Le gène copH est l'un des 19 gènes constituant le cluster cop, impliqué dans la détoxication du cuivre dans le cytoplasme et le périplasme, chez Cupriavidus metallidurans CH34, souche modèle pour l'étude de la résistance aux métaux lourds chez les bactéries. La protéine CopH, localisée dans le périplasme, possède une structure et une fonction inconnues mais son expression est stimulée par la présence de cuivre. Nous avons analysé les propriétés de liaison CopH-Cu : les données montrent la présence d'un centre Cu(II) de type 2 dans un champ de ligands azotés. Les 2 seuls résidus histidine, a priori ligands du cuivre, n'interagiraient pas directement avec les ions Cu(II). Le site cuivre serait constitué d'atomes d'azote appartenant à la chaîne principale de la protéine.<br />L'étude des transporteurs CusA et CzcA a nécessité une purification optimisée en détergents et l'analyse de leur comportement en solution.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Ce travail de thèse s'est concentré sur l'étude de la protéine CHMP2B. Cette protéine fait partie du complexe ESCRT-III, impliqué dans divers processus de fissions membranaires à topologies inversées (genèse ces corps multivésiculés, cytokinèse, bourgeonnement des virus enveloppés, autophagie). Des mutations dans le gène codant pour CHMP2B ont été très fortement corrélées à la survenue de maladies neuro-dégénératives (démences fronto-temporales et amyotrophie latérale spineuse). Ce travail a consisté à préciser les mécanismes moléculaires d'action de cette protéine afin de mieux cerner les causes potentielles des ces dysfonctionnements. Il se divise en trois sous parties: - L'étude du l'import potentiel de CHMP2B dans les mitochondries, et de son rôle dans la dynamique mitochondriale. - Le rôle de CHMP2B et l'impact de mutants pathogènes dans la morphogénèse des épines dendritiques. - L'étude de la formation de d'hyper-complexes tubulaires de CHMP2B déformants la membrane plasmique. Nous avons ainsi pu montrer les propriétés suivantes: L'extinction de CHMP2B semble inhiber la fission des mitochondries par un mécanisme qui reste à préciser. L'expression des mutants de CHMP2 liés aux démences fronto-temporales perturbe la morphogénèse des épines dendritiques. Cette altération pourrait participer à l'émergence progressive des symptômes de la FTD. La littérature suggère que les fonctions que CHMP2B concernent des organelles cytoplasmiques (endosomes tardifs, autophagosomes,centrosome). Nous avons montrés que cette protéine est principalement recrutée à la membrane plasmique, où elle se polymérise en une structure tubulaire rigide capable de déformer cette bicouche lipidique.

Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs.

Lors de la dégustation d'un vin, les tannins sont responsables de deux propriétés gustatives, l'amertume et l'astringence, respectivement dues à des associations avec les protéines salivaires et les récepteurs au goût amer. Néanmoins, leurs intensités perçues en bouche vont dépendre de multiples facteurs, notamment la présence de molécules externes aux complexes tannin-protéine tel que les lipides, qu'ils soient situés au niveau des membranes buccales ou issus de l'alimentation. L'objectif de cette thèse a ainsi été d'examiner l'impact des lipides sur ces sensations organoleptiques. Pour ce faire, cette étude, réalisée principalement par RMN, s'est intéressée aux interactions tannin-lipide sur des modèles de membranes buccales et d'émulsions de gouttelettes lipidiques. Nous avons pu alors étudier l'interaction tannin-lipide en termes de localisation, d'affinité et de dynamique. Nos résultats montrent dans un premier temps une localisation du tannin à l'interface de tous les modèles utilisés. En outre, l'insertion de tannins au niveau des vésicules multilamellaires, modèle utilisé pour mimer les membranes buccales, entraîne une fluidification de ce système lipidique. Il a été montré que cet effet fluidifiant dépend de la structure du tannin, de la présence d'éthanol et de la teneur en cholestérol du système lipidique. Enfin, un protocole permettant d'obtenir les constantes d'associations tannin-lipide par RMN a été établi. Ces dernières se sont révélées du même ordre de grandeur que celles relatives aux interactions tannin-protéine salivaire. Ces résultats montrent que les lipides auraient une influence d'une part sur l'astringence via une compétition entre les interactions tannin-lipide et les interactions tannin-protéines salivaires et d'autre part sur l'amertume en perturbant la dynamique de la membrane, ce qui pourrait induire une perturbation des récepteurs gustatifs.

