Le cancer du sein triple négatif (TNBC) représente entre 15-20% des cancers du sein et est l'un des types les plus agressifs. De plus, un sous-groupe de ces patientes est résistant à la radiothérapie (RT) et développe fréquemment une récidive hâtive de la maladie. Des études précédentes ont démontré que l’inflammation induite par la RT accélère la progression du cancer et le développement des métastases. Cette hypothèse a donc été validée dans un modèle pré-clinique de TNBC en implantant les cellules de carcinome de souris triple négatives D2A1 dans les glandes mammaires de la souris Balb/c. Premièrement, la tumeur primaire à été irradiée à une dose sous-curative une semaine post-implantation des cellules. En deuxième lieu, le tissu mammaire de la souris a été pré-irradié avant d'implanter les cellules cancéreuses afin de bien discerner l'effet du microenvironnement irradié sur celles-ci. Ces deux modèles ont mené à une augmentation significative des cellules tumorales circulantes ainsi que du nombre de métastases pulmonaires. Plusieurs molécules inflammatoires dont l'interleukine-1 bêta (IL-1β), l'interleukine-6 (IL-6) ou encore la cyclooxygénase 2 (COX-2) ont été identifiées comme facteurs clés impliqués dans la migration radio-induite des cellules cancéreuses du sein. Conséquemment, un inhibiteur large-spectre comme la chloroquine (CQ), entre autres utilisé comme traitement anti-malarien et anti-inflammatoire, a su prévenir ces effets secondaires associés à la RT. Étant donné que l'action de la CQ est peu sélective, une répression de l'expression de l'ARNm de la métalloprotéinase (MMP) de membrane de type 1 (MT1-MMP), une MMP de surface impliquée notamment dans la migration cellulaire, l'invasion tumorale et l'angiogenèse, a été réalisée afin d'éclaircir le mécanisme d'inhibition des métastases radio-induites. Cette répression de la MT1-MMP prévient la formation des métastases pulmonaires radio-induites, démontrant ainsi un des mécanisme important de l'invasion radio-induite. Ce résultat confirme donc l'importance de la MT1-MMP dans ce phénomène et son potentiel comme biomarqueur de prédiction de l'efficacité des traitements de RT, particulièrement chez les patientes atteintes de TNBC.

Yersinia pseudotuberculosis appartient à la famille des Enterobacteriaceae et peut être responsable de syndromes articulaires et digestifs. Au cours de la colonisation de l’hôte, une minorité des bactéries va, en plus de l’étape de multiplication extracellulaire présenter une phase de réplication intracellulaire dans les macrophages. Une partie des Y. pseudotuberculosis va se répliquer dans les macrophages en usurpant la voie de l’autophagie, afin de créer une niche réplicative au sein des autophagosomes bloqués dans leur maturation. Le trafic membranaire associé à l’infection de Y. pseudotuberculosis reste à ce jour peu caractérisé. Dans un premier temps, nous avons observé que lors de l’infection d’une cellule épithéliale par Y. pseudotuberculosis, la vacuole bactérienne est associée avec le marqueur des autophagosomes, la protéine LC3 mais de façon surprenante cette vacuole ne présente pas deux mais une membrane unique. Par ailleurs, nous avons montré que les protéines SNARE jouent un rôle majeur au cours du trafic intracellulaire de Y. pseudotuberculosis. VAMP3 et VAMP7 sont recrutées de manière séquentielle au niveau de la vacuole de Y. pseudotuberuclosis. VAMP7 va participer au recrutement de LC3 au niveau de la vacuole bactérienne et nous proposons que VAMP3 est un des constituants du check-point permettant l’adressage de la bactérie vers des vacuoles présentant une ou de multiple membranes positives pour LC3. Par la suite, nous nous sommes intéressés à la caractérisation des protéines de la voie autophagique et des endosomes, recrutées au niveau de la vacuole bactérienne à membrane unique et positive pour LC3. Nous avons mis en évidence que les protéines impliquées dans la formation de l’autophagosome et les marqueurs des endosomes précoces sont recrutées au niveau de la vacuole contenant Y. pseudotuberculosis. Cette vacuole positive pour LC3 va en suite acquérir les marqueurs des endosomes tardifs et du lysosome mais n’est pas acidifiée. En outre, nous avons initié des travaux sur un criblage en haut contenu afin d’identifier les partenaires des protéines SNARE et leurs rôles dans le trafic intracellulaire de Y. pseudotuberuclosis. Ces travaux démontrent l’importance de l’analyse de l’ultrastructure des