Les dysferlinopathies constituent un groupe de dystrophies musculaires autosomiques récessives comprenantprincipalement la myopathie des ceintures (LGMD) de type 2B et la myopathie distale de Miyoshi. Elles sont causéespar des mutations dans le gène DYSF qui se situe dans la région chromosomique 2p13.1-13.3 (NM_003494). Ce gènecomporte 55 exons répartis sur plus de 230 kb. Il est exprimé principalement dans le muscle squelettique etcardiaque, mais également dans d'autres tissus (placenta...) et types cellulaires tels que lesmonocytes/macrophages. La dysferline (2080 acides aminés, 237 kDa, O75923) fait partie de la famille des Ferlineset comporte 7 domaines C2, senseur de calcium et un domaine transmembranaire C-terminal.La dysferline participe à la formation des tubules-T et à la fusion des myoblastes en myotubes avec lamyoferline (un autre membre de la famille). Elle est localisée au sarcolemme de la fibre musculaire squelettiqueadulte, où elle joue un rôle dans sa réparation. En effet, chez l’homme comme dans les modèles murins, en absencede dysferline, des vésicules, dont la nature n’est pas clairement établie, s’accumulent sous le sarcolemme lésé sansfusionner avec celui-ci. Elle interagirait avec plusieurs protéines membranaires ou cytosoliques, dont certaines(comme la cavéoline 3) sont aussi impliquées dans d’autres formes de LGMD.Au cours de ma thèse, mon travail a été axé d’une part sur l’amélioration des techniques de diagnostic : étudede délétion/duplication dans le gène DYSF par CGH et le développement d’un test permettant d’évaluerl’absence/présence de la dysferline à partir de sang total par des techniques de FACS et d’immunofluorescence.D’autre part j’ai également étudié la pertinence d’approches thérapeutiques. Ainsi, nous avons mis en évidence unelarge délétion homozygote des ¾ du gène DYSF chez une patiente présentant un phénotype modéré dedysferlinopathies. Cette délétion permet cependant la production d’une dysferline tronquée. L’identification decette miniprotéine, la première identifiée à ce jour a permis de mettre en évidence l’aspect en partie modulaire dela dysferline. Une autre donnée sur le caractère modulaire de la dysferline est apparue dans la littérature, cette foismontrant le caractère dispensable de l’exon 32. Sur la base de cette observation clinique, nous avons développéune approche thérapeutique par saut d’exon pour les dysferlinopathies, en démontrant dans un premier temps safaisabilité technique sur l’exon 32.L’ensemble de ces travaux permettront probablement l’amélioration du diagnostic différentiel desdysferlinopathies, tout en fournissant de nouvelles pistes pour comprendre les rôles de la dysferline et offrir ainsides pistes thérapeutiques pour le traitement de patients souffrant de ces pathologies. / Dysferlinopathies are a group of autosomal recessive muscular disorders including mainly limb girdlemuscular dystrophy 2B (LGMD2B) and Miyoshi Myopathy (MM), caused by mutation in DYSF gene (2p13.1-13.3). It is composed by 55 exons spreading on 234 kb of genomic DNA and it is expressed mainly in skeletal and heart muscle and monocytes/macrophages.Dysferlin (2080 amino-acids, molecular weight 237 kDa) belongs to the Ferlin family as Myoferline, which is also expressed in muscle. Dysferlin is involved with Myoferlin in myoblasts fusion and T-tubule formation. In adult skeletal muscle, Dysferlin is localized at the sarcolemma where it plays its main function: the sarcolemma repair after muscular wounding. It has been suggested that Dysferlin allows them to fuse with the plasma membrane in order to provide the required plasma membrane to reseal the wound. During these years, my work was essentially focused on the improvement of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), the functional exploration of diagnosis technique (evaluation of CGH array to detect deletion/duplication event in DYSF gene and development of test able to detect absence/presence of Dysferlin in whole blood), and the development of promising therapeutics approaches: AAV gene transfer of a minidysferlin which was identified in patient presenting a mild phenotype and for the first time the demonstration of the feasibility of an exon-skipping therapeutics strategy for dysferlinopathies.