Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Les dystrophies musculaires sont un groupe de pathologies génétiques qui cause une faiblesse et une perte progressive des muscles squelettiques. Parmi elles, la dystrophie des ceintures de type 2B (LGMD2B) est caractérisée par des mutations dans le gène de la dysferline, entrainant de sévères dysfonctionnements, dont un défaut de réparation membranaire. Les ruptures de la membrane plasmique sont des évènements physiologiques induits par des contraintes mécaniques, comme lors de la contraction des fibres musculaires. Les cellules eucaryotes possèdent donc une machinerie protéique assurant une réparation rapide de larges ruptures membranaires. La liste exhaustive des composants de la machinerie de réparation et leur mode d’action reste à établir.Les annexines (Anx) sont de petites protéines solubles, au nombre de 12 chez les mammifères, qui partagent la propriété de lier les membranes exposant des phospholipides chargés négativement en présence de Ca2+. De nombreuses études ont montré l’implication de certaines Anx (AnxA1, A2, A4, A5, A6 et A7) dans la réparation membranaire de différents types cellulaires (muscle, cancer, endothélium…) et dans différentes espèces (souris, poisson-zèbre, homme…). La présence des Anx dans le muscle squelettique, et la participation de plusieurs membres de cette famille dans la réparation membranaire, soulèvent la question d’un rôle collectif de ces protéines dans la protection et la réparation des ruptures du sarcolemme.Les objectifs de ce travail ont été 1) d’identifier les Anx impliquées dans la réparation membranaire des cellules musculaires squelettiques humaines, 2) développer une stratégie de microscopie corrélative pour étudier le site de rupture et la distribution subcellulaire des Anx à haute résolution, 3) élucider la fonction des Anx dans le mécanisme de réparation, et 4) analyser les Anx dans des cellules musculaires dystrophiques. Avec des approches en biologie cellulaire et moléculaire, et en microscopie de fluorescence et électronique, nous avons donc étudié le comportement des Anx lors d’un dommage du sarcolemme.Nous avons ainsi montré que les AnxA1, A2, A4, A5 et A6 sont exprimées dans les myoblastes et les myotubes humains, et sont recrutées au site de rupture quelques secondes après le dommage, en formant une structure dense à l’extérieur du myotube endommagé appelé domaine « cap ». De plus, nous avons pu déterminer l’ordre relatif de recrutement des Anx au site membranaire endommagé. Les premières Anx à être recrutées sont l’AnxA1, suivies des AnxA6 et A5, les moins sensibles au Ca2+. Les dernières Anx recrutées sont les plus sensibles au Ca2+, les AnxA4 puis A2, qui semblent se lier à des vésicules intracellulaires initialement éloignées du site de rupture. Nous avons également étudié l’ultrastructure du site de rupture à haute résolution. Nos résultats ont révélé que le domaine « cap » correspondait à une accumulation de matériel membranaire qui est associé au Anx. En s’appuyant sur nos résultats et la littérature, nous avons proposé un modèle de réparation membranaire, impliquant les AnxA1, A2, A4, A5 et A6, dans les cellules musculaires squelettiques humaines. Nous nous sommes également intéressés à l’expression des Anx dans des lignées de cellules musculaires dystrophiques issues de patients atteints de dystrophies musculaires des ceintures de type 2B (déficients en dysferline) et 1C (déficients en cavéoline-3). Nous avons ainsi montré que le contexte pathologique perturbait l’expression de certaines Anx, sans en modifier leur localisation subcellulaire.En conclusion, ce travail de thèse montre que plusieurs membres de la famille des Anx sont impliqués dans la réparation membranaire, et agissent de concert pour réparer un dommage de la membrane plasmique. L’implication des Anx dans d’autres pathologies, comme le cancer et la pré-éclampsie, renforce l’intérêt de leur étude dans les processus de réparation membranaire et en font une cible thérapeutique potentielle. / Muscular dystrophy encompasses a group of genetic disorders which cause progressive weakness and wasting of skeletal muscle. Among them, limb girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) is characterized by mutations in the dysferlin gene leading to several dysfunctions including a failure in cell membrane repair process. Cell membrane disruption is a physiological phenomenon induced by mechanical stress, such as contraction of muscle fibers. Thus, eukaryotic cells have a repair protein