compartiments positifs pour LC3. Ils illustrent comment la bactérie s’adapte à son environnement pour établir sa niche réplicative. Ils présentent enfin l’importance de la régulation de l’autophagie avec la première mise en évidence d’un check-point entre deux voies de compartimentation positives pour LC3 mais morphologiquement différentes. / Yersinia pseudotuberculosis is a member of the Enterobacteriaceae family. In human, Y. pseudotuberculosis infection is responsible for enteric and, in rare cases, erythema nodosum. During host colonization, a minor part of Y. pseudotuberculosis presents an intracellular replication step. Y. pseudotuberculosis can replicate inside macrophages by hijacking the autophagy pathway. The bacteria are able to block autophagosome maturation by acidification impairment, which allows to create a replicative niche. The membrane traffic during internalization of Yersinia remains poorly characterized. First, we highlighted that in epithelial cells, Y. pseudotuberculosis replicates mainly in vacuoles positive for LC3, a hallmark of autophagy. Surprisingly, this LC3-positive-vacuole presents only single limiting membrane. Second, we showed that SNARE proteins play a role in Y. pseudotuberculosis intracellular traffic. VAMP3 and VAMP7 are sequentially recruited to Yersinia-containing vacuoles (YCVs). VAMP7 is involved in the LC3 recruitment to YCVs with single- and double-membrane. We proposed that VAMP3 is a component of the molecular checkpoint for bacterial commitment to either single- or double-membrane LC3-positive pathway. Third, we characterized the traffic of endosomal proteins recruited to LC3-positive-YCV with single membrane in epithelial cells. We showed that markers of early endosome and proteins involved in autophagosome formation, are recruited to YCVs during the early stage of infection. Then, the vacuole acquire late endosomal and lysosomal proteins but acidification is not observed. Finally, we initiated a high-content screening approach for the identification of SNARE partners.Overall this work illustrates the importance of LC3-positive compartment ultrastructure analysis. Our result demonstrate how bacterial subvert the molecular machinery of the host in order to create a replicative niche. Finally, we present the importance of autophagy regulation by highlighting for the first times the existence of a molecular checkpoint between two LC3-positive vacuoles with different morphologies

La protéine humaine hERG (human ether-à-go-go related gene) s’associe en homo-tétramère pour former le canal potassique voltage-dépendant Kv11.1. C’est un acteur majeur de la repolarisation du potentiel d’action cardiaque par sa capacité à externaliser le potassium du cardiomyocyte. L’altération de sa fonction induit le syndrome du QT long à l’origine d’arythmies cardiaques et pouvant conduire à un arrêt du cœur. Ce syndrome parfois génétique provient le plus souvent d’une inhibition pharmacologique. De nombreux médicaments ont montré leur capacité à inhiber hERG en se fixant dans la lumière du canal. L’étude des interactions moléculaires entre hERG et médicaments intéresse les scientifiques depuis de nombreuses années. Très récemment, la première structure atomique de hERG à l’état ouvert par cryo-microscopie électronique a permis une avancée majeure dans la compréhension de l’agencement du pore du canal. De nombreuses questions restent malgré tout non résolues concernant les mécanismes de liaison des ligands. Plus encore, le développement d’approches biophysiques à partir de canal purifié permettraient de caractériser et d’anticiper des interactions avec les médicaments. Dans cette perspective, nous avons testé plusieurs stratégies pour obtenir le canal hERG purifié dans une forme stable, homogène et fonctionnelle. Notre étude est basée sur une construction simplifiée et chimérique du canal hERG, la version hERG(S1-coil). Chaque étape permettant la production et la purification d’une protéine membranaire a été optimisée en testant différentes techniques proposées par la littérature. Nous avons comparé les rendements d’expression du canal dans différents systèmes recombinants procaryotes ou eucaryotes. La quantité de protéine totale et le pourcentage de protéine fonctionnelle dans les membranes ont été étudiés. Dans un deuxième temps, le canal a été solubilisé puis purifié. Nous avons comparé les rendements de solubilisation et la stabilité protéique en fonction du type de détergent. En