L'objectif principal de ce projet de thèse était d'obtenir de nouvelles données structurales sur les transporteurs ADP/ATP mitochondriaux et de développer des outils pour les approches de micro- et nano-cristallographie appliquées à la biologie structurale des protéines membranaires.Le rôle principal du transporteur ADP/ATP (AAC) est d'importer et d'exporter respectivement de l’ADP3- et l’ATP4- à travers la membrane mitochondriale interne, entre l'espace intermembranaire et la matrice. AAC est le transporteur mitochondrial le mieux caractérisé de toute cette famille de protéines. De nombreuses études ont été menées pour caractériser sa fonction et sa structure. Toutefois, les données structurales n’étant disponibles que pour une conformation de la protéine, de nombreuses questions fondamentales notamment sur les différents états conformationnels adoptés par la protéine au cours du processus de transport restent encore posées. Dans cette thèse, nous avons étudié les 4 isoformes humaines d’AAC. Elles sont impliquées dans diverses maladies génétiques, mais jouent également un rôle dans la cancérogenèse. Cette thèse décrit ainsi en détail la caractérisation structurale et fonctionnelle de ces protéines et leur comparaison. C’est est une étape essentielle pour définir leurs propriétés, et constitue un point de départ précieux dans le développement de nouvelles thérapies.Le domaine de la biologie structurale ne cesse de connaître de nouveaux développements, comme c’est le cas par exemple avec l’avènement de la cristallographie sérielle. Il y a donc un besoin constant de nouvelles approches notamment pour la préparation des échantillons, leur montage sur les lignes de lumière et les collectes de données afin de continuer à améliorer la qualité des données collectées au synchrotron. Ainsi, notre objectif était d'utiliser différents échantillons de protéines membranaires pour développer de nouvelles techniques de cristallisation et de montage d’échantillons sur les lignes de lumière afin de préserver au mieux la qualité des échantillons tout en permettant des collectes de données plus rapides, plus efficaces et plus simples. / The main objective of this PhD project was to gain new structural data on the mitochondrial ADP/ATP carriers and develop tools for micro- and nano-crystallography approaches applied to membrane protein structural biology.The main role of the ADP/ATP carrier (AAC) is to import and export ADP3- and ATP4- respectively between the intermembrane space and the matrix through the inner mitochondrial membrane. AAC is the best characterized among all mitochondrial carriers. Much has been done to investigate its function and structure. However, since structural data are only available for one conformation of the protein some fundamental questions about the different conformational states adopted during the transport process still need to be answered.In this thesis we considered 4 human AAC homologs as a main target. They are involved in different genetic diseases but play also a role in cancerogenesis. This thesis describes and compares in detail the functional and structural characterization of the human AAC isoforms. It was an essential step to give insight into their native properties and is a precious starting point for the drug development field.Since the structural biology field is rapidly developing especially in serial crystallography techniques, there are more and more new applications for samples preparation, mounting and measurements in order to improve the quality of the data collected at the synchrotrons. Hence, our second objective was to use different membrane protein samples to develop new crystal-friendly crystallization set up combined with different sample environment on the beamline toward faster, more efficient and simpler data collection.

L’utilisation de détergents est inévitable pour les études structurales des protéines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des détergents les plus utilisés pour ce type d’études employant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. L’effet des détergents sur la structure et la dynamique des macromolécules est une problématique importante, mais peu étudiée à ce jour. Dans cette étude nous avons caractérisé la dynamique à l’échelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des propriétés structurales de trois protéines membranaires différentes solubilisées dans des micelles de DPC. Ces protéines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les séquences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons détecté de la dynamique à l’échelle de la milliseconde qui est distribuée d’une manière asymétrique à travers la structure. En contradiction avec des propos de la littérature, nous montrons que cette dynamique n’est pas corrélée à la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiée par des mutations qui inhibent le transport effectué par ces protéines quand elles sont reconstituées dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur spécificité par rapport aux substrats, n’est pas conservée quand ces transporteurs sont reconstitués dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalité dans ce détergent. La RMN a aussi permis de démontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbées dans les micelles avec quelques hélices transmembranaires apparaissant exposées au solvant. Nous avons donc conclu que la présence du détergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre étude et probablement d’autres protéines similaires, en les rendant très flexible. Nos résultats indiquent un probable effet général de ce détergent sur les protéines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse détaillée de quelques études de protéines membranaires décrites dans la littérature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adressé une question fondamentale de la dynamique des protéines: comment se comportent les protéines dans des cristaux ? Nous avons étudié la dynamique de l’ubiquitine cristalline à l’échelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employé la RMN à l’état solide et des simulations de dynamique moléculaire de la protéine dans différents réseaux cristallins distincts. Il est intéressant à noter que dans ces cristaux on détecte toujours des processus locaux d’échange dynamique sur une échelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les résultats obtenus avec différentes formes cristallines, nous constatons que les paramètres thermodynamiques des différents états en échange et les vitesses d’interconversion entre ces dernières sont significativement modifiés par les contacts cristallins. De plus, nous avons détecté des mouvements globaux de type «rocking» des ces molécules à l’état cristallin qui surviennent également à l’échelle de la milliseconde. Ceci suggère que les mouvements globaux et locaux sont corrélés. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualité et l’interprétation des données des expériences de diffraction des rayons-X. / The use of detergents is often unavoidable in the structural studies of membrane proteins. Dodecylphosphocholine (DPC) is one of the most commonly used detergents for such studies in solution state NMR spectroscopy. The effect of detergent on structure and dynamics remains an important and poorly understood question. In this study we have investigated millisecond dynamics, substrate binding and structural features of three different yeast proteins from mitochondrial carrier family (GGC1, ORC1 and AAC3) in DPC micelles. We have detected millisecond dynamics, which are asymmetrically distributed across the structure. Contrary to previous claims, we show that these dynamics are unrelated to function, as they are not affected by the substitutions which abolish mitochondrial carrier transport in proteoliposomes. Furthermore, we could show that the very well-defined substrate specificity of these proteins in membranes is abolished when they are reconstituted in DPC, questioning their functionality. Structural investigations have revealed that both tertiary and secondary structures of these carriers are perturbed in DPC micelles, with some TM helices showing substantial solvent exposure. We have concluded from these observations that DPC detergent strongly perturbs these, and likely other mitochondrial carriers by rendering them very flexible. Our findings point to a possibly general effect of this detergent on membrane proteins, as we discuss with examples of previously studied membrane proteins. In the second part we have addressed a fundamental question of protein dynamics: how do proteins move inside crystals? We have investigated ms dynamics in a crystalline ubiquitin to gain the insight on the impact of the crystalline lattice on such motions, using solid-state NMR and ms long MD simulations of explicit crystal arrangements. Interestingly a local dynamic exchange process on a ms time scale is still present in crystals. However, by comparing different crystal forms we establish that the thermodynamics of the exchanging states and their interconversion rate constants are significantly altered by the crystal contacts. Furthermore, we detect overall "rocking" motion of molecules in the crystal, occurring on a tens-of-ms time scale, and provide evidence that overall and local motion are coupled. We discuss the implications of ms dynamics on the data quality in X-ray diffraction experiments.

L'objectif de ces travaux vise à évaluer les performances d'un contacteur membranaire à fibres creuses utilisé pour réaliser l'absorption chimique du CO2 dans une solution ammoniacale ainsi que la régénération de cette dernière. Les membranes utilisées sont composites, c'est-à-dire composées d'une fine couche dense recouverte sur un support microporeux, la couche dense permettant d'éviter le mouillage par pénétration de liquide dans la membrane. Pour réaliser ces études, une approche combinant expérimentation et modélisation a été adoptée. Lors de la réalisation de l'absorption chimique avec un contacteur membranaire, des chutes importantes d’efficacité de captage du CO2 au cours du temps ont été observées et confirment les résultats obtenus lors de travaux ultérieurs. Cette baisse des performances est attribuée à la précipitation de sels d’ammonium en phase gaz. Lors de l'utilisation d’un gaz saturé en vapeur d'eau, comme le seraient les fumées industrielles, les performances du procédé se sont révélées stables. Un modèle 1D multi-composant adiabatique du contacteur a été développé sur Aspen Custom Modeler® et validé à partir des résultats expérimentaux. Les simulations réalisées avec ce modèle ont confirmé le potentiel d'intensification volumique de la technologie, toutefois, la réduction des pertes de NH3, grâce à l'utilisation d’une couche dense sélective moins perméable à NH3 qu’au CO2, n’a pas été satisfaisante. Les phénomènes de condensation dans les contacteurs membranaires ont été étudiés par expérimentation et modélisation. Il a ainsi été montré que le mouillage par condensation de la membrane ne devrait pas survenir, par contre, la condensation dans le lumen des fibres creuses entraîne une augmentation importante de la perte de charge pouvant conduire à des coûts de compression des gaz à traiter plus élevés. Des expériences et des simulations sur la régénération de solutions ammoniacales chargées avec des contacteurs membranaires ont été effectuées et des disparités importantes ont été trouvées entre les flux de CO2 mesurés et simulés. Une réduction volumique de trois par rapport à la colonne à garnissage a pu être calculée laissant entrevoir un potentiel intéressant de la technologie pour l’étape de régénération. En collaboration avec les partenaires du projet C2B, dans lequel s’intègre cette thèse, des essais d’absorption de CO2 ont été réalisés sur site avec un contacteur de taille industrielle. Les résultats de ce pilote sont conformes aux résultats obtenus au laboratoire et encourageants quant au transfert de la technologie vers l’échelle industrielle / This work aims to evaluate the performances of hollow fiber membrane contactors used for the CO2 absorption in aqueous