L'intégrité des membranes cellulaires est essentielle à la survie et au bon fonctionnement de la cellule. Or, ces membranes sont constamment endommagées. La première partie de cette étude porte sur la réparation de la membrane plasmique perforée suite à l'exposition à des contraintes physiques, chimiques ou biochimiques. Nous décrivons un nouveau mécanisme de réparation de la membrane plasmique qui met en jeu le complexe III de la machinerie des ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). Nos observations suggèrent que les ESCRTs seraient impliquées dans l'élimination de portions endommagées de membrane plasmique par bourgeonnement. Nos résultats portent une information novatrice dans le domaine des ESCRTs et pourrait aider à comprendre plus en détail le mode de fonctionnement des ESCRTs. La deuxième partie de cette étude porte sur la réponse cellulaire à l'endommagement physique (laser) ou chimique (par pontage chimique) d'organites de trafic. Nous montrons l'implication des mécanismes d'autophagie dans la réponse à l'endommagement des endosomes et de l'appareil de Golgi. Cette réponse comprend un recrutement rapide de la protéine LC3 (une des seules protéines détectables sur les membranes des autophagosomes matures). Nous avons montré également l'implication d'une ubiquitination rapide ainsi que du recrutement des protéines p62 et NBR1 (capables de lier à la fois l'ubiquitine et la protéine LC3). Le mécanisme observé présente de nombreux points communs avec d'autres mécanismes d'autophagie sélective mais révèle néanmoins des particularités comme le recrutement direct de LC3 sur les membranes de l'appareil de Golgi endommagé. Notre étude comprend donc l'étude de deux mécanismes cellulaires de réponse aux endommagements de membrane qui mettent en évidence l'existence de mécanismes de surveillance systématique de l'homéostasie des organelles et de la membrane plasmique. Ces mécanismes sont adaptés à la nature des membranes endommagées

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion des objets d'un système biomimétique modèle (lipides, protéines). L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. La dépendance en taille, les valeurs obtenues et le mode opératoire simple permettent d'espérer la réalisation prochaine d'une véritable séparation électrophorétique pour un mélange de protéines.

L'hypophyse antérieure assure une interface endocrine entre le cerveau et les organes périphériques. En effet, cette glande sécrète de manière pulsatile ses différentes hormones dans la circulation générale sous l'influence de facteurs hypothalamiques déversés épisodiquement dans le système porte de l'éminence médiane. Toutefois, l'influence hypothalamique ne saurait à elle seule expliquer l'harmonisation des sécrétions des cellules d'un même type endocrine, qui sont distribuées de manière hétérogène au sein du parenchyme. Il existe sans doute des mécanismes permettant de coordonner l'activité des cellules endocrines à l'échelle de la glande entière. Au cours de cette thèse, nous avons montré la présence d'un mécanisme de communication intra-hypophysaire permettant un transfert rapide d'information au sein d'un réseau de cellules non-endocrines, les cellules folliculostellaires (FS). Ce travail réalisé sur des tranches épaisses d'hypophyse de rat, modèle qui maintient intacte l'architecture cordonale du tissu, a permis de mettre en évidence l'excitabilité membranaire des cellules FS, propriété jusqu'alors inconnue. Cette excitabilité sert de base à l'initiation de vagues calciques, qui peuvent se propager rapidement via des jonctions gap à des régions éloignées de la glande. Nous avons également étudié la libération d'interleukine-6 (IL-6) par les cellules FS. Cette cytokine est connue pour stimuler l'ensemble des sécrétions hormonales hypophysaires. La production d'IL-6 est stimulée par le PACAP. Ce neuropeptide semble agir directement au niveau du gène, et son effet dépend de l'état des communications intercellulaires au sein du réseau. Les cellules FS pouvant répondre à des stimuli d'origine centrale et périphérique, ainsi que dialoguer avec les cellules endocrines, l'ensemble de ces résultats montre que le réseau de cellules FS pourrait fournir un mécanisme efficace qui coordonnerait le fonctionnement de la glande en fonction des différents états physiologiques