parallèle, nous avons mis au point des moyens techniques pour évaluer la fonction du canal au fur et à mesure du processus de production et purification. Le canal hERG(S1-coil) tétramérique et fonctionnel a finalement été identifié dans la fraction purifiée. Cependant, des optimisations sont encore à apporter pour conserver l’agencement tétramérique et empêcher l’agrégation au cours du temps avant de pouvoir envisager des études biophysiques et structurales. A terme, ces travaux pourraient profiter à la production et à la purification d’autres protéines membranaires oligomériques. / The human protein hERG (human ether-à-go-go related gene) assembles as homo-tetramer to form the voltage-gated potassium channel Kv11.1. This channel is involved in repolarization of the cardiac action potential by regulating the potassium release from cardiomyocytes. hERG malfunction was found to cause long QT syndrome, a disorder that predisposes affected patients to arrhythmias and sudden death. This can be due to congenital mutation in the hERG gene and, most frequently, it is caused by pharmacological agents. Several drugs are known to block the channel ion pathway, resulting in off-target inhibition of hERG. Consequently, understanding the molecular basis of drug binding to hERG has become a high priority. The recent determination of a near-atomic resolution structure of the opened channel, using cryo-electron microscopy, provides insights into how this channel work. But several questions are still unanswered to understand the mechanisms of hERG function and drug binding. Moreover, new biophysical protocols with the purified hERG channel would help scientists and industries to anticipate drug side effects. In this context, we investigated strategies to purify a stable, homogenous and functional hERG channel. Our study was based on a shorter and chimeric hERG channel, the hERG(S1-coil) version. We optimized each step from production to purification of membrane proteins by testing experimental protocols found in the literature. In this thesis project, we first compared production rates of the channel in several prokaryote and eukaryotes recombinant systems. Total protein produced and the percent of functional channel were investigated in membranes from each recombinant system. Then, the channel was extracted from membranes before purification. Solubilizing rates and channel stability were compared depending on detergents. In another hand, we also developed protocols to investigate the channel stability and function along production and purification. A tetrameric and functional channel was finally purified and identified by this strategy. More work however is still needed to improve channel homogeneity and stability before to be suitable for biophysical and structural studies. In the future, this work could also help investigations in production and purification of other oligomeric membrane proteins.

Les canaux potassiques à deux domaines P (K2P) contrôlent l’excitabilité cellulaire et jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos membranaire dans la majorité des cellules animales. Depuis leur identification dans les années 90, ces canaux ont été impliqués dans de nombreuses fonctions comme la modulation de l’activité neuronale, l’activité du muscle cardiaque ou encore la physiologie rénale. Malgré l’importance de ces canaux, peu de données existent sur les processus cellulaires qui contrôlent leur fonction in vivo. Au cours de ma thèse, j’ai utilisé des approches génétiques, d’imagerie et d’électrophysiologie pour comprendre comment l’expression, la distribution et l’activité du canal K2P UNC-58 sont contrôlés chez le nématode modèle C. elegans.Pour cela, j’ai effectué un crible suppresseur du phénotype locomoteur du mutant gain de fonction unc-58(e665). J’ai ainsi obtenu 133 mutants présentant une large gamme de niveaux de suppression, suggérant l’implication de plusieurs gènes dans les processus de régulation du canal. En utilisant les technologies de reséquençage complet de génome, j’ai pu cloner six nouveaux gènes requis pour la fonction d’unc 58.J’ai ensuite caractérisé en détail le rôle d’unc-44/ankyrine dans le contrôle du trafic d’unc 58. Ce travail a conduit à 4 conclusions majeures : (1) UNC-58, malgré sa structure de canal potassique, possède en réalité une sélectivité ionique altérée favorisant le passage des ions sodium, (2) l’addition à UNC 58 de protéine fluorescente par approche