Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Lintégrité de la structure et de la dynamique de la membrane plasmatique est essentielle à la fonction de la cellule. Cette intégrité peut être évaluée par la mesure de la fluidité membranaire globale, reflet de lensemble des mouvements des éléments membranaires au sein de la bicouche phospholipidique. Or lintégrité de la membrane est menacée, entre autre, par les modifications de la structure lipidique résultant de lipoperoxidations. Ces peroxidations lipidiques résultent des attaques radicalaires par des espèces oxygénées activées (EOA) produites lors dagression oxydante sur les acides gras membranaires. Nous posons lhypothèse que les conditions doxygénations extrêmes, qui peuvent être rencontrées lors dune anesthésie ou lors dun stress oxydant induit par lexercice chez le cheval, peuvent affecter la fluidité membranaire des érythrocytes et que ces variations peuvent être modulées par la modification de la structure membranaire du globule rouge par un supplément antioxydant oral adéquat. Lobjectif de ce travail est donc dévaluer les effets de différentes conditions doxygénation et doxydation in vitro (par contact avec différents mélanges gazeux), puis in vivo sous anesthésie générale (en faisant varier la fraction inspirée en oxygène) et à lexercice, et enfin dévaluer les effets dune supplémentation enrichie en acides gras de type oméga-3 sur la fluidité membranaire du globule rouge. Les faibles pressions partielles en oxygène dans le sang artériel (PaO2), obtenues in vitro par contact du sang avec un gaz anoxique et in vivo sous anesthésie par inspiration dair ambiant (<45mmHg et <60mmHg respectivement), nont pas eu deffet sur la fluidité ni sur la structure de la membrane érythrocytaire. On peut supposer que le stimulus est insuffisant ou que la protection de la membrane résulte dune capacité antioxydante du plasma et de défenses cellulaires suffisantes. Les pressions partielles élevées en oxygène dans le sang, obtenues in vitro par contact du sang avec de loxygène pur (PaO2>500mmHg), ont induit un stress oxydant modéré qui na pas affecté la structure phospholipidique de la membrane malgré la peroxidation des acides gras de type oméga-6. La fluidité membranaire na pas été affectée par ces facteurs. In vivo, les pressions partielles élevées en oxygène observées dans le sang (>200mmHg) ont été insuffisantes pour induire des peroxidations significatives et des modifications de la fluidité membranaire. En revanche, les valeurs élevées de PaO2 ont augmenté la sensibilité du sang à lhémolyse dans un premier temps, puis sa résistance 24 heures après un retour à la normoxie. Dans ces conditions aucun effet na été noté sur la viscosité du sang ni la perfusion musculaire. Par ailleurs, lexercice intense semble diminuer la fluidité membranaire du globule rouge chez le cheval de sport. Cette diminution sobserve dès 15 minutes après larrêt de lexercice et persiste 24 heures après. Il existe également des corrélations entre certains de ces marqueurs indirects et la fluidité membranaire. La supplémentation na pas eu deffet significatif direct sur lévolution de la fluidité membranaire observée au repos. Mais elle a pourtant influencé la structure de la membrane. En effet, la complémentation a induit une augmentation du pourcentage dacides gras de type oméga-3 contenus dans la membrane érythrocytaire ainsi que du ratio oméga-3/oméga-6 pendant la période de repos. Cela résulte de lincorporation sélective dans la membrane de lacide eicosapentaénoïque (EPA) et de lacide docosahéxaénoïque (DHA) apportés par voie orale. Mais aucune corrélation na été observée dans notre étude entre la composition en acides gras de la membrane et le marqueur de la fluidité membranaire. La supplémentation na pas eu deffet significatif direct sur lévolution de la fluidité membranaire observée à lexercice, mais en a limité la diminution immédiate. Il résulte des études menées que : les conditions doxygénation les plus extrêmes qui peuvent être rencontrées en conditions atmosphériques ne semblent pas affecter la fluidité de la membrane. En revanche, un exercice intense, associé à une demande énergétique accrue, peut induire une diminution de la fluidité membranaire en corrélation avec les marqueurs du stress oxydant. Des modifications de la structure membranaire en acides gras polyinsaturés à longue chaîne de type oméga-3 naffectent pas la fluidité membranaire mais modulent les effets du stress oxydant lors de lexercice. La fluidité membranaire des érythrocytes pourrait être considérée comme un marqueur direct du stress oxydant dans certaines conditions. Mais ce marqueur semble moins sensible et global que dautres marqueurs du stress cellulaire tels que le test dhémolyse ou la mesure de la concentration plasmatique de peroxydes lipidiques spécifiques. The maintenance of plasmatic membrane integrity is mandatory for cell function. This integrity can be assessed by the measurement of global membrane