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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La mucoviscidose est une maladie génétique due à des mutations du gène CFTR, conduisant à une altération de la fonction de canal à ions chlorure de la glycoprotéine transmembranaire CFTR associée à une atteinte pulmonaire sévère. Plusieurs études récentes ont amené à reconsidérer l’utilisation des vecteurs adénoviraux (Ad) de sérotype 5 (Ad5) dans la mucoviscidose, lesquels induisent non seulement des réactions immunes anti-adénovirales mais aussi des effets cytopathiques indésirables. (1) Dans une première partie de notre étude, nous avons étudié l’entrée et le transit intracellulaire de l’Ad5/F35, vecteur chimérique portant les fibres de l’Ad sérotype 35 sur une capside de sérotype 5. Nous avons montré que la protéine fibre est déterminante dans l’internalisation et le trafic intracellulaire de ce vecteur. Le vecteur Ad5/F35 exprimant la fusion GFP-CFTR s’est révélé (i) être dépourvu de cytotoxicité, (ii) transduire efficacement les cellules épithéliales pulmonaires par voie apicale, et (iii) restaurer l’activité de canal à chlorure dans les cellules CFTR(-). Il constitue donc un vecteur de transfert du gène CFTR potentiellement utilisable en thérapie génique de la mucoviscidose. (2) Dans une seconde partie, nous avons exploré une stratégie alternative de transfert de la protéine CFTR par trogocytose. Nous avons fait l’hypothèse que le canal CFTR pouvait être véhiculé par des microvésicules ou microparticules membranaires (MP) émanant de la membrane cellulaire et libérées dans le milieu de culture. En utilisant un système d’expression stable de la protéine CFTR étiquetée par la protéine fluorescente GFP (GFP-CFTR) dans des cellules donneuses, nous avons pu démontrer que les MP sont capables de prendre en charge et délivrer la protéine GFP-CFTR à des cellules réceptrices, mais ce transfert n’est assuré que par une population réduite de MP (≤ 8 %), et la durée de vie du GFP-CFTR n’est que transitoire (≤ 24h). En fait, la majorité des MP transfèrent des molécules d’ARN messager ou polysomal GFP-CFTR. La protéine GFP-CFTR néosynthétisée à partir de ces ARNm est exprimée plus tardivement (> 48h) mais de façon prolongée (≥ 10 jours). La fonctionnalité du canal CFTR ainsi néosynthétisé est en cours d’évaluation. Les MP constituent donc un nouveau type de vecteurs de transfert non génique du CFTR qui pourraient être employés en thérapie de la mucoviscidose. / The cystic fibrosis (CF) is a genetic disease due to mutations of the CFTR gene, resulting in the alteration of the Cl channel function carried by the transmembranal glycoprotein CFTR, and associated with severe pulmonary complications. Several recent studies led the medical and scientific community to reconsider the use of adenovirus serotype 5 (Ad5)-based vectors as CFTR gene transfer vectors in CF gene therapy. Not only immune response against the vector itself and the ansduced cells have been observed, but also Ad5-induced nondesired cytopathic effects. (1) In the first part of our study, we analyzed the cell entry and traficking of Ad5/F35, a chimeric vector consisting of serotype 5 capsid carrying serotype 35 fibers. We showed that the fibre protein is the major, if not only, determinant of the internalisation and entry pathway of Ad5/F35. Ad5/F35-GFP-CFTR, expressing the fusin protein GF-CFTR, was found (i) to be devoid of detectable cytopathic effect, (ii) efficiently transduced airway epithélial cells via the apical pole, and (iii) restore the Cl channel function in CF cells. Ad5/F35 therefore represents a CFTR gene transfer vector with a great potential for gene therapy of CF. (2) In the second part of our study, we have investigated an alternative strategy based on the transfer of the mature CFTR protein via trogocytosis. We hypothesized that microvesicles or microparticules (MP) issued from the cell membranes and released into the culture medium could transport and achieve the cell-to-cell transfer of CFTR channel cargo. We engineered donor cells for stable expression of GFP-tagged CFTR protein (GFP-CFTR), and showed that donor cell-issued MP were capable of delivering GFP-CFTR protein to recipient cell. However, the GFP-CFTR protein was only transferred by a limited population of MP (≤ 8 %), and was only transient (≤ 24h). In fact, the major population of MP transferred mRNAGFP-CFTR or polysomal thereof. Interestingly, the GFPCFTR protein newly synthesized from this mRNAGFP-CFTR was expressed at late times after transfer (≥ 48 h) but in a prolonged manner (≥ 10 jours). The Cl canal function after MP-mediated CFTR transfer is being evaluated. MP represent a novel type of CFTR vectors which can be produced by specifically designed autologous donor cells, and which would overcome most of the inconveniences of gene therapy using viral or nonviral vectors.