CRISPR/Cas9 nous a permis pour la première fois d’observer directement la distribution du canal UNC-58 in vivo, (3) l’ankyrine est nécessaire à l’adressage du canal UNC-58 à la surface des muscles et dans les axones des neurones mécanosenseurs ALM. Cette fonction fait intervenir une poche d’interaction lipidique localisée au sein du module Zu5N-Zu5C-UPA d’UNC-44, (4) ce mécanisme est hautement sélectif puisqu’il n’est pas requis pour l’adressage de 6 autres canaux potassiques musculaires. Mon crible a également identifié une interaction génétique entre unc-70/ß-spectrine et unc-44/ankyrine. Toutefois, la nature moléculaire de cette interaction reste encore à préciser / Two-pore potassium channels (K2P) control cell excitability and play a central role in the establishment and the maintenance of the resting membrane potential of almost all animal cells. Since their identification in the late 90s, these channels have been implicated in a large number of functions ranging from neuronal and cardiac activity to kidney physiology. Despite the crucial functions of these channels, comparatively little is known about the cellular processes controlling their function in vivo. During my PhD, I used a wide range of strategies including genetics, microscopy and electrophysiology to understand how the expression, the distribution and the activity of the K2P channel UNC-58 are controlled in the model nematode C. elegans. I have first performed a genetic suppressor screen targeting the locomotion phenotype of the gain of function mutant unc-58(e665). The screen yielded 133 mutants, displaying a wide range of suppression level, suggesting that several genes may be implicated in the channel regulation process. By using whole genome sequencing technologies, I’ve been able to clone six new genes required for the function of UNC-58.Then, I’ve characterized in detail the role of unc-44/ankyrin in the trafficking of UNC 58. This project led to 4 main conclusions : (1) UNC-58, despite its potassium channel structure, has an altered ionic selectivity, allowing preferably sodium ions to pass through the channel (2) the addition of a fluorescent protein to UNC-58 by CRISPR/Cas9 approaches allowed us for the first time to directly observe the addressing of the UNC-58 channel to the muscle surface and axons of ALM mechanosensory neurons. This function involves a lipid binding pocket located within the Zu5N-Zu5C-UPA module of UNC-44, (4) this mechanism is highly selective since it is not required for the addressing of 6 other muscular channels.My screen also identified a genetic interaction between unc-70/ß-spectrin and unc-44/ankyrin. However, the exact molecular nature of this interaction remains to be elucidated

STARD3 est une protéine endosomale de la famille START (Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) Related lipid Transfer), qui lie le cholestérol. STARD3 module l’organisation de la cellule en formant des sites de contact membranaire entre les endosomes et le réticulum endoplasmique (RE). Le lien entre les sites de contact membranaire et le transport du cholestérol n’était pas compris. Dans ce travail, nous montrons que STARD3 en interagissant avec les protéines VAPs (VAMP–Associated Proteins) bâtit une machine moléculaire autonome qui transporte le cholestérol au niveau des contacts RE–endosomes. Ce transport permet la formation de membranes internes dans les endosomes et est potentiellement impliqué dans le fonctionnement de ces organites. De plus, nous avons étudié la fonction de STARD3 dans la maladie Niemann Pick type C, qui est caractérisée par une anomalie du transport de cholestérol dans les endosomes. / STARD3 is an endosomal sterol-binding protein which belongs to the START protein family. Remarkably, STARD3 modulates the cellular organization by creating membrane contact sites between the endoplasmic reticulum (ER) and endosomes. The link between ER-endosome contact sites and cholesterol transport was not understood. In this work, we showed that STARD3 and its ER–resident partner, VAMP–associated protein (VAP), assemble into a machine that allows a highly efficient transport of cholesterol within ER–endosome contacts. This cholesterol transport provides building blocks for endosome inner membranes formation, and is probably involved in endosome dynamics. Furthermore, we studied STARD3 function in Niemann Pick type C disease, a condition characterized by an impairment of endosomal cholesterol export.