machinery ensuring a rapid resealing of large cell membrane ruptures. The exhaustive list of components of the repair machinery and their interplay remain to be established.The annexin (Anx) family consists of twelve soluble proteins in mammals and share the property of binding to membranes exposing negatively charged phospholipids in a Ca2+-dependent manner. Several studies have shown the involvement of Anx (AnxA1, A2, A4, A5, A6 and A7) in membrane repair of different cell types (muscle, cancer, endothelium…) in different species (mouse, zebrafish, human…). The presence of different Anx in skeletal muscle, together with the participation of several members of the Anx family in membrane repair processes, raise the question of a collective role of these proteins in the protection and repair of sarcolemma injuries.The PhD project aimed 1) at identifying Anx that are essential for membrane repair in human skeletal muscle cells, 2) developing a correlative light and electron microscopy to study the wounded site and the Anx distribution at high resolution, 3) elucidating the function of each Anx in this process and 4) analyzing Anx in dystrophic muscle cells. Using approaches including cellular and molecular biology, fluorescence microscopy and transmission electron microscopy, we studied the behavior of Anx during sarcolemma damage.We showed that AnxA1, A2, A4, A5 and A6 are expressed in human myoblasts and myotubes, and are recruited at the disruption site within seconds after the sarcolemmal damage, forming a dense structure outside the cell, named the “cap” domain. Furthermore, we determined the relative order of Anx recruitment at the disruption site. The first Anx recruited are AnxA1, followed by AnxA6 and A5, the less sensitive to Ca2+. The last Anx recruited are the most sensitive to Ca2+, AnxA4 and A2. AnxA2 and A4 are instead rapidly recruited to intracellular vesicles present deeper in the cytosol. We also studied the ultrastructure of the disruption site at high resolution. Our results revealed that the “cap” domain correspond to a disorganized membrane structure, associated with the Anx. Thanks to our results and the literature, we have proposed a model for membrane repair involving Anx in human skeletal muscle cells. We also looked at the expression of Anx in dystrophic muscle cell lines from patients with limb girdle muscular dystrophy type 2B (dysferline deficient) and 1C (deficient in cadaveoline-3). We have thus shown that the pathological context disrupts the expression of some Anx, without altering their subcellular location.In conclusion, this work shows that several members of the Anx family are involved in membrane repair and act together to repair plasma membrane damage. The implication of Anx in other pathologies, such as preeclampsia or cancer, reinforces the interest of their study in the process of membrane repair.

Les ATPases-P4 sont des transporteurs membranaires couplant l'hydrolyse de l'ATP au transport de lipides dans les membranes cellulaires eucaryotes. Avec leurs partenaires, les protéines CDC50, les ATPases-P4 transportent les phospholipides, en particulier la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidyléthanolamine (PE), du feuillet exoplasmique au feuillet cytosolique des membranes, assurant ainsi le maintien de l'asymétrie membranaire.Drs2p est l'une des cinq ATPases-P4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle est localisée dans les membranes du trans-Golgi (TGN), et elle a comme partenaire la protéine Cdc50p, qui est nécessaire à l'adressage correct et probablement au transport catalysé par Drs2p. Drs2p est principalement responsable du transport de la phosphatidylsérine (PS) dans les membranes du TGN et son activité est essentielle pour le maintien de la PS dans le feuillet cytosolique de ces membranes. En raison du rôle crucial de la PS dans de nombreuses voies de signalisation, aussi bien à l’extérieur (au cours de l’apoptose par exemple) qu’à l’intérieur de la cellule (par le recrutement de protéines impliquées dans des processus cellulaires essentiels), il est important de comprendre le mécanisme par lequel l’asymétrie de la PS est établie.Afin de progresser dans la compréhension du mécanisme moléculaire du transport de lipides, nous avons mis au point une procédure qui nous a permis de co-exprimer Drs2p et Cdc50p dans Saccharomyces cerevisiae. La purification de Drs2p par chromatographie d'affinité sur résine streptavidine a permis d'obtenir une fraction purifiée contenant très majoritairement Drs2p et