectorisation d’ADN, les vecteurs viraux et non viraux. Parmi les stratégies non virales, on peut distinguer celles basées sur des techniques physiques, celles utilisant des molécules non chargées, et celles qui sont les plus utilisées, à savoir les approches utilisant des composés cationiques. Les copolymères amphiphiles non chargés, constitués de motifs oxyde de polyéthylène (POE) et oxyde de polypropylène (PPO), sont capables d’améliorer l’efficacité de transfection dans le muscle. Afin de mieux comprendre quelles propriétés sont requises pour avoir un transfert de gènes efficace, nous avons décidé de faire une étude structure-activité. Nous avons montré que tous les poloxamères testés augmentent l'expression au niveau musculaire de manière significative comparé à l’injection d’ADN nu. Ceci montre qu’il n’existe pas un composé unique pour améliorer le transfert de gène dans le muscle mais qu’il existe une grande flexibilité en termes de poids moléculaire et de rapport hydrophile/hydrophobe. En parallèle, des études ont été menées in vitro afin d’évaluer la cytotoxicité de ces produits et de mieux comprendre le mécanisme d’action de ces molécules. Nos résultats indiquent que ces polymères sont peu toxiques et que l’amélioration du transfert de gènes ne se fait pas en perméabilisant la membrane des cellules musculaires. Enfin, l’étude de l’acide déoxycholique, un acide biliaire, a donné des résultats très encourageants en transfert de gènes dans le muscle puisqu’une efficacité égale, voire supérieure, à celle des poloxamères a été obtenue. Toutefois, ces résultats restent à démontrer plus clairement. / There are two types of vectorization techniques of DNA, viral vectors and nonviral. Among non-viral strategies, we can distinguish those based on physical techniques, those using uncharged molecules, and those that are most used, namely approaches using cationic compounds. The uncharged amphiphilic copolymers, composed of units of polyethylene oxide (POE) and polypropylene oxide (PPO), can improve the efficiency of transfection in muscle. To better understand what properties are required to have an efficient gene transfer, we decided to study structure-activity. We showed that all tested poloxamers increase expression in muscle significantly compared to injection of naked DNA. This shows that there is not a single compound to improve gene transfer into muscle but there is great flexibility in terms of molecular weight and ratio of hydrophilic / hydrophobic. In parallel, studies were conducted in vitro to evaluate the cytotoxicity of these products and to better understand the mechanism of action of these molecules. Our results indicate that these polymers are not toxic and that the improvement of gene transfer is not in permeabilizing the membrane of muscle cells. Finally, the study deoxycholic acid, a bile acid, has yielded very encouraging results in gene transfer into muscle since equally effective or even superior to that of poloxamers has been obtained. However, these results remain to be demonstrated more clearly.

Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent un nouvel outilbiologique au potentiel prometteur pour l’amélioration de la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application est dans un premier temps devenue possible grâce à l’utilisation de lignées de cellules souches embryonnaires humaines porteuses de mutation causale de pathologie, obtenues au cours d’un diagnostique pré-implantatoire. Mon travail de thèse s’est inscrit dans la validation de ce nouveau concept en utilisant des lignées de cellules souches embryonnaires humaines porteuses de la mutation causale de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Ces cellules, ainsi que leurs progenies neurales et mésenchymateuses représentent un modèle pertinent pour l’étude des conséquences physiopathologiques de la mutation DM1 dans la mesure où elles reproduisent certaines caractéristiques moléculaires connues de la pathologie. Mon projet a eu pour objectif de caractériser d’un point de vue moléculaire et physiopathologique deux nouvelles altérations géniques identifiées par transcriptome différentiel entre les cellules contrôles et DM1. Ainsi, ce travail nous a permis d’identifier un nouveau marqueur, le facteur de transcription ZNF37A, dont l’expression est diminuée en association avec la mutation DM1 et qui serait impliqué dans les défauts myogéniques caractérisant cette pathologie. Parallèlement nous avons identifié un nouveau défaut d’épissage alternatif d’un gène impliqué dans la guidance axonale, l’EphA5 qui pourrait être impliqué dans les défauts cognitifs des patients DM1. / Abstract not available