La microfiltration est largement utilisée pour la clarification, la stabilisation et la concentration de nombreuses suspensions à base de fruits (jus de fruits, agro-déchets, vin, etc.). Malgré ses divers avantages, la microfiltration présente néanmoins un inconvénient majeur qui est le phénomène de colmatage qui s’installe pendant l’opération de filtration et entraîne une diminution de la perméabilité membranaire. Si de nombreux mécanismes de colmatage (adsorption, blocage de pores, etc.) sont observés pendant la filtration de suspensions polydisperses comme les jus de fruits ou certains coproduits liquides, le dépôt de particules sur la membrane est souvent supposé être le mécanisme limitant. La formation de ce dépôt est fortement dépendante de l’équilibre entre forces convectives (imposées par le flux de perméat), qui attirent les particules de la suspension à proximité de la membrane, et forces de rétrotransport, qui éloignent les particules de la surface membranaire. La stratégie la plus employée pour maitriser le colmatage membranaire par dépôt est la filtration tangentielle qui permet d’imposer de forts cisaillements à la surface membranaire qui favorisent les mécanismes de rétrotransport des particules. Si cette stratégie de maîtrise du colmatage est amplement utilisée à l’échelle industrielle pour la microfiltration des suspensions à base de fruits, elle nécessite des coûts d’investissement et de fonctionnement non négligeables qui limitent son implantation aux industries présentant de fortes capacités de production et d’investissement. Au regard de cela, l’utilisation d’une configuration de filtration à membranes immergées pour la microfiltration de suspensions à base de fruits pourrait être une alternative intéressante. Cette configuration repose sur l’immersion de la membrane (modules plans ou fibres creuses) dans la suspension à filtrer, et est associée à un mode de filtration externe-interne, frontal ou quasi-frontale. Si l’absence de conditions hydrodynamiques intenses au voisinage de la membrane est associée à des flux relativement bas, les nombreux avantages de ce mode opératoire (coûts de fonctionnement réduits, simplicité opérationnelle, forte compacité, etc.) pourraient favoriser son emploi par les petits producteurs de jus de fruits et/ou les industries de valorisation des coproduits présentant des capacités limitées d’investissement et enclins à minimiser leurs couts opérationnels. Ce travail a ainsi étudié pour la première fois la possibilité d’utiliser un tel système pour la microfiltration de suspensions à base de fruits variées (jus de fruits et coproduits vinicoles). Ce travail de thèse a ciblé ainsi plusieurs objectifs : (i) caractériser le potentiel et le comportement colmatant de suspensions à base de fruits, en lien avec les caractéristiques physicochimiques propres à chaque suspension et au regard de leur filtration par membranes immergées, (ii) étudier des performances d’un système de microfiltration de suspensions à base de fruits par membranes immergées, performances en termes de productivité et de sélectivité et enfin (iii) dégager des pistes de réflexion qui conduiraient à une choix pertinent de conditions de filtration (mode immergé ou tangentiel) pour un type de suspension ciblé. Ce travail fournit ainsi des résultats d’identification de paramètres physico-chimiques clefs qui pourraient constituer un premier guide pour le choix de la configuration membranaire la plus adaptée au produit, permettant d’assurer une productivité acceptable lors de la microfiltration de suspensions à base de fruits. / Microfiltration is widely used to ensure clarification, stabilization, and concentration of various fruit-based suspensions (e.g. fruit juices, food by-products, wine). However, the performances of membrane filtration remain highly challenged by membrane fouling. During microfiltration of polydisperse suspensions, such as fruit-based suspensions, membrane fouling is generally associated to the deposition of particles on the membrane layer. This type of fouling is mainly governed by the equilibrium between convective forces (permeate flow), leading particles to flow towards the membrane, and back-transport forces, removing particles away from the membrane surface. The filtration performances depend strongly on this equilibrium, which is mostly governed by the hydrodynamic conditions of the filtration process and the particles size distribution of the suspension. In food industries, cross-flow microfiltration is generally used to limit membrane fouling. In this configuration, high cross-flow velocities are applied in order to enhance the back-transport forces limiting the deposition of foulant materials on the membrane surface. However, this working mode is well known to be highly energy consuming and might not always be relevant depending on the suspension characteristics. In the light of this, using immersed membranes configuration for the microfiltration of fruit-based suspensions might be an interesting alternative, especially for small producers with limiting investment capacity. In this configuration, widely used in other fields, the membranes are immersed in the suspension and filtration is performed in operating conditions close to that of dead-end filtration with limited back-transport forces and low operating costs. However, the performances of this filtration configuration remain little studied for the microfiltration of fruit-based suspensions. In this respect, this work investigated for the first time the possibility of using immersed membranes configuration for the microfiltration of various fruit-based suspensions (fruit juices and winery byproducts). Firstly, a characterization of the fouling potential of various suspensions during their microfiltration using immersed membranes filtration was performed in relation with their physicochemical properties (particle size distribution). Then, this work allowed highlighting the promising performances of immersed membranes configuration when used for the microfiltration of fruit-based suspensions, in terms of productivity and in terms of selectivity (clarification, concentration of bioactive compounds). Finally, it allowed drawing preliminary results about the relation between the physicochemical characteristics of a suspension and its fouling behavior while using (i) immersed membranes filtration or (ii) conventional cross-flow filtration. These results might be of great interest for the identification of relevant physicochemical parameters to predict the usefulness of using high cross-flow velocity to prevent membrane fouling during the microfiltration of fruit-based suspensions.