fluidity which is proportional to the whole rotational and lateral diffusion rates of membrane components within the phospholipid bilayer. Membrane integrity could be threatened by changes in lipid structure as a result of lipid peroxidation by free radical species during oxidative stress. We hypothesize that extreme oxygenation status present during anesthesia or during exercise-induced oxidative stress in the horse can alter erythrocyte membrane fluidity (EMF), and that these changes in fluidity depend on variations in erythrocyte membrane structure under the action of an appropriate oral anti-oxidant supplementation. The aims of the study was: to assess the effect(s) of various oxygenation and oxidative conditions firstly created in vitro (by contact between erythrocyte and different gaz mixtures), and secondly in vivo during general anesthesia (with varying inspired oxygen fractions) as well as during exercise. To assess the effects of an omega-3 fatty acid-enriched supplementation on EMF. Low partial oxygen pressures, both obtained in vitro and in vivo under anesthesia (respectively <45 and <60 mmHg) did not have any effect on EMF or membrane structure. Erythrocyte membrane may have been protected by an increase in plasmatic anti-oxidative capacity and cellular defenses. High partial oxygen pressures (>500 mm Hg) obtained in vitro induced a moderate oxidative stress which did not alter the phospholipidic structure of the membrane despite peroxidation of omega 6 fatty acids. Partial oxygen pressures obtained in vivo (>200 mm Hg) were unable to induce significant peroxidation and alteration in membrane fluidity. However, high PaO2 values initially increased sensitivity of blood to hemolysis, followed by a tendency towards resistance to hemolysis after 24hours. Intense exercise decreases EMF in the sports horse. This was observed as soon as 15 minutes after exercise and persisted during the recovery period 24 hours later. Correlations were found between oxidative stress indirect markers and membrane fluidity. Supplementation did not affect membrane fluidity but influenced membrane structure by increasing the pourcentage of omega-3 fatty acids and the omega3/omega6 ratio at rest. These changes resulted from selective incorporation into the membrane of orally provided EPA and DHA . However, we could not evidence a correlation between membrane composition and the marker of membrane fluidity (correlation-relaxation time Tc). During exercise, supplementation had no direct effect on variations of membrane fluidity but tapered its immediate decrease. In conclusion, our studies show that the most extreme conditions encountered under atmospheric conditions do not appear to affect EMF. However intense exercise combined with increased energetic requirements induces a decrease in EMF which correlates with variations in markers of oxidative stress. Modifications of membrane composition in long-chain omega-3 polyinsaturated fatty acids do not affect EMF but modulate oxidative stress during exercise. EMF could be a direct marker of oxidative stress under certain conditions but appears less sensitive and comprehensive than other markers of celllular stress such as the hemolysis test or the concentration in specific lipidic peroxidation products.

L'angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de capillaires préexistants, est un processus essentiel au développement et à la croissance des tumeurs. Bon nombre de protéines ont été étudiées afin d'élucider les voies de signalisation impliquées dans l'angiogenèse, dont la métalloprotéase membranaire de type 1 (MT1-MMP). Cette protéine est reconnue pour jouer un rôle crucial dans la migration cellulaire, détruisant la matrice extracellulaire pour permettre aux cellules de migrer et ce, dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes impliqués dans le contrôle de son activité demeurent incompris. Dans la présente étude, nous avons observé, en utilisant des procédures d'immunoprécipitation et de microscopie confocale, que la stimulation des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines (HUVECs) avec la sphingosine-1-phosphate (S1P), un lipide qui induit la migration des cellules endothéliales (CEs), provoque le transfert de la MT1-MMP à la périphérie cellulaire et son association avec p130Cas (Crk-associated substrate). p130Cas est une protéine d'arrimage impliquée dans les voies de signalisation de la motilité cellulaire et est également reconnue pour se relocaliser dans des replis membranaires suite à une stimulation à la S1P. Ces résultats suggèrent fortement que l'identification du complexe MT1-MMP/p130Cas au front principal des CEs migrantes pourrait être un mécanisme efficace par lequel la protéolyse péricellulaire est reliée à l'activation des voies de signalisation, permettant la migration coordonnée des CEs au cours de l'angiogenèse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Angiogenèse, MT1-MMP, p130Cas, Migration, Sphingosine 1-phosphate.