La fusion membranaire est une étape essentielle du cycle infectieux du virus Influenza dont la compréhension est actuellement incomplète. La fusion nécessite la protéine de surface virale hémagglutinine et, en particulier, ses vingt acides aminés N-terminaux formant le peptide de fusion. Ce peptide a été démontré capable d’initier la fusion membranaire même lorsque séparé du reste de la protéine, mais le mécanisme moléculaire par lequel il y parvient reste méconnu. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons effectué des simulations de dynamique moléculaire du peptide de fusion, du mutant fusogène F9A et du mutant non fusogène W14A, dans des membranes modèles. Dans un premier temps, nous avons étudié la structure et la dynamique du peptide de fusion. Le peptide de fusion a adopté des conformations en hélice-a complète et en coude, et s’est positionné à l’interface membranaire presque parallèlement à la surface de la membrane. Les peptides mutants ont en plus adopté une structure en épingle. La dynamique des peptides a donc été associée à celle d’un V flexible, changeant de conformation par des mouvements de charnière. Dans un second temps, les perturbations membranaires induites par les peptides ont été étudiées par simulations. Ces perturbations incluent la protrusion des chaînes lipidiques et l’intrusion des têtes polaires. Ces deux perturbations ont été causées par des ponts hydrogène entre les phosphates lipidiques et les amides N-terminales des peptides s’insérant sous la surface de la membrane. La quantité d’intrusion des têtes polaires induite par les mutants en simulation était corrélée à leur activité fusogène expérimentale et à la profondeur d’insertion de leur extrémité N-terminale. Suivant ces résultats, nous proposons que l’intrusion des têtes polaires complémente la protrusion des chaînes lipidiques lors de la fusion membranaire en réduisant les forces répulsives entre les têtes polaires des membranes juxtaposées. Ce mécanisme modèle de fusion membranaire pourra avoir un impact sur les futures recherches d’antiviraux contre Influenza. / Membrane fusion is an essential step of the Influenza virus infectious cycle whose understanding remains incomplete. Fusion requires surface viral protein hemagglutinin and, in particular, its twenty N-terminal amino acids composing the fusion peptide. This peptide was shown to initiate fusion even when isolated from the rest of the protein, but the molecular mechanism by which it achieves membrane fusion is still misunderstood. To better understand this mechanism, we performed molecular dynamics simulations of the fusion peptide, fusogenic F9A mutant and nonfusogenic W14A mutant, in model membranes. First, we studied the structure and dynamics of the fusion peptide. The fusion peptide adopted straight a-helical and kinked conformations, and inserted at the membrane interface with an almost parallel orientation with the membrane surface. Mutant peptides additionaly adopted a hairpin structure. The dynamics of the peptides was hence compared to that of a flexible V, switching conformation by hinge movements. In a second step, fusion peptide-induced membrane perturbations were studied from simulations. Those perturbations include lipid tail protrusion and polar head intrusion. The two perturbations were caused by hydrogen bonding between lipid phosphates and membrane inserted peptide N-terminal amides. The amount of polar head intrusion induced by the mutant peptides in simulations was correlated to their experimental fusogenic activity and the insertion depth of their N-termini. Following those results, we propose that polar head intrusion would complement lipid tail protrusion during membrane fusion by reducing the repulsive forces between juxtaposed membranes polar heads. This model of membrane fusion mechanism may have an impact on future Influenza antiviral research.