Cdc50p, à raison de 1-2 mg/L de culture. Les deux protéines sont sous forme de complexe avec une stœchiométrie d'association de 1:1. Le complexe purifié est fonctionnel, et présente une activité d’hydrolyse de l’ATP stimulée par son substrat, la PS. Cette stimulation n’est cependant possible qu’en présence de PI4P, un phosphoinositide impliqué dans la régulation du trafic membranaire.De par leur rôle crucial dans le maintien de l'asymétrie membranaire, les ATPases-P4 ne peuvent qu'être régulées. Comme de nombreuses ATPases de type P sont soumises à une auto-régulation de leur activité, nous avons examiné la possibilité d’une telle auto-régulation dans le cas des ATPases P4. Pour ce faire, une approche par mutagenèse dirigée et protéolyse ménagée associée à l’identification par spectrométrie de masse des peptides ont été effectuées. La protéolyse ménagée du complexe purifié Drs2p/Cdc50p montre une activité ATPasique dépendante au PI4P de 30-50 fois plus importante. La protéolyse par la thrombine engendre un Drs2p dépourvu d'une partie N-terminale (R104) et d'une partie C-terminale (R1290) qui reste toujours associé à Cdc50p. Ce résultat montre qu'une coupure appropriée au niveau des extrémités terminales de Drs2p peut augmenter de façon significative, en présence du PI4P, l'activité ATPasique du complexe, nous amenant ainsi à identifier un rôle auto-inhibiteur des extrémités N- et/ou C-terminales de Drs2p.Ce travail ouvre des perspectives quant à la caractérisation structurale et fonctionnelle du mécanisme de transport de lipides par le complexe. Par ailleurs, il laisse entrevoir la possibilité d’étudier les bases moléculaires des pathologies associées aux mutations de certaines ATPases P4 humaines. / Maintenance of phospholipid asymmetry in eukaryotic cell membranes is essential for cellular integrity and function. P4-ATPases, from the P-type ATPases family, are energy-dependent transporters, together with their CDC50 accessory subunits couple ATP hydrolysis to lipid transport from the exoplasmic to cytoplasmic leaflet to maintain membrane asymmetry.Drs2p is one of these P4-ATPases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Drs2p is localised in trans-Golgi (TGN) membranes in association with its binding partner Cdc50p, which contributes to the correct addressing of Drs2p and probably in the catalyzed transport by Drs2p. Drs2p transport principally phosphatidylserine (PS) in TGN membranes. The PS is important for a several signalling pathways, for example, in apoptosis and recruitment of the proteins implied in various essential cellular process, so, it's very important to understand the mechanism that establishes this asymmetry.To gain in comprehension of molecular mechanism of lipid transport, robust protocols for expression and purification are required. In this work, we present a procedure for high-yield co-expression of Drs2p and Cdc50p. The purification of Drs2p and Cdc50p is achieved in a single step by affinity chromatography on streptavidin beads, yielding, 1-2 mg purified Drs2p/Cdc50p per liter of culture. This procedure allows purification of the complex Drs2p/Cdc50p with stoichiometry to 1:1. Our complex is functional, overal ATP hydrolysis by the complex is dependent of PS, favourite substrate of Drs2p. This hydrolyze is critically dependent on the presence of PI4P, a phosphoinositide involved in regulation of membrane trafficking.Like many P-type ATPases auto-regulate their activity, we examined the possibility that P4-ATPases are auto-regulated. In this work, we use directed mutagenesis and limited proteolysis associated with mass spectrometry for identify peptides. We show that limited proteolysis of a purified complex Drs2p/Cdc50p resulted in up to a 30-50 fold increase of it ATPase activity, which however remained dependent on PI4P. Using thrombin as the protease, Cdc50p remained intact and in complex with Drs2p, which was cleaved at two positions, namely after R104 and after R1290. Our results therefore reveal that trimming off appropriate regions of the terminal extensions of Drs2p can increase its ATPase activity in the presence of PI4P by an enormous factor, thereby identifying a role of N and/or C-terminal extensions in auto-inhibition of Drs2p.Our results open perspectives on the structural and the functional characterization of the lipid transport mechanism by the complex Drs2p/Cdc50p. Furthermore, our procedures open up the possibility of studying the molecular bases of the pathologies associated with the mutations of human P4-ATPases.