Durant la progression du cancer, les cellules tumorales doivent envahir les tissus afin de se propager dans l'organisme. Pour ce faire, elles sécrètent ou expriment à leur surface des métalloprotéases matricielles, des enzymes capables de dégrader les composants de la matrice extracellulaire. Parmi ces enzymes, la métalloprotéase matricielle de type membranaire 1 (la MTI-MMP) joue un rôle primordial dans la progression tumorale. La MTI-MMP dégrade de nombreux composants de la matrice extracellulaire et des protéines de surface. Grâce à son activité protéolytique, la MTI-MMP joue un rôle important dans les différentes étapes de la progression tumorale. En effet, la MTl-MMP est importante dans l'angiogenèse tumorale, la formation de nouveaux capillaires à partir de vaisseaux pré-existants, car elle permet aux cellules endothéliales d'envahir la matrice extracellulaire. La MTI-MMP est également impliquée dans l'invasion tumorale et la formation de métastases. Bien que l'activité protéolytique de la MTI-MMP soit importante pour ses fonctions, plusieurs études ont démontré la participation de la séquence cytoplasmique de l'enzyme dans la migration et l'invasion tumorales. Toutefois, les mécanismes par lesquels le domaine intracellulaire de la MTI-MMP contribue aux fonctions de l'enzyme n'ont pas encore été élucidés. La présente thèse avait pour objectif principal d'étudier les mécanismes menant à l'implication du domaine cytoplasmique de la MTI-MMP dans la progression tumorale. Le premier objectif des travaux de recherche présentés dans cette thèse était d'identifier et de caractériser la phosphorylation de la MTI-MMP dans sa portion cytoplasmique. Pour ce faire, nous avons utilisé la mutagenèse dirigée afin d'identifier le site de phosphorylation de la MTI-MMP. Nos résultats démontrent que la MTI-MMP est phosphorylée sur son unique résidu tyrosine 573 situé dans la portion intracellulaire de l'enzyme. Cette phosphorylation a été confirmée par l'utilisation d'anticorps reconnaissant spécifiquement les formes phosphorylées de la MTI-MMP. De plus, la phosphorylation de cette enzyme requiert la présence de la kinase Src. La stimulation des cellules tumorales avec un facteur chimioattracteur induit la phosphorylation de la MTI-MMP endogène dans les cellules tumorales et endothéliales. Nous avons également montré que la phosphorylation de la MTI-MMP sur son résidu tyrosine intracellulaire est importante pour la migration des cellules tumorales et endothéliales. Le second objectif de cette thèse était d'étudier l'implication de la phosphorylation de la MTI-MMP dans la prolifération des cellules dans des matrices tridimensionnelles in vitro ainsi que dans la croissance tumorale in vivo. Nous avons constaté que la phosphorylation est importante pour la croissance des cellules tumorales dans des matrices tridimensionnelles alors qu'elle ne l'est pas dans des matrices en deux dimensions. Également, la phosphorylation de la MTI-MMP est nécessaire aux propriétés tumorigènes des cellules tumorales, à savoir la capacité de ces dernières à envahir de denses barrières de collagène fibrillaire et à former des colonies dans l'agar mou. Fait intéressant, nous avons constaté que l'inhibition de la phosphorylation de la MTI-MMP empêche la formation de xénogreffes chez la souris, suggérant que la MTl-MMP phosphorylée joue un rôle essentiel dans les mécanismes menant au développement tumoral. Le troisième objectif de cette thèse était de vérifier si la MTI-MMP phosphorylée était nécessaire pour la progression tumorale au niveau clinique. Nous avons donc étudié des spécimens provenant de biopsies de patients atteints de neuroblastome. Nos résultats ont démontré que la MTI-MMP phosphorylée était exprimée surtout dans les cas de neuroblastome avec un mauvais pronostic, alors que les cas qui avaient un bon pronostic exprimaient peu la MTI-MMP. Ces données indiquent que la phosphorylation de la MTI-MMP pourrait jouer un rôle important dans le développement du neuroblastome. Compte tenu du rôle majeur de la MTI-MMP phosphorylée dans la progression tumorale, le quatrième objectif de ces travaux de recherche était de concevoir une molécule pouvant inhiber la phosphorylation de la MTl-MMP afin de réduire le développement tumoral. Nous avons donc développé l'ACM-14, un peptide correspondant à la séquence cytoplasmique de la MTl-MMP dans laquelle la tyrosine a été remplacée par une phénylalanine et couplé à une séquence perméable aux cellules. Nos résultats démontrent que ACM-14 réduit la phosphorylation de la MTl-MMP et retarde par conséquent la croissance tumorale in vivo. En somme, les travaux présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations quant à l'implication du domaine intracellulaire de la MTI-MMP dans la progression tumorale. Les résultats présentés vont contribuer au développement et à l'élaboration de nouvelles stratégies afin d'inhiber le développement du cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cancer, Invasion tumorale, MTI-MMP, Phosphorylation, Traitement du cancer.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