ammonia and the regeneration of the latter within the frame of post-combustion CO2 capture. Fibers are made of a thin dense layer coated on a microporous support, the dense layer prevent membrane wetting by liquid penetration. Both experiment and modelling were done. During absorption experiments, important decrease of the CO2 capture efficiency was observed due to ammonium salts precipitation in the gas-side corroborating results from previous works. Experiments with CO2/N2 mixture saturated with water vapor, as would be the case for flue gas, interestingly, showed stable performances of the process. A one-dimensional multi-component adiabatic transfer model for CO2 absorption in NH3 has been implemented in Aspen Custom Modeler® and validated with experimental results. The simulations performed with the model confirmed the volumetric intensification potential of the technology, however, the NH3 slip reduction expected, because of the use of a dense layer more permeable to CO2 than NH3, wasn’t satisfying. Water condensation phenomenon in membrane contactors were studied with both experiments and simulations. It was thus showed that membrane pore wetting by condensation should not happened but gas-side condensation led to an important increase of the pressure drop with the potential of increasing compression costs. Experiments and simulations of the desorption of CO2 from a loaded aqueous ammonia solution with a membrane contactor were performed and important disparities were found between CO2 flux measured and simulated. A volumetric reduction of the membrane contactor when compared to the packed column was calculated highlighting the potential of the technology for the stripping step. In collaboration with the partners of the C2B project, in which this thesis is integrated, CO2 absorption essays were carried out on site with an industrial scale membrane contactor. The results of this pilot are consistent with laboratory results and encourages the transfer of the technology to the industrial scale

La microfiltration tangentielle sur membrane en céramique est étudiée dans ce travail comme une méthode de fractionnement de suspensions hétérogènes obtenues après hydrolyse acide d'amidon de maïs cireux pour la récupération en continu de nanocristaux d'amidon. Le but est d'évaluer la possibilité de coupler la microfiltration au procédé d'hydrolyse pour augmenter le rendement de production des nanocristaux d'amidon. Une caractérisation des suspensions (taille et charge) a été réalisée à différents stades de la production afin de comprendre l'évolution de la taille des particules au cours de l'hydrolyse et du post-traitement et de pouvoir choisir la bonne membrane pour un fractionnement efficace. Deux pilotes de filtration ont été conçus pour permettre l'étude du fractionnement des suspensions de nanocristaux d'une part à l'échelle laboratoire (membranes planes) et d'autre part à l'échelle semi-industrielle (membrane tubulaire). L'analyse de la suspension produite par le procédé d'hydrolyse classique a montré qu'elle était constituée majoritairement d'agrégats de nanoparticules et de résidu d'amidon partiellement hydrolysé, la quantité de nanocristaux individualisés ne représentant que 5 % de l'amidon initial. L'opération de microfiltration tangentielle a été optimisée (transmission maximale des SNC et colmatage minimum des membranes) en fonction des conditions opératoires grâce à la réalisation d'un plan d'expériences. Dans les conditions optimisées, il était possible de récupérer dans le perméat, 25 % des particules initialement introduites en gardant des flux de perméat important. Ces particules ont une taille inférieure à 300 nm. Dans ces mêmes conditions, il était possible de séparer des nanocristaux d'amidon directement à partir de la suspension acide après hydrolyse. La modélisation du colmatage à partir des essais de filtration frontale a montré que le colmatage se fait essentiellement par formation d'un gâteau à la surface. Nous avons abordé également dans ce travail la piste de la purification en continu des suspensions acides à travers un procédé de diafiltration sur membranes d'ultrafiltration permettant une industrialisation de la production des SNC. / The current work investigates the use of cross flow microfiltration using ceramic membrane to fractionate the heterogeneous suspension obtained after starch hydrolysis in order to isolate starch nanocrystals. The final aim is to evaluate the possibility of coupling the filtration step to the hydrolysis step in a single production loop in order to enhance the starch nanocrystal production yield. The characterizations of the suspension (particle size and charge) obtained with the classic production process indicates that it was a mixture of starch nanocrystal aggregates and starch residues, individualized starch nanocrystals represent only 5 % of the initial starch. The fractionation study was done using two pilot plans, in a dead end configuration at laboratory scale (plate membrane) and in a cross flow configuration at semi-industrial scale (tubular membrane). Design of experiments methodology was used to optimize the fractionation efficiency when filtering a neutral suspension considering the effect of filtration parameter on the transmission yield and membrane fouling. In the optimized condition, it was possible to recover 25 % of starch nanocrystals while keeping the permeate flux at its highest value. Mean diameter of the recovered particle was less than 300 nm. At this condition, it was also possible to recover the starch nanocrystals directly from the acidic mixture obtained at the end of the hydrolysis step. The analysis of fouling mechanism using dead end filtration experiments highlights that membrane fouling occurs because a cake bult up at the membrane surface. This study investigates also the use of ceramic ultrafiltration membrane in a diafiltration process in order to purify the acidic suspension from soluble molecules without modifying particle size distribution which is a promising technique for a large scale production.