Les œstrogènes sont impliqués dans le développement et l'homéostasie de nombreux tissus reproducteurs et extra-reproducteurs et influencent de nombreux processus physiologiques et pathologiques. L'action des œstrogènes est relayée majoritairement par le récepteur des œstrogènes ERα dont l'action nucléaire conduit à la régulation transcriptionnelle de ses gènes cibles alors que son activation membranaire induit différentes voies de signalisations cytoplasmiques. Le but de ce travail de thèse a été d'évaluer in vivo les rôles respectifs des effets nucléaires et membranaires dans différents processus physiologiques (modulation de la fertilité, vasculo-protection, prolifération endométriale) ou pathologiques (angiogenèse tumorale) en réponse au 17β-œstradiol (E2). Différents modèles de souris transgéniques ont été utilisés, notamment les souris C451A-ERα présentant une mutation du site de palmitoylation nécessaire à l'adressage membranaire de ERα. Nous avons ainsi pu mettre en évidence la part respective des effets membranaires et nucléaires de ERα dans différents tissus. / Estrogen Receptor ERα is a nuclear receptor, which regulates many physiological functions through estradiol (E2) binding on two cellular sub-localizations: Nuclear ERa is implicated in the regulation of gene expression while membrane ERα (targeting through Cys451 palmitoylation) activates kinase signaling. The main objective of my PhD thesis was to investigate the respective roles of membrane and nuclear ERα signaling in physiological functions (fertility, vascular protection, uterine proliferation) or pathological functions (tumoral angiogenesis) in response to 17β-estradiol, pharmacological tools (EDC, Estrogen Dendrimer Conjugate) or selective ligand as tamoxifen or Estetrol (E4). Two complementary mouse models were used to delineate their respective functions of membrane and nuclear ERa signaling in vivo: ERα-AF20 mice with specific deletion of the AF2 transactivation function necessary to recruit transcriptional coactivators; C451A-ERα mice with specific mutation of the palmitoylation site of ERα necessary for membrane targeting. Furthermore, the specific role of ERα methylation, occurring on Arg264 and essential for ERα/Src/PI3K complex formation, has been evaluated in vivo using mice R264A-ERα. This work demonstrates for the first time the respective role of membrane and nuclear ERα signaling in vivo. We have highlighted some tissue-specific roles of nuclear and membrane signaling in uterus and vascular protection respectively, but also in fertility. These findings contribute to a better understanding of the molecular ERα signaling in vivo which is of major importance for the design of new SERMs (Selective ER Modulators).