Les résidus forestiers et agricoles, également appelés résidus lignocellulosiques, constituent de par leur quantité et leur structure un potentiel unique pour la production d’énergie et de molécules d’origine renouvelable, afin de pallier à la raréfaction des hydrocarbures fossiles ainsi qu’aux problèmes environnementaux liés à l’utilisation de ceux-ci. Les biomasses lignocellulosiques sont constituées principalement de cellulose, hémicelluloses et lignines. Le fractionnement et la purification de ces trois constituants est nécessaire à leur valorisation comme produits de substitution des hydrocarbures fossiles. Cette étude s’est tout d’abord attachée à la description et la compréhension des fractionnements chimiques acides et alcalins de la lignocellulose et aux voies de purification qui leur sont actuellement associées. Les travaux expérimentaux ont été réalisés à partir de deux matières premières : la bagasse de canne à sucre et le tourteau de tournesol. Une caractérisation fine de ces matières premières ainsi que des extraits acides et alcalins obtenus à partir de ces matières a été réalisée. Les étapes de purification se sont focalisées sur l’extrait alcalin de bagasse obtenu en conditions douces. En effet, la bagasse de canne à sucre peut être considérée comme un bon modèle de biomasse lignocellulosique, et la purification d’extraits alcalins lignocellulosiques obtenus en conditions douces a été peu étudiée malgré l’intérêt de ce procédé de fractionnement. La filtration membranaire et la chromatographie d'élution sur résine échangeuse de cation ont été évaluées séparément puis en association, afin de séparer les cinq grandes familles de molécules constitutives de l’extrait : des oligomères de lignines, des oligomères de sucres, des monomères phénoliques, de l’acide acétique et des sels inorganiques. Des essais d’ultrafiltration sur plusieurs membranes en faisant varier divers paramètres de filtration ont permis de déterminer que les oligomères de lignine et de sucres, récupérés dans le rétentat, sont séparés des monomères phénoliques, de l’acide acétique et des sels inorganiques, récupérés dans le perméat. Une membrane en fibres creuses de 10 kDa en polysulfone a présenté les meilleures performances de séparation et a été retenue pour les essais suivant en mode concentration et diafiltration. Des essais de chromatographie d'élution avec de l’eau pour éluant en testant plusieurs résines cationiques fortement acides ont montré qu’une fraction très pure d’oligomères de lignines et de sucres peut être obtenue avec une résine de type macroporeuse, alors qu’une résine de type gel a permis la séparation de monomères phénoliques entre eux en fonction de la présence ou non dans leur structure d’une fonction carboxyle. A partir d’extrait alcalin de bagasse, un procédé intégré de purification a été développé combinant de la filtration membranaire puis de la chromatographie sur le perméat et de la précipitation par ajout d’acide sur le rétentat. Il en a résulté l'obtention de quatre fractions purifiées : les monomères phénoliques avec fonction carboxyle, les sels inorganiques et les monomères phénoliques sans fonction carboxyle, les oligomères de lignine, et les oligomères de sucres. / Agricultural and forestry residues, also known as lignocellulosic residues, have a unique potential based on their quantity and structure for the production of renewable energy and molecules, inorder to solve the issues raised by the increasing scarcity of fossil hydrocarbons and the environmental disorder caused by their use. Lignocellulosic biomasses are essentially made ofcellulose, hemicelluloses and lignin. Fractionation and purification of these three compounds are necessary for their valorization as substitutes of fossil hydrocarbons. In the first place, this studydescribed the chemical fractionation of lignocellulose under acidic and alkaline conditions, and their related purification pathways. The experimental work was carried out on two raw materials:sugarcane bagasse and sunflower oil cake. A thorough characterization of the raw materials as well as the acid and alkaline extracts produced from these materials was performed. The purification steps focused on the sugarcane bagasse mild alkaline extract. Indeed, sugarcane bagasse can be considered a model lignocellulosic biomass and the purification of lignocellulosicmild alkaline extract has not been widely studied despite the numerous assets of this fractionation