La contribution des cellules souches au développement tumoral est une percée conceptuelle récente dans notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la carcinogenèse. En ce sens, il est reconnu depuis quelques années qu'une sous-population de cellules souches mésenchymateuses (MSC) mobilisables en réponse à des facteurs de croissance tumoraux pourrait contribuer au développement tumoral. Les recherches rapportées dans ce mémoire nous ont permis d'étudier certains partenaires clé dans la régulation de la migration et de la survie cellulaire des MSC. L'observation préalable d'une modulation conjointe de l'expression d'une métalloprotéase matricielle de type membranaire (MT1-MMP) et du transporteur microsomal de glucose-6-phosphate (G6PT) nous a permis d'évaluer la contribution respective de ces joueurs dans la signalisation affectant la chimiotaxie des cellules souches ainsi que des cellules tumorales cérébrales. De plus, nous avons évalué l'impact de certains « mannosides » synthétisés en vue de cibler spécifiquement les fonctions de surfaces de MT1-MMP et qui pourraient être à l'origine de nouvelles approches thérapeutiques anticancéreuses affectant le recrutement des cellules souches au foyer tumoral. Finalement, l'importance de l'axe de signalisation MT1-MMP/G6PT dans la mobilisation du calcium intracellulaire en réponse à la sphingosine-1-phosphate, un lipide bioactif synthétisé par des niveaux d'expression élevés de sphingosine-kinase retrouvé au niveau tumoral, permet également de concevoir le ciblage effectif de l'un ou l'autre de ces partenaires dans la progression tumorale. L'ensemble de nos résultats permettra de mieux comprendre les phénomènes régulant la survie et le recrutement des MSC aux sites de foyers tumoraux, en plus de fournir de précieux renseignements sur un nouvel axe original de signalisation liant les fonctions de MT1-MMP à celles, inattendues, de G6PT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellules souches, Cancer, MT1-MMP, G6PT, Sphingosine-1-phosphate.

Durant la progression tumorale cérébrale, les cellules envahissent le tissu environnant, afin de s'y infiltrer. Pour ce faire, elles sécrètent ou expriment à leur surface des métalloprotéases matriciel1es (MMPs), capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces MMPs, la MMP membranaire de type 1 (MT1-MMP) joue un rôle crucial dans l'acquisition du potentiel invasif des cellules tumorales cérébrales. La MT1-MMP dégrade de nombreux composants de la matrice extracellulaire et des protéines de surface. Grâce à son activité protéolytique, la MT1-MMP joue ainsi un rôle important dans les différentes étapes de la progression tumorale cérébrale incluant l'angiogenèse. Le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP serait donc une approche thérapeutique efficace dans le traitement de gliomes. Bien que l'activité protéolytique de la MT1-MMP demeure sa fonction la plus importante, plusieurs études tendent à démontrer que la portion cytoplasmique de l'enzyme contribue à l'induction de signaux intracellulaires possiblement impliqués dans la chimio et la radiorésistance à la thérapie des gliomes. Parmi les marqueurs associés à cette résistance et surexprimés dans les gliomes hautement malins, il y a la cyclooxygénase-2 (Cox-2). Toutefois, le mécanisme moléculaire reliant l'activité intracellulaire de MT1-MMP à l'expression de Cox-2 demeure incompris. La première partie de mon mémoire a pour objectif d'étudier le ciblage pharmacologique des fonctions de MT1-MMP par l'actinonine, un inhibiteur sélectif de l'aminopeptidase N/CD13 et des MMPs solubles, dans les cellules de glioblastome U87. Nous y montrons que l'actinonine inhibe l'activation de la proMMP-2 induite par la concanavaline-A (ConA), une condition expérimentale connue pour induire l'expression de MT1-MMP dans les cel1ules U87. De plus, grâce à l'analyse de l'expression génique de MT1-MMP, l'actinonine n'a pas modulé l'expression de MT1-MMP induite par la ConA, suggérant que les effets de l'actinonine sont post-transcriptionnels. Nos résultats positionnent l'actinonine comme un possible candidat thérapeutique ciblant MT1-MMP. La deuxième partie de mon mémoire s'est orientée sur l'axe MT1-MMP/Cox-2 dans les glioblastomes U87. Nos observations préalables d'une modulation conjointe de l'expression de MT1-MMP et de Cox-2 dans les cellules isolées de glioblastomes humains U87 induite par la ConA nous ont permis d'évaluer le rôle de la ConA dans le déclenchement des processus cellulaires pro-inflammatoires qui régulent l'expression de Cox-2. Nous avons trouvé que le traitement avec la ConA, ou la surexpression directe de MT1-MMP recombinante conduit à l'induction de Cox-2 via une voie de signalisation impliquant NF-kB/IKKy. Collectivement, les résultats présentés dans ce mémoire apportent de nouvelles informations quant à l'implication du domaine intracellulaire de la MT1-MMP dans le phénotype pro-inflammatoire des cellules cancéreuses cérébrales. Ceci inspirera la conception de nouvel1es stratégies de thérapie pouvant combiner l'action des inhibiteurs de MT1-MMP à celle des drogues anti-inflammatoires pour le traitement de gliomes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, Concanavaline-A, Actinonine, Cox-2, Inflammation, Glioblastome