La TSPO préalablement connue sous le nom de récepteur périphérique aux benzodiazépines (PBR), est une protéine membranaire principalement impliquée dans le transport du cholestérol du cytosol vers la matrice des mitochondries, étape limitante dans la synthèse des stéroïdes et des sels biliaires.La production de la forme murine de la TSPO recombinante a été réalisée par un plasmide exprimé dans la bactérie Escherichia coli. La purification a été obtenue par colonne d'affinité grâce à l'étiquette polyhistidine codée dans le gène recombinant. Différents environnements mimétiques membranaires, détergents, lysodérivés, lipides ont été testés d'un point de vue structural et fonctionnel. Parmi les détergents étudiés, la dodécyl phosphocholine (DPC) a permis le meilleur repliement de la protéine. L'ajout de lysodérivés (LMPE) ou de phospholipides (DMPC/DMPE) a permis d'accroître la stabilité. La liaison des ligands spécifiques de la TSPO (PK 11195, cholestérol, protoporphyrine IX) a été observée dans plusieurs conditions étudiées par différentes approches biophysiques et biochimiques. Les trois approches structurales (ME, RX et RMN) ont pu être réalisées après optimisation des conditions de production et de stabilisation. Les résultats obtenus sont discutés en lien avec la structure de la TSPO publiée ces derniers mois. En parallèle à l'étude structurale, des mesures fonctionnelles par mutagenèse dirigée ont été réalisées afin d'obtenir des informations sur la liaison du ligand PK 11195. Ces données ont été confrontées à la structure récemment déterminée permettant de proposer un rôle pour les résidus mutés. Le mécanisme de transport du cholestérol par la TSPO est discuté. / TSPO previously named peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR) is a membrane protein mostly involved in cholesterol transport from the cytosol to the matrix of mitochondria, a limiting step in steroids and bile salts biosynthesis.Production of recombinant mouse TSPO has been performed by plasmid expression in Escherichia coli bacteria. Purification has been obtained by immobilized affinity chromatography (IMAC) using polyhistidine tag encoded by recombinant gene. Various membranous mimetic environments such as detergents, lysoderivates, lipids have been tested from structural and functional point of view. Among tested detergents, dodecyl phosphocholine (DPC) has permitted the best protein refolding. The presence of lysoderivate (LMPE) or phospholipids (DMPC/DMPE) increased protein stability. Binding of TSPO high affinity ligands (PK 11195, cholesterol, protoporphyrin IX) has been measured in different conditions studied by biochemical and biophysical techniques. Three structural approaches (EM, XR and NMR) have been performed after optimization of production conditions and protein stabilization. Results gained have been discussed in line with TSPO atomic structure published within these last months. In parallel with structural studies, functional measurements have been carried out by site directed mutagenesis in order to gain data on binding site of PK 11195. These data have been faced with recently published TSPO atomic structure stabilized with this ligand and enabled to propose functional implication of mutated amino acids. Transport mechanism of cholesterol by TSPO is discussed.

Le travail présenté porte sur le couplage d’un procédé membranaire à extraction liquide-liquide avec un bioréacteur impliquant des molécules hydrophobes. La bioconversion modèle utilisée est la production de cis-2-methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienal (isonovalal) à partir d’α-pinène oxyde, instable en phase aqueuse, par des cellules entières perméabilisées de Pseudomonas rhodesiae (CIP 107491). La production d’isonovalal en milieu biphasique eau (tampon phosphate)/hexadécane présente des verrous technologiques importants, dont une inactivation de l'enzyme à l'interface eau-solvant organique ainsi que l'apparition d'une émulsion stable. L’intérêt de la membrane porte sur l'absence de formation d'émulsion et sur l’augmentation de la durée de vie du biocatalyseur en raison de l'absence de contact direct du biocatalyseur avec l'interface liquide-liquide. La nature de la membrane a été choisie à partir de l'analyse des propriétés physico-chimiques du matériau et de l’étude des affinités entre membrane et composés d’intérêt (solutés, solvants). Il a été montré que les conditions d'écoulement au voisinage de la membrane, notamment du côté aqueux, jouent un rôle prépondérant sur les vitesses de transfert. Ce résultat souligne l'importance du design et des conditions d'opération du module membranaire sur les capacités de transfert. Le couplage de l’extraction membranaire liquide-liquide et de la réaction biologique a conduit à la mise en place d’un système bi-membranaire. Le prototype développé a permis de doubler les capacités catalytiques (+ 100 % d’isonovalal par gramme de biomasse) ainsi que de la durée de vie du biocatalyseur (160 h contre 80 h) par rapport à la même bioconversion réalisée en système biphasique conventionnel. / The study deals with the combination of a membrane process based on liquid/liquid extraction with a bioreactor producing hydrophobic molecules. The bioconversion used is the production of cis-2-methyl-5-isopropylhexa-2,5-dienal (isonovalal) from α-pinene oxide (unstable in aqueous phase) by whole cells of Pseudomonas rhodesiae (CIP 107491). The production of isonovalal in two-phase medium water/organic is known about but presents important technological brakes. Membrane interest concerns the stabilization of liquid/liquid interface and capacity to increase the biocatalyst life-time. Membrane nature is chosen from the analysis of physical and chemical properties of membrane material and study of the affinities between membrane and interest compounds (solutes, solvents). Two membrane contactors are designed and implemented on laboratory scale to study transfers between liquid phases. It is shown that the hydrodynamic conditions in the membrane neighborhood, in particular on aqueous side, play a major role on transfer speeds. This result underlines the importance of design and operation conditions in membrane module about the transfer capacities. The combination of liquid/liquid membrane extraction and biological reaction with unstable substrate had been studied and lead to the implementation of a serial bi-membrane system. The developed prototype, equipped with a PTFE membrane (polytetrafluoroethylene) with 0.22 μm pores’ diameter, highlights a doubling of catalytic capacities (+ 100 % of isonovalal per gram of biomass) as well as biocatalyst life-time (160 hours against 80 hours) compared with the same bioconversion realized in conventional two-phase medium system.