L’autophagie est un processus de dégradation et de recyclage des composés cellulaires. Ce mécanisme est nécessaire que ce soit à l’état basal pour éliminer des agrégats protéiques ou des organites endommagés ou en condition de stress, tels que la carence nutritionnelle, l’hypoxie ou encore des traitements anticancéreux. De ce fait, l’autophagie est un processus essentiel à la survie ainsi qu’au maintien de l’homéostasie cellulaire. Connaître les joueurs et comprendre les mécanismes de régulation de l’autophagie sont donc importants. Les GTPases RABs sont des régulateurs importants de ce processus. Celles-ci agissent comme des interrupteurs moléculaires permettant d’exécuter rapidement des fonctions dans la cellule. Les RABs sont activées par des Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEF) alors que les GTPase Activating Proteins (GAP) accélèrent la désactivation de la RAB. RAB21 est essentielle dans les étapes tardives de l’autophagie. En effet, RAB21 est activée par la carence nutritionnelle, via sa GEF MTMTR13, et permet le trafic d’une SNARE requise pour le flux autophagique. Lors d’une carence prolongée, l’activité de RAB21 diminue rapidement, suggérant ainsi le rôle d’une GAP dans cette régulation négative. Toutefois, aucune GAP pour RAB21 n’a été identifiée jusqu’à maintenant. Un criblage génétique chez la drosophile a permis d’identifier quelques candidats. Suite à des essais d’interactions protéiques, il s’est avéré que seule la GAP TBC1D25 interagissait avec RAB21. De plus, cette interaction est augmentée en fonction de la carence nutritionnelle. Des immunofluorescences par microscopie confocale ont révélé que l’interaction RAB21-TBC1D25 était située en partie au niveau des endosomes précoces. Par ailleurs, une activation prolongée de RAB5, située sur les endosomes précoces, inhibe l’interaction RAB21-TBC1D25. De plus amples expériences devront être réalisées afin d’expliquer ces résultats. Dans un autre ordre d’idée, RAB21 est surexprimée dans les cellules ayant un flux autophagique élevé ainsi que dans certaines tumeurs de cancer du côlon (données non publiées du laboratoire). L’expression de Tbc1d25 dans ces mêmes tumeurs ne semble pas augmentée, indiquant que TBC1D25 pourrait être un inhibiteur autophagique spécifique aux cellules ayant un flux autophagique élevé. À la lumière des résultats obtenus, TBC1D25 semble être une GAP pour RAB21 qui permet sa régulation négative suivant l’activation de l’autophagie induite par la carence nutritionnelle. / Abstract : Autophagy is defined as the lysosomal degradation and recycling of cellular constituents. At basal levels, autophagy eliminates protein aggregates or damaged organelles. In condition of stress, such as in condition of nutritional deficiency, hypoxia or cancer treatments, autophagy allow cells to adapt and survive. Therefore, autophagy is an essential system required for survival and maintenance of cellular homeostasis. It is thus essential to identify the cellular entities and mechanisms regulating this process. RAB GTPases were identified as master regulators of autophagy. These particular proteins act as molecular switches for the rapid execution of cellular responses. RABs are activated by Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEF) whereas GTPase Activating Proteins (GAP) accelerates RAB deactivation. RAB21 is essential in the late stages of autophagy. Indeed, RAB21 is activated by nutritional deficiency, via its GEF MTMTR13, to allow trafficking of a SNARE required for autophagic flux. During starvation, RAB21 is deactivated which suggest that a GAP could negatively regulate RAB21 activity. However, to date no GAP for RAB21 has been identified. An eye modifier genetic screen in Drosophila was performed to identify potential RAB21 GAPs and some candidates were identified. As a result of this screen, the GAP TBC1D25 was identified as interacting with RAB21. Moreover, this interaction was increased by starvation. Proximity ligation assays revealed that the RAB21-TBC1D25 interaction partially localized at early endosomes. Moreover, prolonged activation of RAB5, located at early endosomes, inhibited RAB21-TBC1D25 interaction. Further experiments will be carried out to explain these results. With respect to the roles of autophagy in cancer, RAB21 was shown to be overexpressed in cells with high autophagic flux as well as in some colon cancer tumors. Importantly, the expression of Tbc1d25 in these same tumors does not appear to be increased, indicating that TBC1D25 could be an autophagic inhibitor specific to cells with a high autophagic flow. My work suggests that TBC1D25 could function as a GAP to negatively regulate RAB21 activity in condition of prolonged starvation.