CHMP2B est une sous-unité du complexe ESCRT-III, un complexe cytosolique très conservé, responsable du remodelage des membranes biologique, dans divers processus cellulaires. Des mutations de CHMP2B sont associées à une forme familiale de démence frontotemporale. Une étude précédente a mis en évidence que les mutants pathogènes de CHMP2B altèrent la morphologie des épines dendritiques, un phénomène potentiellement à l'origine de la maladie. Ce travail de recherche a pour objectif de décrire le rôle de CHMP2B, et du complexe ESCRT-III, dans la structure et le fonctionnement des épines dendritiques. Dans des lignées cellulaires, nous avons démontré que CHMP2B a la propriété de s'associer préférentiellement à la membrane plasmique, de se polymériser en filaments hélicoïdaux et de former de longs et fins tubes membranaires. Ce résultat indique que CHMP2B est directement impliqué dans le remodelage de la membrane plasmique. Dans les neurones, CHMP2B se concentre dans des régions sous-membranaires proches de la PSD. Une analyse biochimique a montré que CHMP2B et CHMP4B sont associées à d'autres sous-unités, pour former un complexe ESCRT-III postsynaptique particulièrement stable. Nous avons identifié par spectrométrie de masse que ce complexe interagit également avec des protéines d'échafaudage postsynaptiques et des protéines de remodelage du cytosquelette d'actine. La déplétion de CHMP2B par RNAi, dans des neurones en culture, affecte la complexité de l'arborisation dendritique, la morphologie des épines dendritiques et empêche le gonflement des épines associé à la LTP. Des expériences de récupération, avec des mutants pontuels, indiquent que le rôle de CHMP2B dans le maintien de l'arborisation dendritique est dépendant à la fois de de son association avec ESCRT-III et la bicouche phospholipidique. Nous proposons une nouvelle fonctionnalité pour un complexe ESCRT-III contenant CHMP2B, dans les processus de remodelage de la membrane postsynaptique associés à la maturation et à la plasticité des épines dendritiques. / CHMP2B is a subunit of ESCRT-III, a highly conserved cytosolic protein machinery, responsible for membrane remodeling in diverse cellular mechanisms. Mutations in CHMP2B are responsible for a familial form of frontotemporal dementia. A previous study highlighted that FTD-related mutants of CHMP2B impair the morphological maturation of dendritic spines, a process that may underlie neurodegeneration in this disease. The goal of this research work id directed towards understanding the role of CHMP2B and ESCRT-III in dendritic spines structure and function. In cell lines, we demonstrated that CHMP2B associates preferentially with the plasma membrane, polymerizes in helical filaments and forms long and thin membrane protrusions. This result indicates that CHMP2B is directly involved in plasma membrane remodeling. In neurons, CHMP2B concentrates in specific sub-membrane microdomains close to the PSD. Biochemical analysis revealed that CHMP2B and CHMP4B associate with other subunits to form a remarkably stable postsynaptic ESCRT-III complex. Mass-spectrometry indicated that this complex also interacts with postsynaptic scaffolds and proteins involved in actin cytoskeleton remodelling. RNAi depletion of CHMP2B, in cultured neurons, alters stability of dendrite branching and morphology of dendritic spines, and impairs spine head growth, normally associated with LTP. Rescue experiments, with point mutants, indicated that CHMP2B activity in dendrite branching is dependent on its capacity to both bind phospholipids and oligomerization with ESCRT-III. We propose a novel functionality for an ESCRT-III complex containing CHMP2B, in maturation-dependent and plasticity-dependent processes of dendritic spine morphogenesis.