process. Membrane filtration and elution chromatography on strong acid cationic exchange resins were assessed individually then combined, for the separation of the five main pools of molecules that constitute the extract: lignin oligomers, sugar oligomers, phenolic monomers, acetic acid and inorganic salts. Ultrafiltration trials run on several membranes under various filtration conditions showed that lignin and sugar oligomers, recovered in the retentate, were separated from phenolicmonomers, acetic acid and inorganic salts, recovered in the permeate. A hollow fiber membrane of 10 kDa in polysulfone exhibited the best separation performance and was selected for further trials in concentration and diafiltration modes. Elution chromatography tests using water as eluent and various strong acid cationic exchange resins resulted in the production of a very pure lignin andsugar oligomers fraction with a macroporous-type resin, whereas a gel-type resin led to the separation of phenolic monomers from each other depending on the presence or absence in their structure of a carboxyl group. From a sugarcane bagasse mild alkaline extract, an integrated purification process was developed combining membrane filtration then chromatography on the permeate and precipitation by acid addition on the retentate. It resulted in the production of four purified fractions: phenolic monomers with a carboxyl group, inorganic salts and phenolicmonomers without carboxyl group, lignin oligomers, and sugar oligomers

La régulation de l’expression génique par des ARNs permet une réponse rapide et polyvalente des cellules à des changements environnementaux. Cependant, elle nécessite souvent des partenaires protéiques. La protéine bactérienne Hfq en est un bon exemple. Facteur de virulence, elle est présente chez une variété de procaryotes et intervient dans nombre de circuits de régulation. Structurellement, Hfq adopte un repliement caractéristique, le repliement Sm. Ainsi, Les feuillets β qui la constituent se regroupent et forment un hexamère toroïdal. Outre cette région N-terminale, il existe aussi parfois une région C-terminale (CTR) de séquence et de longueur variables. Chez E. coli, cette région comprend une trentaine de résidus et est prédite comme non-structurée. Jusqu’à présent, son rôle n’a été que peu étudié.Ce travail de thèse met en lumière de nouvelles pistes quant à la fonction du CTR. Nous avons constaté sa capacité à former des fibres amyloïdes, expliquant la formation de structures auto-assemblées in vivo. De plus, la protéine est capable de lier l’ADN et de le condenser fortement in vitro. Cette compaction est complètement dépendante de la présence du CTR, qui permet de ponter les brins d’ADN. Ce résultat suggère une nouvelle fonction de Hfq dans la structuration du chromosome. Enfin, nous avons démontré que ce domaine permet aussi à Hfq de s’assembler à la surface d’une bicouche lipidique, expliquant sa localisation membranaire. La désorganisation de la membrane qui en résulte pourrait permettre le passage d’ARNs dans le milieu extracellulaire, avec d’importantes implications sur la capacité de la bactérie à interagir avec ses voisines et son environnement. / RNA-based regulations of gene expression allow quick and versatile responses from cells to changing environmental conditions. However, these regulations are often protein-mediated. The bacterial protein Hfq is one of the most studied RNA-based regulation partner. Found in various prokaryotes, it is an important virulence factor involved in many cellular processes. Hfq’s structure resembles a torus, formed by multiple β-sheets. Apart from this N-terminal region (NTR), a supplemental C-terminal region (CTR) with variable lengths and sequences may exist in some species. In E. coli, this specific region measures around 30 residues and is predicted as intrinsically disordered. Few studies focused on Hfq-CTR until recently.This work highlights new potential roles for Hfq-CTR. First, this region is able to self-interact and forms amyloid fibers which explains the self-assembled Hfq superstructures observed in vivo. Second, the protein can bind and efficiently condense DNA in vitro, strengthening the suggested role of Hfq in shaping the bacterial chromosome. This compaction is fully dependent on the CTR which is responsible for DNA bridging. Third, the CTR also gives to Hfq the ability to self-assemble on a lipid bilayer, explaining its membrane-localized fraction observed in vivo. The subsequent membrane reorganization might facilitate the release of RNAs in the extracellular medium, with potential implications on bacterial communication and interaction with surrounding cells and environment.