Durant la progression tumorale cérébrale, les cellules envahissent le tissu environnant, afin de s'y infiltrer. Pour ce faire, elles sécrètent ou expriment à leur surface des métalloprotéases matriciel1es (MMPs), capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces MMPs, la MMP membranaire de type 1 (MT1-MMP) joue un rôle crucial dans l'acquisition du potentiel invasif des cellules tumorales cérébrales. La MT1-MMP dégrade de nombreux composants de la matrice extracellulaire et des protéines de surface. Grâce à son activité protéolytique, la MT1-MMP joue ainsi un rôle important dans les différentes étapes de la progression tumorale cérébrale incluant l'angiogenèse. Le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP serait donc une approche thérapeutique efficace dans le traitement de gliomes. Bien que l'activité protéolytique de la MT1-MMP demeure sa fonction la plus importante, plusieurs études tendent à démontrer que la portion cytoplasmique de l'enzyme contribue à l'induction de signaux intracellulaires possiblement impliqués dans la chimio et la radiorésistance à la thérapie des gliomes. Parmi les marqueurs associés à cette résistance et surexprimés dans les gliomes hautement malins, il y a la cyclooxygénase-2 (Cox-2). Toutefois, le mécanisme moléculaire reliant l'activité intracellulaire de MT1-MMP à l'expression de Cox-2 demeure incompris. La première partie de mon mémoire a pour objectif d'étudier le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP par l'actinonine, un inhibiteur sélectif de l'aminopeptidase N/CD13 et des MMPs solubles, dans les cellules de glioblastome U87. Nous y montrons que l'actinonine inhibe l'activation de la proMMP-2 induite par la concanavaline-A (ConA), une condition expérimentale connue pour induire l'expression de MT1-MMP dans les cel1ules U87. De plus, grâce à l'analyse de l'expression génique de MT1-MMP, l'actinonine n'a pas modulé l'expression de MT1-MMP induite par la ConA, suggérant que les effets de l'actinonine sont post-transcriptionnels. Nos résultats positionnent l'actinonine comme un possible candidat thérapeutique ciblant MT1-MMP. La deuxième partie de mon mémoire s'est orientée sur l'axe MT1-MMP/Cox-2 dans les glioblastomes U87. Nos observations préalables d'une modulation conjointe de l'expression de MT1-MMP et de Cox-2 dans les cellules isolées de glioblastomes humains U87 induite par la ConA nous ont permis d'évaluer le rôle de la ConA dans le déclenchement des processus cellulaires pro-inflammatoires qui régulent l'expression de Cox-2. Nous avons trouvé que le traitement avec la ConA, ou la surexpression directe de MT1-MMP recombinante conduit à l'induction de Cox-2 via une voie de signalisation impliquant NF-kB/IKKy. Collectivement, les résultats présentés dans ce mémoire apportent de nouvelles informations quant à l'implication du domaine intracellulaire de la MT1-MMP dans le phénotype pro-inflammatoire des cellules cancéreuses cérébrales. Ceci inspirera la conception de nouvel1es stratégies de thérapie pouvant combiner l'action des inhibiteurs de MT1-MMP à celle des drogues anti-inflammatoires pour le traitement de gliomes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, Concanavaline-A, Actinonine, Cox-2, Inflammation, Glioblastome

L'implication de la Membrane Type-Matrix Metalloproteinase (MT1-MMP) dans la progression du cancer a été grandement étudiée dans la dernière décennie. Elle possède une vaste variété de substrats, incluant des composants de la matrice extracellulaire, des cytokines et des récepteurs membranaires. Nos résultats identifient le marqueur de cellules souches (CSC) CD133 comme une nouvelle cible de l'activité protéolytique de la MT1-MMP. Des essais d'immunoprécipitation et de clivage in vitro effectués à l'aide de protéines recombinantes ont démontré que la MT1-MMP interagit physiquement avec CD133 et clive son domaine N-terminal à la position 30KAWN↓Y34. De plus, cette interaction semble commencer au niveau intracellulaire, dans le réticulum endoplasmique, avant l'activation de la proMT1-MMP et avant la maturation complète de CD133; toutefois, seulement la forme mature de CD133 peut être clivée. Ces résultats représentent la première interaction protéine-protéine connue de CD133, dont la fonction cellulaire demeure incomprise. Des expériences supplémentaires pourraient mener à une meilleure compréhension de cette protéine et de son rôle dans la biologie des CSCs. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, CSC, N-terminal, réticulum endoplasmique

