Dans cette thèse est présentée une nouvelle stratégie de purification de SERCA1a après son expression hétérologue chez S. cerevisiae.. La protéine est fusionnée à un domaine accepteur de biotine, biotinylé in vivo par la levure. La procédure de purification, basée sur la forte interaction entre avidine et biotine, permet d'obtenir une protéine active pure à 40-50%. Une étape supplémentaire de filtration sur gel en HPLC a permis d'augmenter la pureté d'environ 70%, tout en conservant une très bonne activité spécifique. Les cristaux obtenus de SERCA1a ainsi purifiée diffractent les rayons X à 3,1Å. <br />Cette nouvelle méthode de purification a été appliquée avec succès au mutant SERCA1a-E309Q. De petits cristaux de ce mutant ont pu être isolés. Cette méthode a également permis de purifier SERCA3a, bien que le faible taux d'expression de la protéine de fusion chez S. cerevisiae limite la quantité purifiée. En parallèle, des essais d'immunolocalisation cellulaire de SERCA3a dans différentes lignées cellulaires et dans des coupes de peau ont été réalisés

L'objectif de cette étude portait sur la mise en œuvre de réacteur catalytique membranaire pour une application dans le traitement d'effluents liquides contaminés par des polluants organiques. Des phases catalytiques ont été déposées au sein des structures poreuses par différentes techniques afin de bien maîtriser la localisation des phases actives. L'optimisation des conditions opératoires a ensuite été réalisée. Ces matériaux sont actifs pour l'oxydation de polluants présents dans les effluents liquides et la configuration en mode contacteur a permis d'accroître l'efficacité et la stabilité des phases catalytiques pour ces réactions de dégradation grâce à un meilleur contact entre les réactifs et les sites actifs.

Ce manuscrit décrit la synthèse et l'étude physico-chimique de tensioactifs innovants utilisés comme outils biochimiques pour le maintien et la cristallisation de protéines membranaires en solution aqueuse. Un premier chapitre présente les moyens techniques actuels à disposition pour la manipulation et l'étude des protéines membranaires ainsi que les problèmes rencontrés concernant leur inactivation et les alternatives actuelles. Une seconde partie décrit la synthèse d'un lipide hémifluoré possédant un ligand métallique spécifique, qui a été utilisé pour la formation d'un film de Langmuir. Les propriétés du film lipidique (stabilité et fluidité) ont été étudiées et des essais de cristallisation 2D suivant le concept interfacial ont été réalisés sur une protéine recombinante SUR1 « his tag » solubilisée dans des micelles de détergents hydrocarbonés. Le troisième chapitre aborde la notion d'amphiphilie faciale et décrit la synthèse de tensioactifs glucosidiques par « click chemistry » basés sur corps aromatique central. La persubsitution sélective de têtes hydrophiles sur les positions 1,3,5 et de parties hydrophobes sur les positions 2,4,6 apporte une amphiphilie aux molécules via une ségrégation faciale. Enfin, le dernier chapitre est dédié à l'étude du comportement et des propriétés physico-chimiques des tripodes amphiphiles faciaux en solution aqueuse grâce à différentes techniques : tensiométrie, diffusion de la lumière, CPLH,...

Les membranes cellulaires sont constamment remodelées par le bourgeonnement et la fusion de vésicules assurant le transport entre les différentes organelles. De nombreuses protéines périmembranaires orchestrent ce trafic vésiculaire. Les hélices amphipathiques jouent un rôle important dans le mécanisme d'interaction de certaines de ces protéines avec les membranes. A la différence de domaines protéiques reconnaissant spécifiquement un lipide, les hélices amphipathiques reconnaissent plus globalement la physicochimie d'une membrane (forme, charge...). GMAP-210 est une très longue protéine golgienne qui agit comme corde moléculaire grâce à sa structure en coiled-coil. Le laboratoire avait montré que l'extrémité N-terminale de GMAP-210 possède un motif ALPS, une hélice amphipathique singulière sensible à la courbure membranaire. Les motifs ALPS sont caractérisés par l'absence de résidus basiques, l‘interaction avec les membranes ne repose donc que sur l'hydrophobicité. Pour compenser ce déficit, la liaison des motifs ALPS n'a lieu qu'au contact de membranes fortement courbées. Dans le cas de GMAP-210, le motif ALPS permettrait de capturer des vésicules de transport. J'ai démontré que l'autre extrémité de la corde interagit avec Arf1GTP sur des membranes. Cette interaction est conditionnée par le contact avec la surface membranaire d'une petite hélice amphipathique située en aval du domaine d'interaction avec Arf1. De façon remarquable, l'interaction entre Arf1GTP et le domaine C-terminal de GMAP-210 est régulée indirectement par la courbure membranaire. En effet, ArfGAP1, identifiée comme la première protéine possédant un motif ALPS, est capable de dissocier rapidement le complexe de membranes courbées. Par conséquent, GMAP-210 connecte des membranes courbées, par exemple des vésicules, à des membranes planes recouvertes d'Arf1, par exemple des citernes golgiennes. Le mécanisme vectoriel d'attachement de membranes par GMAP-210 repose donc sur de nombreuses hélices amphipathiques (deux dans GMAP-210, une dans Arf1 et une dans ArfGAP1) et permettrait d'expliquer le confinement des vésicules de transport autour de l'appareil de Golgi. Des mesures de vitesse spontanée de désorption membranaire des extrémités de GMAP-210 suggèrent que l'attachement des membranes est très dynamique et a lieu sur des échelles de temps de la seconde à la minute. Le motif ALPS n'est pas le seul motif amphipathique sensible à la courbure. L'alpha-synucléine, une protéine synaptique célèbre pour son implication dans la maladie de Parkinson, contient également une hélice amphipathique senseur de courbure. Curieusement, la physicochimie du motif ALPS et de l'alpha-synucléine est opposée tant pour la face polaire que pour la face hydrophobe. L'alpha-synucléine a une périodicité atypique (3/11), une face polaire zwittérionique et une face hydrophobe présentant de petits résidus et des thréonines. En utilisant des liposomes de composition et de rayon définis, j'ai montré que la charge négative des membranes est un paramètre discriminant dans la liaison aux membranes des deux protéines. En effet, à la différence de GMAP-210, l'alpha-synucléine est strictement dépendante d'un taux élevé de phospholipides anioniques. Par contre, ces protéines sont toutes les deux très sensibles à la nature des chaînes insaturées des phospholipides. Les premiers résultats montrent néanmoins des subtilités intéressantes : l'alpha-synucléine semble mieux adaptée que GMAP-210 à une membrane polyinsaturée comme l'est celle des vésicules synaptiques. En conclusion, de nombreuses hélices amphipathiques sont impliquées dans le trafic vésiculaire. Elles présentent de nettes différences dans leur physicochimie suggérant une adaptation à des membranes cellulaires (de composition lipidique et de rayon définis) par des mécanismes qui restent largement à explorer.

La cellule eukaryote est organisée en plusieurs compartiments, appelés organelles, délimités par des membranes. La fission des membranes est nécessaire pour le transport intracellulaire entre organelles. L'endocytose est un mécanisme de transport depuis la membrane plasmique vers les autres organelles. La Dynamine est une guanosine triphosphatase (GTPase) impliquée dans la fission des vésicules pendant l'endocytose médiée par la Clathrine. Elle polymérise en hélice au coup des bourgeons endocytiques. Après hydrolyse du GTP, la structure de l'hélice est modifiée : le rayon interne diminue de 10 à 5 nm et le pas hélical de 13 à 9 nm. Ces modifications indiquent un mécanisme de constriction. La dynamique de constriction est étudiée en suivant la rotation de microbilles attachées à des tubes lipidiques recouverts de Dynamine. La déformation des hélices de Dynamine est concertée et amortie par la friction entre membrane et Dynamine. Cependant la constriction ne suffit pas pour la fission. Pour comprendre davantage son mécanisme, la fission par la Dynamine est étudiée à l'aide de tubes lipidiques extraits de vésicules unilamellaires géantes. La fission se produit au bord de l'hélice, où la membrane est fortement courbée. D'après l'analyse statistique des temps de fission, la réaction de fission peut être modélisée par une unique barrière énergétique. La dépendance du temps de fission en rigidité de membrane, en tension de membrane et en couple est établie théoriquement et validée expérimentalement. Ce travail établit le profil énergétique de la réaction de fission membranaire et évalue à 70 kT la barrière énergétique.

La mucoviscidose est une maladie génétique due à des mutations du gène CFTR, conduisant à une altération de la fonction de canal à ions chlorure de la glycoprotéine transmembranaire CFTR associée à une atteinte pulmonaire sévère. Plusieurs études récentes ont amené à reconsidérer l'utilisation des vecteurs adénoviraux (Ad) de sérotype 5 (Ad5) dans la mucoviscidose, lesquels induisent non seulement des réactions immunes anti-adénovirales mais aussi des effets cytopathiques indésirables. (1) Dans une première partie de notre étude, nous avons étudié l'entrée et le transit intracellulaire de l'Ad5/F35, vecteur chimérique portant les fibres de l'Ad sérotype 35 sur une capside de sérotype 5. Nous avons montré que la protéine fibre est déterminante dans l'internalisation et le trafic intracellulaire de ce vecteur. Le vecteur Ad5/F35 exprimant la fusion GFP-CFTR s'est révélé (i) être dépourvu de cytotoxicité, (ii) transduire efficacement les cellules épithéliales pulmonaires par voie apicale, et (iii) restaurer l'activité de canal à chlorure dans les cellules CFTR(-). Il constitue donc un vecteur de transfert du gène CFTR potentiellement utilisable en thérapie génique de la mucoviscidose. (2) Dans une seconde partie, nous avons exploré une stratégie alternative de transfert de la protéine CFTR par trogocytose. Nous avons fait l'hypothèse que le canal CFTR pouvait être véhiculé par des microvésicules ou microparticules membranaires (MP) émanant de la membrane cellulaire et libérées dans le milieu de culture. En utilisant un système d'expression stable de la protéine CFTR étiquetée par la protéine fluorescente GFP (GFP-CFTR) dans des cellules donneuses, nous avons pu démontrer que les MP sont capables de prendre en charge et délivrer la protéine GFP-CFTR à des cellules réceptrices, mais ce transfert n'est assuré que par une population réduite de MP (≤ 8 %), et la durée de vie du GFP-CFTR n'est que transitoire (≤ 24h). En fait, la majorité des MP transfèrent des molécules d'ARN messager ou polysomal GFP-CFTR. La protéine GFP-CFTR néosynthétisée à partir de ces ARNm est exprimée plus tardivement (> 48h) mais de façon prolongée (≥ 10 jours). La fonctionnalité du canal CFTR ainsi néosynthétisé est en cours d'évaluation. Les MP constituent donc un nouveau type de vecteurs de transfert non génique du CFTR qui pourraient être employés en thérapie de la mucoviscidose.

L'intégrité des membranes cellulaires est essentielle à la survie et au bon fonctionnement de la cellule. Or, ces membranes sont constamment endommagées. La première partie de cette étude porte sur la réparation de la membrane plasmique perforée suite à l'exposition à des contraintes physiques, chimiques ou biochimiques. Nous décrivons un nouveau mécanisme de réparation de la membrane plasmique qui met en jeu le complexe III de la machinerie des ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). Nos observations suggèrent que les ESCRTs seraient impliquées dans l'élimination de portions endommagées de membrane plasmique par bourgeonnement. Nos résultats portent une information novatrice dans le domaine des ESCRTs et pourrait aider à comprendre plus en détail le mode de fonctionnement des ESCRTs. La deuxième partie de cette étude porte sur la réponse cellulaire à l'endommagement physique (laser) ou chimique (par pontage chimique) d'organites de trafic. Nous montrons l'implication des mécanismes d'autophagie dans la réponse à l'endommagement des endosomes et de l'appareil de Golgi. Cette réponse comprend un recrutement rapide de la protéine LC3 (une des seules protéines détectables sur les membranes des autophagosomes matures). Nous avons montré également l'implication d'une ubiquitination rapide ainsi que du recrutement des protéines p62 et NBR1 (capables de lier à la fois l'ubiquitine et la protéine LC3). Le mécanisme observé présente de nombreux points communs avec d'autres mécanismes d'autophagie sélective mais révèle néanmoins des particularités comme le recrutement direct de LC3 sur les membranes de l'appareil de Golgi endommagé. Notre étude comprend donc l'étude de deux mécanismes cellulaires de réponse aux endommagements de membrane qui mettent en évidence l'existence de mécanismes de surveillance systématique de l'homéostasie des organelles et de la membrane plasmique. Ces mécanismes sont adaptés à la nature des membranes endommagées

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion des objets d'un système biomimétique modèle (lipides, protéines). L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. La dépendance en taille, les valeurs obtenues et le mode opératoire simple permettent d'espérer la réalisation prochaine d'une véritable séparation électrophorétique pour un mélange de protéines.

L'hypophyse antérieure assure une interface endocrine entre le cerveau et les organes périphériques. En effet, cette glande sécrète de manière pulsatile ses différentes hormones dans la circulation générale sous l'influence de facteurs hypothalamiques déversés épisodiquement dans le système porte de l'éminence médiane. Toutefois, l'influence hypothalamique ne saurait à elle seule expliquer l'harmonisation des sécrétions des cellules d'un même type endocrine, qui sont distribuées de manière hétérogène au sein du parenchyme. Il existe sans doute des mécanismes permettant de coordonner l'activité des cellules endocrines à l'échelle de la glande entière. Au cours de cette thèse, nous avons montré la présence d'un mécanisme de communication intra-hypophysaire permettant un transfert rapide d'information au sein d'un réseau de cellules non-endocrines, les cellules folliculostellaires (FS). Ce travail réalisé sur des tranches épaisses d'hypophyse de rat, modèle qui maintient intacte l'architecture cordonale du tissu, a permis de mettre en évidence l'excitabilité membranaire des cellules FS, propriété jusqu'alors inconnue. Cette excitabilité sert de base à l'initiation de vagues calciques, qui peuvent se propager rapidement via des jonctions gap à des régions éloignées de la glande. Nous avons également étudié la libération d'interleukine-6 (IL-6) par les cellules FS. Cette cytokine est connue pour stimuler l'ensemble des sécrétions hormonales hypophysaires. La production d'IL-6 est stimulée par le PACAP. Ce neuropeptide semble agir directement au niveau du gène, et son effet dépend de l'état des communications intercellulaires au sein du réseau. Les cellules FS pouvant répondre à des stimuli d'origine centrale et périphérique, ainsi que dialoguer avec les cellules endocrines, l'ensemble de ces résultats montre que le réseau de cellules FS pourrait fournir un mécanisme efficace qui coordonnerait le fonctionnement de la glande en fonction des différents états physiologiques

La contribution des cellules souches au développement tumoral est une percée conceptuelle récente dans notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la carcinogenèse. En ce sens, il est reconnu depuis quelques années qu'une sous-population de cellules souches mésenchymateuses (MSC) mobilisables en réponse à des facteurs de croissance tumoraux pourrait contribuer au développement tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis d'étudier certains partenaires clé dans la régulation de la migration et de la survie cellulaire des MSC. L'observation préalable d'une modulation conjointe de l'expression d'une métalloprotéase matricielle de type membranaire (MT1-MMP) et du transporteur microsomal de glucose-6-phosphate (G6PT) nous a permis d'évaluer la contribution respective de ces joueurs dans la signalisation affectant la chimiotaxie des cellules souches ainsi que des cellules tumorales cérébrales. De plus, nous avons évalué l'impact de certains « mannosides » synthétisés en vue de cibler spécifiquement les fonctions de surfaces de MT1-MMP et qui pourraient être à l'origine de nouvelles approches thérapeutiques anticancéreuses affectant le recrutement des cellules souches au foyer tumoral. Finalement, l'importance de l'axe de signalisation MT1-MMP/G6PT dans la mobilisation du calcium intracellulaire en réponse à la sphingosine-1-phosphate, un lipide bioactif synthétisé par des niveaux d'expression élevés de sphingosine-kinase retrouvé au niveau tumoral, permet également de concevoir le ciblage effectif de l'un ou l'autre de ces partenaires dans la progression tumorale. L'ensemble de nos résultats permettra de mieux comprendre les phénomènes régulant la survie et le recrutement des MSC aux sites de foyers tumoraux, en plus de fournir de précieux renseignements sur un nouvel axe original de signalisation liant les fonctions de MT1-MMP à celles, inattendues, de G6PT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellules souches, Cancer, MT1-MMP, G6PT, Sphingosine-1-phosphate.