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cette thèse porte sur les membranes biologiques, étudiées du point de vue de la physique théorique. Nous nous intéressons aux effets génériques de la présence d'une ou deux inclusions membranaires, par exemple des protéines, et à ceux d'une modification chimique locale de l'environnement de la membrane.<br /> Tout d'abord, nous étudions une interaction entre deux inclusions membranaires, qui est analogue à la force de Casimir : elle provient des contraintes que les inclusions imposent aux fluctuations thermiques de la forme de la membrane. Nous calculons les fluctuations de cette force entre deux inclusions ponctuelles. Nous clarifions la définition de la force exercée par un fluide corrélé sur une inclusion, dans un micro-état du fluide. Cette définition joue un rôle clé dans l'étude de la force de Casimir au-delà de sa valeur moyenne à l'équilibre. Nous étudions également les interactions de Casimir entre des inclusions membranaires de forme allongée.<br /> Ensuite, nous nous intéressons à l'élasticité membranaire à l'échelle nanométrique, qui est mise en jeu dans les déformations locales de l'épaisseur de la membrane à proximité de certaines protéines. Nous soulignons l'importance d'un terme énergétique qui a été négligé jusqu'à présent.<br /> Enfin, nous présentons une description théorique, développée à partir de principes fondamentaux, de la dynamique d'une membrane soumise à une perturbation chimique locale de son environnement. Nous comparons nos prévisions théoriques à de nouveaux résultats expérimentaux portant sur la déformation dynamique d'une membrane biomimétique soumise à une augmentation locale de pH.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les fonctions vasculaires sont régulées par diverses stimulations biochimiques ou mécaniques qui activent les différentes cellules composant les vaisseaux sanguins.Les réponses cellulaires qui en résultent peuvent impliquer une réorganisation du cytosquelette, des changements morphologiques, l'expression de protéines membranaires ou la libération de nombreux médiateurs. Tous ces événements sont susceptibles d'influencer les propriétés mécaniques des cellules. Ainsi, le but de la présente étude est de déterminer l'impact de l'activation de certains récepteurs au niveau des propriétés mécaniques des cellules, des modifications qui pourraient avoir de fortes implications au niveau vasculaire. Pour ce faire, nous avons utilisé deux approches expérimentales permettant d'évaluer des changements morphologiques et mécaniques de très faible amplitude : la microscopie à force atomique (AFM) et la résonance des plasmons de surface (SPR). Nous avons ainsi étudié les effets de l'activation des récepteurs de l'angiotensine II, la thrombine et la bradykinine sur la morphologie et les propriétés mécaniques de modèles cellulaires importants dans l'étude des fonctions vasculaires. Nous avons observé que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 1] pour l'angiotensine II induit une réponse mécanique transitoire qui se traduit par une contraction du corps cellulaire, une augmentation du module d'élasticité de la cellule et une diminution de l'intégrité de l'épithélium. Quant à l'activation du récepteur PAR-1 pour la thrombine et du récepteur B[indice inférieur 2] pour la bradykinine, celle-ci provoque aussi une modification de la rigidité des cellules, mais de façon soutenue dans le temps. Ces deux agonistes augmentent aussi l'interaction entre la membrane et le cytosquelette, un phénomène observé par l'augmentation des forces requises pour l'étirement de la membrane cellulaire. Ainsi, la présente étude montre qu'une cellule peut subir des modifications importantes au niveau de ses propriétés mécaniques suivant son activation par différents agonistes, ce qui peut avoir des conséquences directes sur certaines fonctions physiologiques dépendantes des propriétés mécaniques des vaisseaux. En effet, ces changements observés au niveau de la cellule pourraient, entre autres, contribuer au contrôle du diamètre et de la compliance des capillaires, à l'adhésion des cellules inflammatoires ainsi que modifier la perception de stimuli mécaniques par les cellules endothéliales.