Le système Tat (pour Twin Arginine Translocation) exporte des protéines repliées depuis le cytoplasme vers le périplasme des bactéries. L'adressage des protéines à exporter au système Tat repose sur une séquence signal spécifique amino terminale clivée après exportation. Chez le phytopathogène Dickeya dadantii, l'homologue de pectine lyase PnlH possède une séquence signal Tat qui assure son adressage au système Tat mais qui n'est pas clivée après exportation et ancre la protéine dans la membrane externe. Chez les protéobactéries, la majorité des protéines de membrane externe sont soit des lipoprotéines soit des protéines intégrales de membrane en tonneau β. L'adressage de ces protéines à la membrane externe repose sur des voies spécifiques du type de protéine : la voie Lol pour les lipoprotéines et la combinaison des chaperons périplasmiques SurA, Skp et DegP et du complexe de membrane externe Bam (β barrel assembly machinery) pour les protéines en tonneau β. Au cours de ce travail, l'étude de l'adressage de PnlH à la membrane externe a montré que SurA se liait à la séquence signal hydrophobe de PnlH pour la protéger de l'environnement hydrophile au cours de son transit dans le périplasme. La séquence signal de PnlH (41 acides aminés) porte l'intégralité de l'information nécessaire à son adressage à la membrane externe. La nature de l'information adressant les protéines au système Tat est bien connue et dans ce travail nous nous sommes efforcés d'identifier les informations requises pour les deux dernières étapes de l'adressage de PnlH à la membrane externe : la traversée du périplasme et l'insertion dans la membrane externe. La délétion d'une région conservée comprise entre les résidus 28 et 41 de la séquence signal de PnlH affecte l'adressage de cette dernière à la membrane externe. Des substitutions des acides aminés conservés de cette région ne semblent pas affecter l'adressage de PnlH, indiquant que l'information nécessaire à l'adressage de PnlH à la membrane externe après exportation ne réside pas dans la séquence en acides aminés de la séquence signal de PnlH. En revanche, nos données suggèrent que la présence d'une hélice α hydrophobe dans la séquence signal de PnlH est importante pour son adressage à la membrane externe. Cette observation est particulièrement intéressante puisqu'une telle structure est généralement considérée comme une caractéristique des protéines de membrane interne.

Les cellules des muscles striés squelettiques sont constituées d'éléments contractiles enveloppés par un réseau membranaire. La formation et l'entretien du muscle strié squelettique impliquent la migration des précurseurs myogéniques, la fusion des myoblastes en myotubes et la mise en place des triades. Ces évènements reposent sur le remodelage des membranes et du cytosquelette d'actine des cellules musculaires. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la protéine adaptatrice CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) dans certaines étapes du développement du muscle strié squelettique. Après avoir identifié le complexe de nucléation de l'actine Arp (actin-related protein) 2/3 comme un nouvel interacteur de CKIP-1, nous avons montré que l'inhibition de l'expression de ckip-1 chez l'embryon de poisson zèbre altère la morphologie des myoblastes et empêche leur fusion du fait d'une désorganisation du cytosquelette d'actine. J'ai également montré que CKIP-1 n'est présente qu'au cours des étapes précoces de la myogenèse in vitro et in vivo chez la souris, puis elle est progressivement clivée. En outre, la modulation de l'expression de CKIP-1 provoque des défauts membranaires aussi bien in vitro qu'in vivo dans le muscle adulte de souris, suggérant que CKIP-1 est impliquée dans le remodelage des membranes. CKIP-1, par ses capacités à remodeler le cytosquelette d'actine et les membranes, pourrait intervenir dans plusieurs étapes de la vie du muscle : la migration, la fusion des myoblastes et la mise en place ou le maintien du réseau membranaire interne des cellules du muscle strié squelettique.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d'éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l'analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n'est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d'éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L'étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l'expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l'enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d'expliquer la faible efficacité de l'enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l'enzyme. Une technique de mesure d'activité in vitro a été également développée. Une stratégie d'expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d'une protéine d'environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l'extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d'affinité sur colonne d'agarose nickel. Les tests d'activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l'enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l'enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l'acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l'action partielle de la Cfa synthase de O. oeni.

Les cellules Natural Killer (NK) sont des lymphocytes du système immunitaire inné capables de tuer des cellules cibles et de produire des cytokines telles que l'interféron-γ. Au cours de mon travail de thèse, j'ai utilisé des approches de génétique directe et inverse dans le but d'étudier les mécanismes impliqués dans la régulation des capacités effectrices des cellules NK. La tolérance des cellules NK au soi est en partie assurée par les récepteurs inhibiteurs de surface qui sont spécifiques des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I) exprimées par les cellules du soi. Cependant, des cellules NK qui ne sont pas capables de détecter l'expression du CMH-I ne sont pas autoréactives. Dans la première partie de ce travail de thèse, nous avons cherché à déterminer, chez la souris, les mécanismes de la tolérance NK, indépendante de la reconnaissance du CMH-I, qui est associée à une hyporeactivité des cellules NK. En utilisant des techniques de spectrométrie de fluorescence par corrélation à spot variable (svFCS), nous avons montré que dans les cellules NK hyporéactives les récepteurs activateurs et inhibiteurs sont confinés à la membrane plasmique par des réseaux structurés d'actine. A l'inverse, la reconnaissance par les cellules NK du CMH-I, qui « éduque » les cellules NK pour qu'elles acquièrent leurs capacités effectrices maximales, est associée une relocalisation des récepteurs activateurs au sein de nanodomaines. Ces résultats suggèrent que ce serait le confinement particulier des récepteurs activateurs à la membrane des cellules NK qui assure la tolérance au soi. / Natural killer (NK) cells are bone marrow-derived innate immune lymphocytes able to kill cellular targets and secrete cytokines such as interferon-γ. During my PhD work, I used reverse and forward genetic approaches to dissect the mechanisms involved in the regulation of NK cell effector capabilities at steady state. NK cell tolerance to self is partly ensured by major histocompatibility complex class I (MHC- I)-specific inhibitory receptors on NK cells, which detect MHC-I expression on self-cells and prevent NK cell activation. However, NK cells that do not detect self MHC-I are not autoreactive. In the first part of this PhD work, we sought to determine the mechanism at the basis of this MHC-I independent NK cell tolerance. Using spot variation fluorescence correlation spectroscopy (svFCS), we showed that MHC-I-independent NK cell tolerance in mice was associated with the presence of hyporesponsive NK cells in which both activating and inhibitory receptors were confined in an actin meshwork at the plasma membrane. In contrast, the recognition of self MHC-I by inhibitory receptors "educated" NK cells to become fully reactive, and activating NK cell receptors became dynamically compartmentalized in membrane nanodomains. We thus propose that the confinement of activating receptors at the plasma membrane is essential to ensuring self-tolerance of NK cells.

Le présent travail de thèse met l'accent sur divers aspects de la distillation membranaire dans l'objectif de concevoir des procédés de dessalement proches du " zéro effluent liquide ". De manière générale, deux sujets sont discutés en détail: (i) la corrélation entre les caractéristiques de la membrane et les performances du procédé de distillation membranaire (ii) la compréhension et le contrôle de la polarisation thermique en DM. L'analyse de l'état de l'art en distillation membranaire porte notamment sur les progrès dans le développement des membranes, dans la compréhension des phénomènes de transport, les récents développements dans la conception des modules et le colmatage. Des phénomènes annexes et les applications innovantes sont également discutés dans la partie introductive de la thèse. L'effet des conditions de fabrication et de la composition des collodions sur les caractéristiques des membranes et la corrélation entre ces dernières et leurs performances a été discuté dans la section suivante. Il est établi que la morphologie de la membrane joue un rôle crucial dans ses performances pour des applications sur des fluides réels. En outre, on met en évidence que l'impact de la morphologie de la membrane est différente selon que la procédé fonctionne avec une phase liquide froide du côté distillat (Direct Contact Membrane Distillation - DCMD)) ou avec un courant d'air sec ou le vide (Air Gap ou Vacuum Membrane Distillation). Dans une deuxième partie, les aspects théoriques et expérimentaux de la polarisation thermique en distillation membranaire (DCMD) ont également été étudiés. Les phénomènes de polarisation thermique sur une membrane plane ont été étudiés en utilisant une cellule spécialement conçue. L'effet des conditions de fonctionnement et de la concentration de la solution sur la polarisation thermique a été étudié expérimentalement. Nous avons observé que l'augmentation de concentration de la solution favorise la polarisation thermique à cause d'une détérioration de l'hydrodynamique résultante à la surface de la membrane. Certaines techniques actives et passives pour réduire la polarisation thermique et le colmatage en distillation membranaire ont également été examinées dans l'étude cette étude. Nous avons montré que la polarisation thermique peut être considérablement réduite en générant des écoulements secondaires dans le fluide circulant à l'intérieur du canal d'alimentation, donc à l'intérieur de la fibre creuse si c'est cette configuration qui est retenue. Dans la présente étude, l'induction d'un écoulement secondaire a été réalisée en utilisant les fibres torsadées en hélice et une configuration ondulée. En raison de l'amélioration du niveau de polarisation thermique du côté de l'alimentation et du distillat, les géométries de fibres ondulées fournissent des flux et des taux de rendement supérieurs à ceux des autres configurations. La mise en œuvre d'un écoulement