Du cerveau à l’os, la rigidité et la composition de la matrice extracellulaire varient énormément et jouent un rôle dans les réponses cellulaires. La rigidité influe également sur la tension de la membrane plasmique, elle-même régulée par le trafic membranaire. Comment la rigidité et la composition du substrat peuvent réguler l'exocytose, qui à son tour régule la tension de la membrane, reste largement inconnu. Ici, j'ai utilisé l’imagerie pHluorin d’évènements uniques d’exocytose de cellules cultivées sur des substrats de rigidité et de composition contrôlée pour explorer la régulation de VAMP2 et VAMP7. J'ai développé un logiciel informatique pour identifier automatiquement les évènements de fusion, permettant une analyse rapide de données. J'ai contribué à l'étude montrant que l’exocytose VAMP7 est régulée par la kinase src, qui phosphoryle VAMP7 dans son domaine Longin (LD) (Burgo et al. JBC 2013). De plus, j’ai trouvé que la rigidité du substrat stimule l’exocytose, en présence de la laminine, de VAMP7, mais pas VAMP7 sans LD ni VAMP2. VAMP7 et VAMP7 sans LD sont par ailleurs également sensibles aux variations de la tension membranaire induites par chocs osmotiques. Enfin, j'ai identifié que LRRK1 est un partenaire du LD, et contrôle le transport rétrograde de VAMP7.Ces approches m’ont permis de révéler un nouveau mécanisme par lequel la rigidité, agissant sur la signalisation des intégrines, contrôle le transport de VAMP7 via LRRK1 et Rab21 (Wang et al. soumis). Ce mécanisme pourrait avoir un large intérêt potentiel pour comprendre la dynamique de la membrane dans des conditions normales et pathologiques, en particulier le cancer / From brain to bones, stiffness and composition of the extracellular matrix vary greatly and play a role in cell responses. Substrate rigidity also impacts plasma membrane tension, which has a close relationship with membrane trafficking. How substrate rigidity and chemistry sensing may regulate exocytosis, which in turn regulates membrane tension, is still largely unknown. Here, I used pHluorin imaging of single vesicle exocytosis in cells cultured on substrates of controlled rigidity and composition to explore the regulation of VAMP2 and VAMP7-mediated exocytosis. I developed a computer software to automatically identify fusion events thus allowing quick analysis of batch data. I contributed to the study showing that VAMP7 exocytosis is regulated by src kinase which phosphorylates VAMP7 in its Longin domain (LD) (Burgo et al. JBC 2013). I further found that VAMP7 but not VAMP7 lacking LD- or VAMP2-mediated secretion was stimulated by substrate stiffness on laminin. VAMP7 and VAMP7 lacking LD were similarly sensitive to osmotic chock-induced membrane tension changes. Finally, i showed that LRRK1, a regulator of egf receptor transport, is a partner of the LD, and controls the retrograde transport of VAMP7. These approaches allowed me to reveal a new mechanism whereby substrate rigidity, by acting on integrin signalling, enhances VAMP7 exocytosis via LRRK1- and Rab21-dependent regulation of its peripheral readily-releasable pool (Wang et al. submitted). This mechanism may have broad potential relevance for plasma membrane dynamics in normal conditions and diseases, particularly cancer

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La leishmaniose est une maladie causée par des parasites appartenant au genre Leishmania. Elle est transmise à l'homme par la piqûre d'un insecte vecteur et est endémique dans plus de 88 pays où approximativement 350 millions de personnes vivent dans les zones à risque. À ce jour, aucun vaccin efficace n'est encore disponible pour prévenir la leishmaniose et le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie. Les composés utilisés pour traiter la maladie sont limités et la plupart d'entre eux sont associés à des problèmes comme le coût élevé du traitement, les effets secondaires et l'émergence de souches de parasites résistantes aux médicaments. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de molécules anti-Leishmania s'avère donc urgente. La voie métabolique de l'acide folique constitue un champ thérapeutique potentiel d'autant plus que la découverte chez Leishmania de 13 protéines appartenant à la famille de transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) permet d'envisager la possibilité de les exploiter dans un but thérapeutique. Mis à part trois (FT1, FT5 et BT1), les fonctions des autres protéines de la famille FBT sont inconnues et mon projet de doctorat avait comme objectif principal de caractériser cette famille et de tenter de trouver des fonctions à ces transporteurs. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient 1) de déterminer le profil d'expression des gènes de la famille FBT aux différentes phases de croissance chez les deux stades de vie du parasite et chez des mutants résistants au methotrexate (MTX); 2) de caractériser la fonction d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez des mutants résistants à la sinéfungine (SNF); et 3) d'étudier la localisation subcellulaire des différents membres de la famille FBT et de quelques protéines de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but d'identifier et de caractériser les transporteurs de donneurs d'unités monocarbonées, localisés au niveau de la membrane de la mitochondrie. L'analyse du profil d'expression de la famille FBT a permis de montrer que plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en phase stationnaire de croissance, tandis que seul FT1, le principal transporteur de folate, est exprimé préférentiellement en Ill phase logarithmique de croissance ce qui est en accord avec la forte accumulation de folate durant cette phase de croissance. Aussi, il semblerait que les niveaux d'expression de FT1 dépendent aussi des niveaux de folate dans le milieu de culture. De plus, cette analyse a permis d'identifier les mécanismes de recombinaison génique impliqués dans l'inactivation de FT1 chez les souches hautement résistantes au MTX. Par ailleurs, la sélection des mutants résistants au MTX et à la SNF a permis de caractériser un nouveau membre (AdoMetTl) de la famille FBT. L'AdoMetTl correspond au transporteur de haute affinité pour la S-adénosylméthionine. Finalement, les études de localisation protéique ont permis de déterminer la localisation intracellulaire de trois protéines FBT ainsi que la localisation mitochondriale des protéines de la MCF. transmise à l'homme par la piqûre d'un insecte vecteur et est endémique dans plus de 88 pays où approximativement 350 millions de personnes vivent dans les zones à risque. À ce jour, aucun vaccin efficace n'est encore disponible pour prévenir la leishmaniose et le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie. Les composés utilisés pour traiter la maladie sont limités et la plupart d'entre eux sont associés à des problèmes comme le coût élevé du traitement, les effets secondaires et l'émergence de souches de parasites résistantes aux médicaments. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de molécules anti-Leishmania s'avère donc urgente. La voie métabolique de l'acide folique constitue un champ thérapeutique potentiel d'autant plus que la découverte chez Leishmania de 13 protéines appartenant à la famille de transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) permet d'envisager la possibilité de les exploiter dans un but thérapeutique. Mis à part trois (FT1, FT5 et BT1), les fonctions des autres protéines de la famille FBT sont inconnues et mon projet de doctorat avait comme objectif principal de caractériser cette famille et de tenter de trouver des fonctions à ces transporteurs. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient 1) de déterminer le profil d'expression des gènes de la famille FBT aux différentes phases de croissance chez les deux stades de vie du parasite et chez des mutants résistants au methotrexate (MTX); 2) de caractériser la fonction d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez des mutants résistants à la sinéfungine (SNF); et 3) d'étudier la localisation subcellulaire des différents membres de la famille FBT et de quelques protéines de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but d'identifier et de caractériser les transporteurs de donneurs d'unités monocarbonées, localisés au niveau de la membrane de la mitochondrie. L'analyse du profil d'expression de la famille FBT a permis de montrer que plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en phase stationnaire de croissance, tandis que seul FT1, le principal transporteur de folate, est exprimé préférentiellement en phase logarithmique de croissance ce qui est en accord avec la forte accumulation de folate durant cette phase de croissance. Aussi, il semblerait que les niveaux d'expression de FT1 dépendent aussi des niveaux de folate dans le milieu de culture. De plus, cette analyse a permis d'identifier les mécanismes de recombinaison génique impliqués dans l'inactivation de FT1 chez les souches hautement résistantes au MTX. Par ailleurs, la sélection des mutants résistants au MTX et à la SNF a permis de caractériser un nouveau membre (AdoMetTl) de la famille FBT. L'AdoMetTl correspond au transporteur de haute affinité pour la S-adénosylméthionine. Finalement, les études de localisation protéique ont permis de déterminer la localisation intracellulaire de trois protéines FBT ainsi que la localisation mitochondriale des protéines de la MCF.