Ce travail de thèse s'inscrit dans le cadre de la valorisation des co-produits issus des industries de transformation et de conserve de thon. Il porte sur la mise en oeuvre de l'hydrolyse enzymatique et des procédés de séparation membranaires en vue d'obtenir des composés d'intérêt comme les peptides et les acides aminés. Les techniques utilisées dans ce travail font partie des « technologie propre », visant une dépense énergétique et un investissement modérés. L'hydrolyse enzymatique a été menée pour identifier l'efficacité des enzymes sur la matrice afin de déterminer les conditions optimales d'hydrolyse en utilisant la méthodologie des plans d'expériences avec pour objectif l'enrichissement de la phase soluble en peptides de petite taille dotés d'activités biologiques intéressantes. Le fractionnement par la taille par ultrafiltration et Nanofiltration a été utilisé comme un procédé pour agir sur la distribution de la taille moléculaire de la population peptidique et sur les propriétés d'hydrolysat produit. Tout d'abord, un fractionnement à petite échelle a été réalisé avec des membranes de différents seuils de coupure et de différentes natures (organique et inorganique) afin de sélectionner la meilleure membrane répondant à notre objectif.Ensuite une étude d'optimisation des conditions opératoire a été réalisée pour les deux étapes de fractionnement UF et NF de manière à déterminer les meilleures conditions séparatives en utilisant un hydrolysat commercial. La validation du procédé de fractionnement en utilisant l'hydrolysat des co-produits de thon a été effectuée. Durant cette étude, différents modes de fractionnement utilisant différentes combinaisons d'UF et NFont été testés pour déterminer le meilleur procédé permettant la récupération du maximum de fractions peptidiques intéressantes. L'originalité de ce travail de thèse réside d'une part, dans l'enrichissement de l'hydrolysat des co-produit de thon en composés valorisables comme les acides aminés essentiels ainsi que les peptides dotés de valeur ajoutée et d'autre part, la mise en place d'un procédé de fractionnement pour la récupération des différentes fractions afin de mettre en évidence la conception d'un bioréacteurs enzymatique couplé à la technique membranaire. / This work is performed in the framework of up-grading of tuna by-products generated from processing and conditioning industries. The enzymatic hydrolysis combined with membrane separation processes in order to obtain the fraction of interest peptides and amino acids was studied. The optimal conditions during enzymatic hydrolysis were determined using the methodology of design of experiments in order to enrich the soluble phase in small peptides with interesting biological activities. The fractionation by Ultrafiltration and Nanofiltration following a suitable combination was studied. For this, firstly, a small-scale fractionation was performed with membranes of different cut-off and different natures (organic and inorganic) to select the best membrane processes combination and to optimize the used conditions. Then, a validation study of the fractionation using the hydrolysate of tuna by-products produced during was performed. In this study, different modes of fractionation combination of concentration and diafiltration steps were tested to determine the best method for the recovery of large quantities of interesting peptide fractions. The originality of this PhD work is the enrichment of the tuna by-products hydrolysate with valuable compounds such as essential amino acids and peptides with a high biological activity.

Bacterial pathogenesis relies on a subset of mechanisms including adhesion to various matrices, antibiotic resistance, defence and action against surrounding microorganisms, and secretion of virulence factors. Among the secretion systems, the recently identified Type VI secretion system (T6SS) has been shown to be involved in both virulence against eukaryotic cells and inter-bacterial warfare. T6SS are composed of a minimum of 13 proteins called "core components". It is believe to form a macromolecular system that spans the envelope to assemble an extracellular structure composed of the Hcp protein with a trimer of VgrG located at the tip. This model has been built following in silico and structural analyses demonstrating the link between several T6SS subunits and bacteriophage T4 baseplate and tail elements. Other T6SS subunits include membrane proteins. Using enteroaggregative Escherichia coli as a bacterial model, the aim of my work is to understand how this system assembles in the cell envelope. I recently showed that four of these membrane proteins, SciP, SciS, SciN and SciZ make contact to form a complex [1]. These four subunits are critical components of the T6SS. I then delineated the interaction network, demonstrating that SciZ interacts with SciP, and that SciS interacts with both SciP and SciN. Further characterization of these subunits showed that SciN is a lipoprotein associated with the outer membrane [2, 4], whereas SciP and SciS are inner membrane proteins anchored through a single and three transmembrane segments respectively. SciZ is a polytopic inner membrane protein carrying a peptidoglycan-binding motif within its periplasmic domain. Mutagenesis and peptidoglycan binding experiments demonstrated that SciZ anchors the T6SS to the cell wall [1, 3]. Overall, we have identified and characterized a trans-envelope complex anchored in both membrane and to the peptidoglycan layer. / Bacterial pathogenesis relies on a subset of mechanisms including adhesion to various matrices, antibiotic resistance, defence and action against surrounding microorganisms, and secretion of virulence factors. Among the secretion systems, the recently identified Type VI secretion system (T6SS) has been shown to be involved in both virulence against eukaryotic cells and inter-bacterial warfare. T6SS are composed of a minimum of 13 proteins called "core components". It is believe to form a macromolecular system that spans the envelope to assemble an extracellular structure composed of the Hcp protein with a trimer of VgrG located at the tip. This model has been built following in silico and structural analyses demonstrating the link between several T6SS subunits and bacteriophage T4 baseplate and tail elements. Other T6SS subunits include membrane proteins. Using enteroaggregative Escherichia coli as a bacterial model, the aim of my work is to understand how this system assembles in the cell envelope. I recently showed that four of these membrane proteins, SciP, SciS, SciN and SciZ make contact to form a complex [1]. These four subunits are critical components of the T6SS. I then delineated the interaction network, demonstrating that SciZ interacts with SciP, and that SciS interacts with both SciP and SciN. Further characterization of these subunits showed that SciN is a lipoprotein associated with the outer membrane [2, 4], whereas SciP and SciS are inner membrane proteins anchored through a single and three transmembrane segments respectively. SciZ is a polytopic inner membrane protein carrying a peptidoglycan-binding motif within its periplasmic domain. Mutagenesis and peptidoglycan binding experiments demonstrated that SciZ anchors the T6SS to the cell wall [1, 3]. Overall, we have identified and characterized a trans-envelope complex anchored in both membrane and to the peptidoglycan layer.