pulsé et intermittent pour contrôler la polarisation en distillation membranaire a également été examinée. Notre étude permet de conclure que ces types d'écoulements ont un impact positif sur les taux de rendement et le facteur d'amélioration volumique (gain en flux ramené par rapport à l'augmentation du volume de l'équipement) sans compromis sur le taux de remplissage des carters de fibres creuses. / The current PhD work emphasizes on various aspects of membrane distillation for approaching zero liquid discharge in seawater desalination. In broader sense, two themes have been discussed in detail: (i) correlation between membrane features and their performance in MD (ii) understanding and control of thermal polarization in MD. Introduction and state-of-the-art studies of MD including progress in membrane development, understanding the transport phenomenon, recent developments in module fabrication, fouling and related phenomenon and innovative applications have been discussed in introductory part of the thesis. The effect of operating conditions and dope compositions on membrane characteristics and correlation between membrane features and their performance has been discussed in subsequent section. It has been established that membrane morphology plays a crucial role in performance of the membrane for real applications. Furthermore, it has been demonstrated that the effect of membrane morphology is different for direct contact and vacuum configurations. Theoretical and experimental aspects of thermal polarization in direct contact membrane distillation have also been investigated. Thermal polarization phenomenon in a flat sheet membrane has been studied by using a specifically designed cell. The effect of operating conditions and solution concentration on thermal polarization has been explored experimentally. It has been observed that increased solution concentration favors the thermal polarization due to resulting poor hydrodynamic at the membrane surface and increase in diffusion resistance to the water vapors migrating from bulk feed phase to the membrane surface. Some active and passive techniques to decrease thermal polarization and possible fouling in membrane distillation have also been discussed in the current study. Thermal polarization can be greatly reduced by inducing secondary flows in the fluid flowing inside the fiber. The induction of secondary flows in the current study has been realized by using the fibers twisted in helical and wavy configurations. Due to improvement of thermal polarization coefficient on up and downstream, the undulating fiber geometries provide high flux and superior performance ratio. Application of intermittent and pulsatile flow to control thermal polarization in MD has also been discussed. It has been inferred that these flows have positive impact on performance ratio and volume based enhancement factors without compromising on packing density of the system. The application of MD for treatment of produced water has also been studied.

Nous nous intéressons au traitement tertiaire d'eaux issues de stations d'épuration traitant des eaux usées domestiques, en vue de leur réutilisation en particulier pour l'irrigation. Les opérations de séparation membranaires sont aujourd'hui les plus souvent considérées pour ce type de traitement, avec par exemple l'osmose inverse couplée à de l'ultrafiltration en pré traitement. Ces solutions présentent les inconvénients propres à ces technologies, inconvénients qui restent à lever au plan scientifique mais aussi au plan technologique. Notre objectif initial était de reconstruire totalement le schéma de procédé de réutilisation des eaux, à partir de son analyse globale. Nous avons pu réaliser seulement trois des étapes de ce travail : L'analyse de l'efficacité de techniques de modification de surface de membranes d'ultrafiltration en vue de rendre le colmatage réversible. L'analyse de la faisabilité d'utiliser la distillation membranaire pour traiter des eaux usées en sortie de station d'épuration traditionnelles ou par bio réacteurs à membranes, dont nous avons fait une évaluation expérimentale à partir d'eaux de complexité croissante, allant jusqu'au traitement d'eaux prélevées directement en sortie de station. Les résultats prometteurs de ces essais ont été complété par une recherche de points de fonctionnement de la distillation membranaire, par une analyse classique de bilans matière et d'énergie, dont l'originalité est la prise en compte du facteur de conversion comme paramètre opératoire. / We are interested in polishing steps of waters from sewage treatment plants dealing with domestic wastewater, with a view to their re-use, in particular for irrigation. Membrane separation operations are today most often considered for this type of treatment, with, for example, reverse osmosis coupled with ultrafiltration as a pretreatment. These options present the disadvantages peculiar to these technologies, disadvantages which still need to be sorted out scientifically but also at the technological level. Our initial objective was to completely reconstruct the water reuse flow sheet, based on its overall analysis. We were able to achieve only three of the stages of this work: Analysis of the efficiency of surface modification techniques of ultrafiltration membranes in order to make them fouling resistant. The analysis of the feasibility of using membrane distillation to treat wastewater discharged from traditional sewage treatment plants or by bio-membrane reactors, of which we have made an experimental evaluation based on waters of increasing complexity, up to the treatment of water taken directly from the treatment plant. The promising results of these tests lead us to define operating points for membrane distillation, by a classical analysis of material and energy balances, in which the stage cut-off was considered as an operational parameter.