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de muscle squelettique rapide (SERCA1a) est une protéine membranaire qui permet le transport actif de deux ions calcium depuis le cytosol jusque dans la lumière du réticulum. Depuis 2000, l'obtention de nombreuses structures à résolution atomique de cette enzyme a été un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique (Toyoshima, Nakasako et al. 2000). Toutefois, avant 2007, les formes de cette enzyme cristallisées en absence de calcium avaient été obtenues en présence d'un inhibiteur fixé au domaine membranaire. Nous avons d'abord montré, notamment par des techniques de spectroscopie de fluorescence et de protéolyse ménagée, que l'interaction de la protéine avec ces inhibiteurs, qui rend l'ATPase incapable d'adopter certaines des conformations présentes au cours de son cycle catalytique, avait certainement induit des biais significatifs dans la structure de certaines des formes cristallisées avant 2007 (Montigny, Picard et al. 2007). Nos résultats ont stimulé la recherche de structures nouvelles, en absence ou en présence d'inhibiteurs, dont l'analyse a pleinement confirmé nos conclusions. L'utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la protéine solubilisée était jusque là jugée utile pour protéger celle-ci de son éventuelle inactivation irréversible en présence de détergent (Lund, Orlowski et al. 1989). Utilisant le glycérol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en évidence des conséquences inattendues de l'interaction de l'ATPase avec deux des détergents communément utilisés pour sa cristallisation, son isolement ou sa simple étude (Montigny, Arnou et al. 2008). En présence de glycérol, nous avons également pu étudier certains traits de fonctionnement de trois mutants de l'ATPase, purifiés après expression hétérologue dans la levure S. cerevisiae : un mutant d'un des sites de fixation du calcium (i.e. capable de fixer un seul des deux calciums) (Montigny, Arnou et al. 2008) et deux autres mutants bloquant l'enzyme dans des états particuliers du cycle catalytique (Marchand, Winther et al. 2008). Parallèlement à ces études, nous avons élucidé le mystère des propriétés de fluorescence anormales d'une forme particulière de l'enzyme SERCA1a marquée au FITC dans son site nucléotidique. Nous avons mis en évidence une phosphorylation imprévue du FITC lié, conduisant à une très faible fluorescence, particulièrement stable dans le temps. Les conditions de cette phosphorylation impliquent une réorganisation de l'orientation relative des domaines cytosoliques de l'ATPase lors de l'étape de relargage des ions calcium vers la lumière du réticulum (McIntosh, Montigny et al. 2008). Dans toutes nos études, il nous a fallu évidemment tenir compte de la possible chélation des cations divalents interagissant avec l'enzyme (calcium, magnésium, ...) par les anions présents. Par pH métrie et à l'aide de sondes colorées, nous avons vérifié que le magnésium n'était PAS chélaté par le tampon Mops classiquement utilisé, contrairement à ce qui était rapporté dans certaines tables de constantes d'association (Montigny and Champeil 2007). A cette occasion, mettant notre savoir-faire au service de collègues du laboratoire, nous avons également précisé les différents complexes formés par association entre le cadmium (Cd2+) et le glutathion réduit (GSH-) (Leverrier, Montigny et al. 2007), afin de mieux comprendre lesquels de ces complexes étaient le plus susceptibles de se former au cours de la détoxication cellulaire du Cd2+. Abréviations : ATPase, AdénosineTriPhosphatase ; SERCA1a, Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase, isoforme 1a ; FITC, fluorescéine isothiocyanate ; Mops, acide 4-morpholinopropanesulfonique.