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le but de ce travail était de développer une méthodologie de quantification de la microviscosité membranaire en se basant sur la technique de résonance paramagnétique électronique (RPE) associée au marquage de spin. La méthode a consisté à étalonner les spectres RPE dacides doxylstéariques présentant un groupement nitroxyle à différentes positions de leur chaîne hydrocarbonée dans des mélanges de glycérol/éthanol de viscosité connue. Des courbes étalons, reliant la viscosité au temps de corrélation (τc) et au paramètre dordre (S), ont ainsi été établies. Elles ont, ensuite, été utilisées pour létude de plusieurs systèmes membranaires (micelle, liposome, cellule). En premier lieu, la valeur de la viscosité locale au sein des micelles de détergents synthétiques (SDS, DTAB et CTAB) a été mesurée. Lévolution de cette microviscosité en fonction de la concentration en détergent a permis de donner une approche du phénomène dagrégation de ces micelles. De la même manière, les micelles de deux sels biliaires, le taurocholate et le taurodeoxycholate de sodium, ont été étudiées. Ces dernières présentent un corps micellaire beaucoup plus visqueux que leur région interfaciale hydrophile. En second lieu, la microviscosité à différentes profondeurs dans la bicouche lipidique des liposomes de DMPC a pu être quantifiée. Elle diminue en allant de la surface hydrophile vers le centre hydrophobe de la bicouche. Les effets de la température, du cholestérol et du propofol (PPF), agent hypnotique utilisé en anesthésie générale, sur la fluidité de la bicouche ont aussi été étudiés. Lincorporation du cholestérol dans la bicouche lipidique la stabilise et atténue, voire fait disparaître, la transition de phase. En revanche, le propofol fluidifie la bicouche lipidique. La technique de mesure de la microviscosité par RPE ne permet de mettre en évidence la fluidification quaux fortes concentrations en PPF (≥10-4 mol dm-3). La spectroscopie dabsorption de la mérocyanine 540 (MC540) a permis de montrer qualitativement que leffet existe également aux plus faibles concentrations en PPF (10-7 - 10-6 mol dm-3) qui correspondent aux concentrations atteintes en clinique. Leffet du PPF dans une de ces formulations commerciales Diprivan® sur la fluidité du DMPC na pas pu être étudié en raison de la présence de vésicules dintralipide dans sa composition. Ces vésicules perturbent à la fois les mesures RPE et celles dabsorption. Enfin, la microviscosité des membranes dérythrocytes et de cellules neuronales (Neuro-2a) a pu être quantifiée. A la température physiologique (37°C), la valeur de la microviscosité au centre de la membrane avoisine les 100 cP. Le PPF fluidifie les membranes cellulaires surtout au niveau de la surface de la bicouche lipidique. Cet effet est observable à partir dune concentration en PPF de 10-4 mol dm-3 dans les membranes des érythrocytes, et dès une concentration de 10-5 mol dm-3 dans les membranes des cellules Neuro-2a.

L'implication des métalloprotéases de la matrice extracellulaire (MMPs) lors de plusieurs étapes de la progression tumorale, telles que l'angiogenèse, l'invasion et la prolifération des cellules tumorales est clairement établie. Une MMP de forme membranaire, la MT1-MMP, est reconnue pour jouer un rôle clé dans ces processus. Elle est responsable de l'activation de la proMMP-2, dégrade plusieurs composantes de la matrice extracellulaire, induit la formation de réseaux de type capillaires, augmente le potentiel migratoire des cellules endothéliales et tumorales et joue un rôle dans la signalisation cellulaire. La surexpression de la MT1-MMP, fréquente chez les cellules cancéreuses, induit des changements dans la morphogenèse, l'adhésion et la migration des cellules, mais le mécanisme impliqué demeure encore mal compris. La kinase d'adhésion focale (FAK), principale protéine responsable de la régénération des complexes d'adhésion focale, est aussi impliquée dans la formation et la progression tumorale. L'objectif de cette étude était de déterminer si la MT1-MMP s'associe à FAK ainsi qu'à d'autres protéines des complexes d'adhésion et de déterminer le rôle que jouent ces associations, particulièrement lors du phénomène de l'angiogenèse. L'approche expérimentale utilise des immunoprécipitations sur des lysats de protéines isolées de lignées cellulaires endothéliales (HUVEC et BAEC). Les données obtenues démontrent une forte association de la MT1-MMP avec FAK, p130cas, Src et vinculine, mais pas avec les protéines actine et paxilline. Ces interactions sont dépendantes de stimulations à la sphingosine-1-phosphate (S1P) et au facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). Les domaines structuraux de la MT1-MMP nécessaires aux associations dépendent du temps de stimulation des cellules. En effet, la portion catalytique a été trouvée essentielle aux associations décrites lors de stimulations de courtes durées (5 minutes) à la S1P, alors que la portion cytoplasmique semble jouer un rôle prédominant lors de stimulations de 48 heures en présence de sérum et avec surexpression de Src. Il a également été observé que la cavéoline-1 agit comme régulateur négatif de ces associations. En bref, la MT1-MMP s'associe avec plusieurs composantes des complexes d'adhésion focale, ce qui suggère qu'elle permet la régénération de ces structures cellulaires. Le résultat global obtenu, au niveau de la cellule, est une migration cellulaire accrue et une induction de l'angiogenèse chez les cellules endothéliales. En perspective, des études de colocalisation en microscopie sont également envisagées. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cancer, angiogenèse, MT1-MMP, complexes d'adhésion focale, cavéoline-1

Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences animales : Toulouse, INPT : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 295 réf.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La libération dopaminergique permet de transmettre des signaux importants sur la motivation et le contrôle moteur. Le transporteur de dopamine DAT est un acteur important de ce phénomène et implique dans sa régulation Rit2, une GTPase liée à plusieurs pathologies comme la maladie de Parkinson et la schizophrénie. La dopamine est également impliquée dans l'apprentissage par renforcement et la signalisation de stimulus appétitifs et aversifs. Nous avons mesuré, dans des modèles de surexpression et de répression génique de Rit2 dans les neurones dopaminergiques, la quantité de DAT, l'activité électrique, la signalisation dopaminergique et l'effet sur le comportement. Nous avons également observé la libération dopaminergique chez des animaux dans un paradigme de conditionnement classique avec un senseur de dopamine et la photométrie à fibre. La surexpression de RIT2 dans les neurones dopaminergiques a mené à une diminution de DAT et des neurones plus actifs et synchronisés présentant une amplitude de libération dopaminergique réduite. La répression génique de Rit2 a mené à une augmentation des niveaux de DAT et une réduction de la durée du signal dopaminergique. Finalement, la modification de l'expression de Rit2 a eu un impact sur un comportement d'apprentissage. Nos résultats montrent également une libération dopaminergique suivant la récompense dans toutes les cibles étudiées, mais une réponse hétérogène à la punition. En particulier, les cibles présentant une réponse à la punition plus grande ou égale à celle de la récompense encodaient moins l'attente de la récompense. Nos données indiquent que la modification de l'expression de Rit2 a un impact sur la signalisation dopaminergique, possiblement à travers une modification de la disponibilité de DAT. De plus, on observe que les cibles présentant une plus grande réponse à la récompense présentent une signalisation similaire à la théorie de l'erreur de prédiction de la récompense, à la différence des autres cibles étudiées. / Dopamine release allows for transmission of important signals linked to motivation and motor control. The dopamine transporter DAT is an important player in this signaling and involves in its regulation Rit2, a GTPase linked to disorders such as Parkinson's disease and schizophrenia. Dopamine is also implicated in reinforcement learning and signaling of appetitive and aversive stimuli. Here, we measured, in models of overexpression and knock-down of Rit2, the amount of DAT, the electrical activity, the dopaminergic signaling dynamics and the effect on behavior of the modification of the expression of Rit2. We also measured dopamine release with a dopamine sensor and fiber photometry in animals trained on a classical conditioning paradigm. Overexpression of Rit2 led to a reduction of DAT, and the reverse was observed in the knock-down condition. Neurons overexpressing Rit2 were more active and synchronized and showed a reduction in the amplitude of dopamine release. Knock-down of Rit2 led to a shorter dopamine signal following optogenetic stimulation. Finally, modification of the expression of Rit2 impacted learning behavior. Our results showed dopamine release following reward in all our investigated targets, but a diversity of responses to punishment in those same targets. Targets showing bigger or equal response to punishment when comparing to reward showed less encoding of reward expectation, contrary to the ones signaling more reward, who showed a stronger encoding of reward expectation. Our data show that modifying the expression of Rit2 impacts dynamics of dopamine signaling, possibly through the modification of the amount of DAT. Moreover, we observed that the targets showing a bigger response to reward presented a signaling in line with the reward prediction error, contrary to the other targets.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.