La glycosylation des protéines est une modification co/post-traductionnelle, localiséeprincipalement dans l’appareil de golgi, impliquée dans divers processus physiologiques. Àl’inverse de la synthèse des protéines et des nucléotides, celle des sucres est plus complexe,en partie, à cause des nombreux branchements structuraux et de la diversité stéréochimiquedes glycannes. Les glycosyltransférases sont les enzymes responsables de la biosynthèse desoligo- et polysaccharides. Cependant, il existe différents procédés permettant de réaliser lasynthèse in vitro d’oligosaccharides tels que des procédés chimiques, enzymatiques ouchimio-enzymatiques. La Core 2 β(1,6)-N-acétylglucosaminyltransférase I (C2GnT-I) est uneglycosyltransférase (GT) transmembranaire de type II qui crée une liaison β1,6 entre une Nacétylglucosamine(GlcNAc) et la N-acétylgalactosamine (GalNAc) d’un noyau Core 1,formant ainsi une structure branchée de type Core 2. Une fois le branchement Core 2 initié,au moins trois réactions successives de transfert peuvent avoir lieu, impliquant les β(1,4)-galactosyltransférases, les α(2,3)-sialyltransférases et les α(1,3)-fucosyltransférases. Il estadmis que les GTs sont réparties séquentiellement dans les compartiments cis, médian ettrans de l’appareil de Golgi selon leur ordre d’intervention et le type cellulaire. Nous avonsmis au point un procédé de reconstitution membranaire, comportant des glycoprotéinesgolgiennes, dont les GTs, par l’intermédiaire d’une lectine, la wheat germ agglutinin (WGA).Il est admis que la WGA interagit avec les composants de la membrane plasmique et ceux del’appareil de Golgi. L’étude de notre système membranaire reconstitué a mis en évidence uneactivité élevée de la C2GnT-1 in vitro, et son efficacité à synthétiser des oligosaccharidesbranchés Core 2, par glycosylation séquentielle. / Protein glycosylation is a co/posttranslational modification, localized in the Golgi apparatus,involved in various physiological processes. Sugar synthesis is more complex than that ofproteins and nucleic acids, in part because of the glycosidic bond and glycan stereochemistrydiversity. Glycosyltransferases are enzymes responsible of oligo- and polysaccharidesbiosynthesis. Various methods are used for the synthesis of oligosaccharides, in vitro, suchas chemical, enzymatic or chemo-enzymatic. Core 2 β(1,6)-N-acetylglucosaminyltransferase I(C2GnT-I) is a type-II transmembrane glycosyltransferase (GT). This enzyme create a β1,6bond between N-acetylglucosamine (GlcNAc) and Core 1 N-acetylgalactosamine (GalNAc),forming a Core 2 branched structure. Once the Core 2 branch is initiated, at least threesuccessive transfer reactions can take place, involving β(1,4)-galactosyltransferases, α(2,3)-sialyltransferases and α(1,3)-fucosyltransferases. It is known that GT are distributedsequentially in the cis, medial and trans Golgi apparatus in order of intervention andaccording to cell type. We have developed a membrane reconstitution process comprisinggolgi glycoproteins, including GT, by the use of a lectin, the wheat germ agglutinin (WGA). Itis known that WGA interacts with plasma membrane and Golgi apparatus components. Ourreconstituted membrane system showed a high C2GnT-1 activity in vitro and its effectivenessin synthesizing Core2 branched oligosaccharides by sequential glycosylation.