L'implication de la Membrane Type-Matrix Metalloproteinase (MT1-MMP) dans la progression du cancer a été grandement étudiée dans la dernière décennie. Elle possède une vaste variété de substrats, incluant des composants de la matrice extracellulaire, des cytokines et des récepteurs membranaires. Nos résultats identifient le marqueur de cellules souches (CSC) CD133 comme une nouvelle cible de l'activité protéolytique de la MT1-MMP. Des essais d'immunoprécipitation et de clivage in vitro effectués à l'aide de protéines recombinantes ont démontré que la MT1-MMP interagit physiquement avec CD133 et clive son domaine N-terminal à la position 30KAWN↓Y34. De plus, cette interaction semble commencer au niveau intracellulaire, dans le réticulum endoplasmique, avant l'activation de la proMT1-MMP et avant la maturation complète de CD133; toutefois, seulement la forme mature de CD133 peut être clivée. Ces résultats représentent la première interaction protéine-protéine connue de CD133, dont la fonction cellulaire demeure incomprise. Des expériences supplémentaires pourraient mener à une meilleure compréhension de cette protéine et de son rôle dans la biologie des CSCs. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, CSC, N-terminal, réticulum endoplasmique

Le système Tat (pour Twin Arginine Translocation) exporte des protéines repliées depuis le cytoplasme vers le périplasme des bactéries. L'adressage des protéines à exporter au système Tat repose sur une séquence signal spécifique amino terminale clivée après exportation. Chez le phytopathogène Dickeya dadantii, l'homologue de pectine lyase PnlH possède une séquence signal Tat qui assure son adressage au système Tat mais qui n'est pas clivée après exportation et ancre la protéine dans la membrane externe. Chez les protéobactéries, la majorité des protéines de membrane externe sont soit des lipoprotéines soit des protéines intégrales de membrane en tonneau β. L'adressage de ces protéines à la membrane externe repose sur des voies spécifiques du type de protéine : la voie Lol pour les lipoprotéines et la combinaison des chaperons périplasmiques SurA, Skp et DegP et du complexe de membrane externe Bam (β barrel assembly machinery) pour les protéines en tonneau β. Au cours de ce travail, l'étude de l'adressage de PnlH à la membrane externe a montré que SurA se liait à la séquence signal hydrophobe de PnlH pour la protéger de l'environnement hydrophile au cours de son transit dans le périplasme. La séquence signal de PnlH (41 acides aminés) porte l'intégralité de l'information nécessaire à son adressage à la membrane externe. La nature de l'information adressant les protéines au système Tat est bien connue et dans ce travail nous nous sommes efforcés d'identifier les informations requises pour les deux dernières étapes de l'adressage de PnlH à la membrane externe : la traversée du périplasme et l'insertion dans la membrane externe. La délétion d'une région conservée comprise entre les résidus 28 et 41 de la séquence signal de PnlH affecte l'adressage de cette dernière à la membrane externe. Des substitutions des acides aminés conservés de cette région ne semblent pas affecter l'adressage de PnlH, indiquant que l'information nécessaire à l'adressage de PnlH à la membrane externe après exportation ne réside pas dans la séquence en acides aminés de la séquence signal de PnlH. En revanche, nos données suggèrent que la présence d'une hélice α hydrophobe dans la séquence signal de PnlH est importante pour son adressage à la membrane externe. Cette observation est particulièrement intéressante puisqu'une telle structure est généralement considérée comme une caractéristique des protéines de membrane interne.

Les cellules des muscles striés squelettiques sont constituées d'éléments contractiles enveloppés par un réseau membranaire. La formation et l'entretien du muscle strié squelettique impliquent la migration des précurseurs myogéniques, la fusion des myoblastes en myotubes et la mise en place des triades. Ces évènements reposent sur le remodelage des membranes et du cytosquelette d'actine des cellules musculaires. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la protéine adaptatrice CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) dans certaines étapes du développement du muscle strié squelettique. Après avoir identifié le complexe de nucléation de l'actine Arp (actin-related protein) 2/3 comme un nouvel interacteur de CKIP-1, nous avons montré que l'inhibition de l'expression de ckip-1 chez l'embryon de poisson zèbre altère la morphologie des myoblastes et empêche leur fusion du fait d'une désorganisation du cytosquelette d'actine. J'ai également montré que CKIP-1 n'est présente qu'au cours des étapes précoces de la myogenèse in vitro et in vivo chez la souris, puis elle est progressivement clivée. En outre, la modulation de l'expression de CKIP-1 provoque des défauts membranaires aussi bien in vitro qu'in vivo dans le muscle adulte de souris, suggérant que CKIP-1 est impliquée dans le remodelage des membranes. CKIP-1, par ses capacités à remodeler le cytosquelette d'actine et les membranes, pourrait intervenir dans plusieurs étapes de la vie du muscle : la migration, la fusion des myoblastes et la mise en place ou le maintien du réseau membranaire interne des cellules du muscle strié squelettique.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal