From its first use in the field of biochemistry, instrumental analysis offered a variety of invaluable tools for the comprehensive description of biological systems. Multi-selective methods that aim to cover as many endogenous compounds as possible in biological samples use different analytical platforms and include methods like gene expression profile and metabolite profile analysis. The enormous amount of data generated in application of profiling methods needs to be evaluated in a manner appropriate to the question under investigation. The new field of system biology rises to the challenge to develop strategies for collecting, processing, interpreting, and archiving this vast amount of data; to make those data available in form of databases, tools, models, and networks to the scientific community.<br><br> On the background of this development a multi-selective method for the determination of phytohormones was developed and optimised, complementing the profile analyses which are already in use (Chapter I). The general feasibility of a simultaneous analysis of plant metabolites and phytohormones in one sample set-up was tested by studies on the analytical robustness of the metabolite profiling protocol. The recovery of plant metabolites proved to be satisfactory robust against variations in the extraction protocol by using common extraction procedures for phytohormones; a joint extraction of metabolites and hormones from plant tissue seems practicable (Chapter II).<br><br> Quantification of compounds within the context of profiling methods requires particular scrutiny (Chapter II). In Chapter III, the potential of stable-isotope in vivo labelling as normalisation strategy for profiling data acquired with mass spectrometry is discussed. First promising results were obtained for a reproducible quantification by stable-isotope in vivo labelling, which was applied in metabolomic studies.<br><br> In-parallel application of metabolite and phytohormone analysis to seedlings of the model plant Arabidopsis thaliana exposed to sulfate limitation was used to investigate the relationship between the endogenous concentration of signal elements and the ‘metabolic phenotype’ of a plant. An automated evaluation strategy was developed to process data of compounds with diverse physiological nature, such as signal elements, genes and metabolites – all which act in vivo in a conditional, time-resolved manner (Chapter IV). Final data analysis focussed on conditionality of signal-metabolome interactions. / Die instrumentelle Analytik stellt mit ihrem unschätzbaren Methodenreichtum Analysenwerkzeuge zur Verfügung, die seit ihrem Einzug in die Biologie die Aufzeichnung immer komplexerer ‚Momentaufnahmen’ von biologischen Systemen ermöglichen. Konkret hervorzuheben sind dabei vor allem die sogenannten ‚Profilmethoden’. Die Anwendung von Profilmethoden zielt darauf ab, aus einer bestimmten Stoffklasse so viele zugehörige Komponenten wie nur möglich gleichzeitig zu erfassen. <br><br> Für die Auswertung derart komplexer Daten müssen nun auch entsprechende Auswertungsmethoden bereit gestellt werden. Das neu entstandene Fachgebiet der Systembiologie erarbeitet deshalb Strategien zum Sammeln, Auswerten und Archivieren komplexer Daten, um dieses gesammelte Wissen in Form von Datenbanken, Modellen und Netzwerken der allgemeinen Nutzung zugänglich zu machen.<br><br> Vor diesem Hintergrund wurde den vorhandenen Profilanalysen eine Methode zur Erfassung von Pflanzenhormonen hinzugefügt. Verschiedene Experimente bestätigten die Möglichkeit zur Kopplung von Pflanzenhormon- und Pflanzeninhaltsstoff(=metabolit)-Profilanalyse. In weiteren Untersuchungen wurde das Potential einer innovativen Standardisierungstechnologie für die mengenmässige Erfassung von Pflanzeninhaltsstoffen in biologischen Proben betrachtet (in vivo labelling mit stabilen Isotopen).<br><br> Hormon- und Metabolitprofilanalyse wurden dann parallel angewandt, um Wechselwirkungen zwischen der Konzentration von Signalkomponenten und der Ausprägung des Stoffwechsels in Keimlingen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu untersuchen. Es wurde eine Prozessierungsmethode entwickelt, die es auf einfache Art und Weise erlaubt, Daten oder Komponenten verschiedenen Ursprungs wie Signalelemente, Gene und Metabolite, die in biologischen Systemen zeitlich versetzt aktiv oder verändert erscheinen, im Zusammenhang zu betrachten. Die abschließende Analyse aller Daten richtet sich auf die Abschätzung der Bedingtheit von Signal-Metabolismus Interaktionen.

Background Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed malignant disease among adult males in the USA and the second leading cause of cancer deaths in men. Due to the lack of diagnostic tools that are able to differentiate highly malignant and aggressive cases from indolent tumors, overtreatment has become very common in the era of prostate specific antigen (PSA) screening. New diagnostic methods to determine biological status, malignancy, aggressiveness and extent of PCa are urgently needed. 1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H HRMAS MRS) can be used to establish PCa metabolomic profiles while preserving tissue architecture for subsequent histopathological analysis. Immunohistochemistry (IHC), as opposed to conventional histopathology methods, has the potential to provide objective, more accurate and quantitative knowledge of tissue pathology. This diagnostic- accuracy study sought to evaluate a novel approach to quantitatively identify metabolomic markers of PCa by exploring the potential of PCa immunomarkers to quantify metabolomic profiles established by 1H HRMAS MRS. Material and Methods 1H HRMAS MRS was performed on tissue samples of 51 prostate cancer patients using a 14.1 Tesla NMR spectrometer (BRUKER Biospin, Billerica, MA) with a rotor synchronized CPMG pulse sequence. Spectral intensities of 36 regions of interest were measured as integrals of curve fittings with Lorentzian-Gaussian line shapes. Immunohistochemistry (IHC) was carried out following the spectroscopy scan, using three prostate immunomarkers to identify cancerous and benign glands: P504S (Alpha-methylacyl-CoA-racemace), CK903 (high-molecular weight cytokeratin) and p63. The immunostaining quality following 1H HRMAS MRS was evaluated and compared to unscanned sections of the same sample, to verify the stability and accessibility of the proposed immunomarkers. IHC images were automatically and quantitatively evaluated, using a quantitative image analysis program (QIAP), to determine the percentage of cancerous and benign epithelia in the tissue cross- sections. The results of the program were validated by a correlation with the results of a quantitative IHC review and quantitative conventional histopathology analysis performed by an experienced pathologist. Ultimately, spectral intensities and the cancer epithelium percentage, obtained from quantitative immunohistochemistry, were correlated in order to validate PCa metabolomic markers identified by 1H HRMAS MRS. Patient outcomes and incidence of recurrence were determined by retrospective review of medical records five years after initial surgery. Categories of recurrence were correlated to spectral intensities to explore potential metabolomic markers of recurrence in the cohort. Results Immunostainings with P504S and CK903 showed excellent staining quality and accessibility following 1H HRMAS MRS, suggesting these markers to be suitable for the presented quantitative approach to determine metabolomics profiles of PCa. In contrast, the quality of p63 IHC was impaired after previously performed spectroscopy. IHC using the immunomarkers P504S and CK903 on adjacent slides was found to present a feasible quantitative diagnostic method to distinguish between benign and cancerous conditions in prostate tissue. The cancer epithelium percentage as determined by QIAP showed a significant correlation to the results of quantitative IHC analysis performed by a pathologist (p < 0.001), as well as to a quantitative conventional histopathology review (p = 0.001). The same was true for the benign epithelium percentage (p < 0.001 and p = 0.0183), validating the presented approach. Two metabolomic regions showed a significant correlation between relative spectral intensities and the cancer epithelium percentage as determined by QIAP: 3.22 ppm (p = 0.015) and 2.68 ppm (p = 0.0144). The metabolites corresponding to these regions, phosphocholine and citrate, could be identified as metabolomic markers of PCa in the present cohort. 45 patients were followed for more than 12 months. Of these, 97.8% were still alive five years after initial surgery. 11 patients (24.4%) experienced a recurrence during the follow- up time. The categories of recurrence showed a correlation to the spectral intensities of two regions, 2.33 – 2.3 ppm (p = 0.0403) and 1.28 ppm (p = 0.0144), corresponding to the metabolites phosphocreatine and lipids. Conclusion This study introduces a method that allows an observer-independent, quantitative analysis of IHC to help establish metabolomic profiles and identify metabolomic markers of PCa from spectral intensities obtained with 1H HRMAS NMR Spectroscopy. The immunomarkers P504S and CK903 have been found suitable IHC analysis following 1H HRMAS MRS. A prospective in vivo application of PCa metabolite profiles and metabolomic markers determined by the presented method could serve as highly sensitive, non- invasive diagnostic tool. This observer- independent, computer- automated, quantitative analysis could help to distinguish highly aggressive tumors from low-malignant conditions, avoid overtreatment and reduce risks and complications for cancer patients in the future. Further studies are needed to verify the identified PCa metabolomic markers and to establish clinical applicability. / Einführung Prostatakrebs ist eine häufigsten Krebserkrankungen in den USA und die zweithäufigste malignom- assoziierte Todesursache männlicher Patienten weltweit. Seit der Einführung des Prostata- spezifischen Antigen (PSA)- Screeningtests wird diese Krebsart in früheren Stadien diagnostiziert und therapiert, wodurch die Mortalitätsrate in den letzten Jahren deutlich reduziert werden konnte. Da moderne diagnostische Methoden bislang jedoch nicht ausreichend in der Lage sind, suffizient zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Varianten dieses bösartigen Krebsleidens zu unterscheiden, werden häufig auch Patienten aggressiv therapiert, deren niedriggradiges Prostatakarzinom keine klinische Relevanz gehabt hätte. Es besteht daher ein großes wissenschaftliches Interesse an der Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zur akkuraten Bestimmung von biologischem Status, Malignität, Aggressivität und Ausmaß einer Prostatakrebserkrankung. \\\\\\\"1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy\\\\\\\" (1H HRMAS MRS) ist eine vielversprechende diagnostische Methode, welche es ermöglicht, metabolomische Profile von Prostatakrebs zu erstellen, ohne die Gewebsstruktur der analysierten Proben zu zerstören. Durch anschließende histopathologische Begutachtung lassen sich die erstellten Metabolitprofile validieren und evaluieren. Im Gegensatz zu konventionellen histopathologischen Methoden können durch immunhistochemische Verfahren dabei objektivere, akkuratere und quantifizierbare histopathologische Erkenntnisse gewonnen werden. Die vorliegende Studie präsentiert einen neuentwickelten diagnostischen Ansatz zur quantitativen Bestimmung von metabolomischen Markern von Prostatakrebs, basierend auf der Durchführung von 1H HRMAS NMR Spektroskopie und quantitativer Immunhistochemie. Material und Methoden Einundfünfzig Gewebsproben von Prostatakrebspatienten wurden mittels 1H HRMAS MRS an einem 14.1 T BRUKER NMR Spektrometer unter Einsatz einer CPMG-Pulssequenz untersucht. Spektrale Intensitäten in 36 Metabolitregionen wurden gemessen. Anschließend wurden die analysierten Gewebeproben mit drei Immunfärbemarkern für sowohl malignes (P504S, Alpha-methylacyl-CoA-racemase) als auch benignes (CK903, High-molecular weight cytokeratin, und p63) Prostatagewebe angefärbt und quantitativ mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (QIAP) ausgewertet. Die Anwendbarkeit und Auswertbarkeit der genannten Immunomarker nach Spektroskopie wurde evaluiert und mit der Färbungsqualität von nicht- gescannten Schnitten verglichen. Die Resultate der automatischen Auswertung durch QIAP konnten durch einen erfahrenen Pathologen in einer quantitativen Analyse der Immunfärbungen sowie konventioneller histologischer Färbungen derselben Gewebsproben validiert werden. Die spektralen Intensitäten aus den Messungen mit 1H HRMAS MRS wurden mit den korrespondierenden Ergebnissen der quantitativen Auswertung der Immunfärbungen korreliert, um metabolomische Marker von Prostatakrebs zu identifizieren. Der klinische Verlauf und die Rezidivrate der Patienten wurden 5 Jahre nach der initialen Prostatektomie retrospektiv bestimmt. Rezidivkategorien wurden erstellt und mit den bestimmten spektralen Intensitäten korreliert, um metabolomische Marker für das Auftreten von Prostatakrebsrezidiven zu identifizieren. Ergebnisse Die Immunfärbungen mit P504S und CK903 zeigten exzellente Qualität und Auswertbarkeit nach vorheriger 1H HRMAS MRS. Beide Marker eigneten sich zur Durchführung von quantitativer Immunhistochemie an spektroskopierten Gewebeproben. Im Gegensatz dazu war die Qualität der Immunfärbungen mit p63 nach Spektroskopie vermindert. Quantitative Immunfärbungen unter Einsatz der Immunmarker P504S und CK903 stellten eine praktikable diagnostische Methode dar, um zwischen malignen und benignem Prostatagewebe zu unterscheiden. Der Anteil von bösartig verändertem Prostatagewebe, bestimmt durch QIAP, korrelierte signifikant mit den Ergebnissen der quantitativen Analyse der Immunfärbungen durch den Pathologen (p < 0.001), sowie mit der quantitativen Auswertung der konventionellen histopathologischen Färbung (p = 0.001). Ebenso ließ sich die Bestimmung des Anteils von benignem Gewebe mit QIAP zu den Ergebnissen der pathologischen Analyse korrelieren (p < 0.001 und p = 0.0183). Für zwei metabolomische Regionen konnte ein signifikante Korrelation zwischen relativen spektralen Intensitäten, bestimmt mit 1H HRMAS NMR Spektroskopie, und dem Anteil von malignem Epithelium in derselben Gewebeprobe, ermittelt durch QIAP, festgestellt werden: 3.22 ppm (p = 0.015) und 2.68 ppm (p = 0.0144). Die zu diesen Regionen korrespondierenden Metaboliten, Phosphocholin und Zitrat, konnten als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Die retrospektiven Analyse der klinischen Daten der Patienten fünf Jahre nach Prostatektomie ergab eine Überlebensrate von 97.8%. Elf dieser Patienten (24.4%) erlitten ein Rezidiv ihrer Erkrankung. Die bestimmten Rezidivkategorien korrelierten signifikant mit zwei metabolomischen Regionen (2.33 – 2.3 ppm, p = 0.0403 und 1.28 ppm, p = 0.0144), welche zu den Metaboliten Phosphokreatin und Lipiden korrespondierten. Schlussfolgerung Die vorliegende Studie präsentiert einen diagnostischen Ansatz zur objektiven und quantitativen Bestimmung metabolomischer Marker von Prostatakrebs unter Verwendung von 1H HRMAS MRS und Immunhistochemie. P504S und CK903 eignen sich als Immunmarker für quantitative Immunfärbungen nach vorheriger Durchführung von 1H HRMAS MRS. Die Metaboliten Phosphocholin und Zitrat konnten in der vorliegenden Patientenkohorte als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Eine mögliche in vivo Anwendung der gefundenen metabolomischen Marker könnte als hochsensitives, objektives und nicht- invasives diagnostisches Werkzeug der Prostatakrebsdiagnostik dienen. Der vorliegende untersucherunabhängige, automatisierte und quantitative diagnostischer Ansatz hat das Potential, zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Krebsfällen zu unterscheiden und somit unnötige Risiken und Komplikationen für Prostatakrebspatienten zu reduzieren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die identifizierten metabolomischen Marker zu verifizieren und eine klinische Anwendung zu etablieren.

When microalgae are exposed to changing environmental conditions, e.g., light-dark cycles or oscillations in nutrient availability (CO2, nitrogen, phosphate or silicate) they respond with metabolic changes in the carbon allocation pattern. Short time regulations in the time range of few seconds to minutes can be mirrored best by mass spectroscopy based metabolomics. However, these snap shots do not reflect the alterations in the carbon flow to the cellular macromolecules like protein, carbohydrate or lipid. In this review it is shown how the combination of FTIR spectroscopy and Chla-in-vivo-fluorescence based electron transport rates can reveal changes in the metabolic flux rates of carbon during a shift of the environmental conditions. The review will demonstrate in which time range FTIR spectroscopy can deliver significant information and how FTIR spectroscopy data can synergistically support metabolome analysis by mass-spectroscopy.

Background The detrimental impact of malnutrition and cachexia in cancer patients subjected to surgical resection is well established. However, how systemic and local metabolic alterations in cancer patients impact the serum metabolite signature, thereby leading to cancer-specific differences, is poorly defined. In order to implement metabolomics as a potential tool in clinical diagnostics and disease follow-up, targeted metabolite profiling based on quantitative measurements is essential. We hypothesized that the quantitative metabolic profile assessed by 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can be used to identify cancer-induced catabolism and potentially distinguish between specific tumour entities. Importantly, to prove tumour dependency and assess metabolic normalization, we additionally analysed the metabolome of patients' sera longitudinally post-surgery in order to assess metabolic normalization. Methods Forty two metabolites in sera of patients with tumour entities known to cause malnutrition and cachexia, namely, upper gastrointestinal cancer and pancreatic cancer, as well as sera of healthy controls, were quantified by 1H NMR spectroscopy. Results Comparing serum metabolites of patients with gastrointestinal cancer with healthy controls and pancreatic cancer patients, we identified at least 15 significantly changed metabolites in each comparison. Principal component and pathway analysis tools showed a catabolic signature in preoperative upper gastrointestinal cancer patients. The most specifically upregulated metabolite group in gastrointestinal cancer patients was ketone bodies (3-hydroxybutyrate, P < 0.0001; acetoacetate, P < 0.0001; acetone, P < 0.0001; false discovery rate [FDR] adjusted). Increased glycerol levels (P < 0.0001), increased concentration of the ketogenic amino acid lysine (P = 0.03) and a significant correlation of 3-hydroxybutyrate levels with branched-chained amino acids (leucine, P = 0.02; isoleucine, P = 0.04 [FDR adjusted]) suggested that ketone body synthesis was driven by lipolysis and amino acid breakdown. Interestingly, the catabolic signature was independent of the body mass index, clinically assessed malnutrition using the nutritional risk screening score, and systemic inflammation assessed by CRP and leukocyte count. Longitudinal measurements and principal component analyses revealed a quick normalization of key metabolic alterations seven days post-surgery, including ketosis. Conclusions Together, the quantitative metabolic profile obtained by 1H NMR spectroscopy identified a tumour-induced catabolic signature specific to upper gastrointestinal cancer patients and enabled monitoring restoration of metabolic homeostasis after surgery. This approach was critical to identify the obtained metabolic profile as an upper gastrointestinal cancer-specific signature independent of malnutrition and inflammation.

Background Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed malignant disease among adult males in the USA and the second leading cause of cancer deaths in men. Due to the lack of diagnostic tools that are able to differentiate highly malignant and aggressive cases from indolent tumors, overtreatment has become very common in the era of prostate specific antigen (PSA) screening. New diagnostic methods to determine biological status, malignancy, aggressiveness and extent of PCa are urgently needed. 1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H HRMAS MRS) can be used to establish PCa metabolomic profiles while preserving tissue architecture for subsequent histopathological analysis. Immunohistochemistry (IHC), as opposed to conventional histopathology methods, has the potential to provide objective, more accurate and quantitative knowledge of tissue pathology. This diagnostic- accuracy study sought to evaluate a novel approach to quantitatively identify metabolomic markers of PCa by exploring the potential of PCa immunomarkers to quantify metabolomic profiles established by 1H HRMAS MRS. Material and Methods 1H HRMAS MRS was performed on tissue samples of 51 prostate cancer patients using a 14.1 Tesla NMR spectrometer (BRUKER Biospin, Billerica, MA) with a rotor synchronized CPMG pulse sequence. Spectral intensities of 36 regions of interest were measured as integrals of curve fittings with Lorentzian-Gaussian line shapes. Immunohistochemistry (IHC) was carried out following the spectroscopy scan, using three prostate immunomarkers to identify cancerous and benign glands: P504S (Alpha-methylacyl-CoA-racemace), CK903 (high-molecular weight cytokeratin) and p63. The immunostaining quality following 1H HRMAS MRS was evaluated and compared to unscanned sections of the same sample, to verify the stability and accessibility of the proposed immunomarkers. IHC images were automatically and quantitatively evaluated, using a quantitative image analysis program (QIAP), to determine the percentage of cancerous and benign epithelia in the tissue cross- sections. The results of the program were validated by a correlation with the results of a quantitative IHC review and quantitative conventional histopathology analysis performed by an experienced pathologist. Ultimately, spectral intensities and the cancer epithelium percentage, obtained from quantitative immunohistochemistry, were correlated in order to validate PCa metabolomic markers identified by 1H HRMAS MRS. Patient outcomes and incidence of recurrence were determined by retrospective review of medical records five years after initial surgery. Categories of recurrence were correlated to spectral intensities to explore potential metabolomic markers of recurrence in the cohort. Results Immunostainings with P504S and CK903 showed excellent staining quality and accessibility following 1H HRMAS MRS, suggesting these markers to be suitable for the presented quantitative approach to determine metabolomics profiles of PCa. In contrast, the quality of p63 IHC was impaired after previously performed spectroscopy. IHC using the immunomarkers P504S and CK903 on adjacent slides was found to present a feasible quantitative diagnostic method to distinguish between benign and cancerous conditions in prostate tissue. The cancer epithelium percentage as determined by QIAP showed a significant correlation to the results of quantitative IHC analysis performed by a pathologist (p < 0.001), as well as to a quantitative conventional histopathology review (p = 0.001). The same was true for the benign epithelium percentage (p < 0.001 and p = 0.0183), validating the presented approach. Two metabolomic regions showed a significant correlation between relative spectral intensities and the cancer epithelium percentage as determined by QIAP: 3.22 ppm (p = 0.015) and 2.68 ppm (p = 0.0144). The metabolites corresponding to these regions, phosphocholine and citrate, could be identified as metabolomic markers of PCa in the present cohort. 45 patients were followed for more than 12 months. Of these, 97.8% were still alive five years after initial surgery. 11 patients (24.4%) experienced a recurrence during the follow- up time. The categories of recurrence showed a correlation to the spectral intensities of two regions, 2.33 – 2.3 ppm (p = 0.0403) and 1.28 ppm (p = 0.0144), corresponding to the metabolites phosphocreatine and lipids. Conclusion This study introduces a method that allows an observer-independent, quantitative analysis of IHC to help establish metabolomic profiles and identify metabolomic markers of PCa from spectral intensities obtained with 1H HRMAS NMR Spectroscopy. The immunomarkers P504S and CK903 have been found suitable IHC analysis following 1H HRMAS MRS. A prospective in vivo application of PCa metabolite profiles and metabolomic markers determined by the presented method could serve as highly sensitive, non- invasive diagnostic tool. This observer- independent, computer- automated, quantitative analysis could help to distinguish highly aggressive tumors from low-malignant conditions, avoid overtreatment and reduce risks and complications for cancer patients in the future. Further studies are needed to verify the identified PCa metabolomic markers and to establish clinical applicability.:Table of Contents Glossary 1 Introduction 1. 1 Prostate Cancer 1. 2 Detection of Prostate Cancer – State of the Art 1. 2. 1 Prostate- Specific Antigen Test and Digital Rectal Examination 1.2.2 Radiographic Methods in PCa Detection 1.2.3 Transrectal Core Biopsies and Histopathological Analysis 1.2.4 Histopathological Grading of Prostate Cancer: GLEASON Score 1.3 Challenges and Need for New Approaches in PCa Diagnostic Management 2 Scientific Background I: Nuclear Magnetic Resonance,1H HRMAS NMR Spectroscopy and Metabolomic Profiles 2.1 Nuclear Magnetic Resonance 2.1.1 Spin Precession 2.1.2 Magnetic Resonance 2.1.3 Chemical Shift and J- coupling 2.2 Nuclear Magnetic Resonance 2.2.1 Magic Angle Spinning and 1H HRMAS NMR Spectroscopy 2.2.2 MAS Spinning Rates and Spinning Side Bands 2. 3 Metabolomics, Metabolite Profiles and Clinical Utility 3 Scientific Background II: Immunohistochemistry of Prostate Cancer 4 Aims of the Study 5 Material and Methods 5.1 Prostate Tissue Samples and Patient Demographics 5.2 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.2.1 Sample Preparation 5.2.2 Spectroscopy Scan 5.2.3 Data Processing 5.3 Immunohistochemistry 5.3.1 Immunohistochemistry Material and Equipment 5.3.2. Immunohistochemistry Protocol 5. 3. 3 Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.3.4 Qualitative IHC Analysis 5. 3.5 Quantitative IHC Analysis 5.3.5.1 Quantitative IHC Slide Review 5.3.5.2 Computer-Automated Quantitative IHC Analysis 5.3 Quantitative Histopathology 5. 4 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers 5. 5 Patient Outcomes and Recurrence Categories 5.6 Statistical Analysis 6 Results 6. 1 Patient demographics 6. 2 Spectroscopy Results 6. 3 Immunohistochemistry 6. 3. 1 Evaluation of Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS MRS 6. 3. 2 Qualitative Immunohistochemistry 6. 4 Quantitative Immunohistochemistry 6. 4. 1 Quantitative IHC Slide Review 6. 4. 2 Computer-Automated Quantitative IHC Evaluation using QIAP 6. 5 Quantitative Histopathology 6. 6 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers using QIAP 6. 7 Patient Outcomes and Recurrence 7 Discussion 8 Summary / Abstract 9 Zusammenfassung 10 References 11 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 12 Danksagung 13 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis Appendix A.1 Immunostaining protocols A.2 Spectral Intensities Measured by 1H HRMAS MRS in 51 Samples A.3 Graphs for Correlations of Spectral Intensities and CaE% determined by QIAP in 34 Additional Regions of Interest / Einführung Prostatakrebs ist eine häufigsten Krebserkrankungen in den USA und die zweithäufigste malignom- assoziierte Todesursache männlicher Patienten weltweit. Seit der Einführung des Prostata- spezifischen Antigen (PSA)- Screeningtests wird diese Krebsart in früheren Stadien diagnostiziert und therapiert, wodurch die Mortalitätsrate in den letzten Jahren deutlich reduziert werden konnte. Da moderne diagnostische Methoden bislang jedoch nicht ausreichend in der Lage sind, suffizient zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Varianten dieses bösartigen Krebsleidens zu unterscheiden, werden häufig auch Patienten aggressiv therapiert, deren niedriggradiges Prostatakarzinom keine klinische Relevanz gehabt hätte. Es besteht daher ein großes wissenschaftliches Interesse an der Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zur akkuraten Bestimmung von biologischem Status, Malignität, Aggressivität und Ausmaß einer Prostatakrebserkrankung. \\\\\\\"1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy\\\\\\\" (1H HRMAS MRS) ist eine vielversprechende diagnostische Methode, welche es ermöglicht, metabolomische Profile von Prostatakrebs zu erstellen, ohne die Gewebsstruktur der analysierten Proben zu zerstören. Durch anschließende histopathologische Begutachtung lassen sich die erstellten Metabolitprofile validieren und evaluieren. Im Gegensatz zu konventionellen histopathologischen Methoden können durch immunhistochemische Verfahren dabei objektivere, akkuratere und quantifizierbare histopathologische Erkenntnisse gewonnen werden. Die vorliegende Studie präsentiert einen neuentwickelten diagnostischen Ansatz zur quantitativen Bestimmung von metabolomischen Markern von Prostatakrebs, basierend auf der Durchführung von 1H HRMAS NMR Spektroskopie und quantitativer Immunhistochemie. Material und Methoden Einundfünfzig Gewebsproben von Prostatakrebspatienten wurden mittels 1H HRMAS MRS an einem 14.1 T BRUKER NMR Spektrometer unter Einsatz einer CPMG-Pulssequenz untersucht. Spektrale Intensitäten in 36 Metabolitregionen wurden gemessen. Anschließend wurden die analysierten Gewebeproben mit drei Immunfärbemarkern für sowohl malignes (P504S, Alpha-methylacyl-CoA-racemase) als auch benignes (CK903, High-molecular weight cytokeratin, und p63) Prostatagewebe angefärbt und quantitativ mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (QIAP) ausgewertet. Die Anwendbarkeit und Auswertbarkeit der genannten Immunomarker nach Spektroskopie wurde evaluiert und mit der Färbungsqualität von nicht- gescannten Schnitten verglichen. Die Resultate der automatischen Auswertung durch QIAP konnten durch einen erfahrenen Pathologen in einer quantitativen Analyse der Immunfärbungen sowie konventioneller histologischer Färbungen derselben Gewebsproben validiert werden. Die spektralen Intensitäten aus den Messungen mit 1H HRMAS MRS wurden mit den korrespondierenden Ergebnissen der quantitativen Auswertung der Immunfärbungen korreliert, um metabolomische Marker von Prostatakrebs zu identifizieren. Der klinische Verlauf und die Rezidivrate der Patienten wurden 5 Jahre nach der initialen Prostatektomie retrospektiv bestimmt. Rezidivkategorien wurden erstellt und mit den bestimmten spektralen Intensitäten korreliert, um metabolomische Marker für das Auftreten von Prostatakrebsrezidiven zu identifizieren. Ergebnisse Die Immunfärbungen mit P504S und CK903 zeigten exzellente Qualität und Auswertbarkeit nach vorheriger 1H HRMAS MRS. Beide Marker eigneten sich zur Durchführung von quantitativer Immunhistochemie an spektroskopierten Gewebeproben. Im Gegensatz dazu war die Qualität der Immunfärbungen mit p63 nach Spektroskopie vermindert. Quantitative Immunfärbungen unter Einsatz der Immunmarker P504S und CK903 stellten eine praktikable diagnostische Methode dar, um zwischen malignen und benignem Prostatagewebe zu unterscheiden. Der Anteil von bösartig verändertem Prostatagewebe, bestimmt durch QIAP, korrelierte signifikant mit den Ergebnissen der quantitativen Analyse der Immunfärbungen durch den Pathologen (p < 0.001), sowie mit der quantitativen Auswertung der konventionellen histopathologischen Färbung (p = 0.001). Ebenso ließ sich die Bestimmung des Anteils von benignem Gewebe mit QIAP zu den Ergebnissen der pathologischen Analyse korrelieren (p < 0.001 und p = 0.0183). Für zwei metabolomische Regionen konnte ein signifikante Korrelation zwischen relativen spektralen Intensitäten, bestimmt mit 1H HRMAS NMR Spektroskopie, und dem Anteil von malignem Epithelium in derselben Gewebeprobe, ermittelt durch QIAP, festgestellt werden: 3.22 ppm (p = 0.015) und 2.68 ppm (p = 0.0144). Die zu diesen Regionen korrespondierenden Metaboliten, Phosphocholin und Zitrat, konnten als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Die retrospektiven Analyse der klinischen Daten der Patienten fünf Jahre nach Prostatektomie ergab eine Überlebensrate von 97.8%. Elf dieser Patienten (24.4%) erlitten ein Rezidiv ihrer Erkrankung. Die bestimmten Rezidivkategorien korrelierten signifikant mit zwei metabolomischen Regionen (2.33 – 2.3 ppm, p = 0.0403 und 1.28 ppm, p = 0.0144), welche zu den Metaboliten Phosphokreatin und Lipiden korrespondierten. Schlussfolgerung Die vorliegende Studie präsentiert einen diagnostischen Ansatz zur objektiven und quantitativen Bestimmung metabolomischer Marker von Prostatakrebs unter Verwendung von 1H HRMAS MRS und Immunhistochemie. P504S und CK903 eignen sich als Immunmarker für quantitative Immunfärbungen nach vorheriger Durchführung von 1H HRMAS MRS. Die Metaboliten Phosphocholin und Zitrat konnten in der vorliegenden Patientenkohorte als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Eine mögliche in vivo Anwendung der gefundenen metabolomischen Marker könnte als hochsensitives, objektives und nicht- invasives diagnostisches Werkzeug der Prostatakrebsdiagnostik dienen. Der vorliegende untersucherunabhängige, automatisierte und quantitative diagnostischer Ansatz hat das Potential, zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Krebsfällen zu unterscheiden und somit unnötige Risiken und Komplikationen für Prostatakrebspatienten zu reduzieren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die identifizierten metabolomischen Marker zu verifizieren und eine klinische Anwendung zu etablieren.:Table of Contents Glossary 1 Introduction 1. 1 Prostate Cancer 1. 2 Detection of Prostate Cancer – State of the Art 1. 2. 1 Prostate- Specific Antigen Test and Digital Rectal Examination 1.2.2 Radiographic Methods in PCa Detection 1.2.3 Transrectal Core Biopsies and Histopathological Analysis 1.2.4 Histopathological Grading of Prostate Cancer: GLEASON Score 1.3 Challenges and Need for New Approaches in PCa Diagnostic Management 2 Scientific Background I: Nuclear Magnetic Resonance,1H HRMAS NMR Spectroscopy and Metabolomic Profiles 2.1 Nuclear Magnetic Resonance 2.1.1 Spin Precession 2.1.2 Magnetic Resonance 2.1.3 Chemical Shift and J- coupling 2.2 Nuclear Magnetic Resonance 2.2.1 Magic Angle Spinning and 1H HRMAS NMR Spectroscopy 2.2.2 MAS Spinning Rates and Spinning Side Bands 2. 3 Metabolomics, Metabolite Profiles and Clinical Utility 3 Scientific Background II: Immunohistochemistry of Prostate Cancer 4 Aims of the Study 5 Material and Methods 5.1 Prostate Tissue Samples and Patient Demographics 5.2 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.2.1 Sample Preparation 5.2.2 Spectroscopy Scan 5.2.3 Data Processing 5.3 Immunohistochemistry 5.3.1 Immunohistochemistry Material and Equipment 5.3.2. Immunohistochemistry Protocol 5. 3. 3 Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.3.4 Qualitative IHC Analysis 5. 3.5 Quantitative IHC Analysis 5.3.5.1 Quantitative IHC Slide Review 5.3.5.2 Computer-Automated Quantitative IHC Analysis 5.3 Quantitative Histopathology 5. 4 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers 5. 5 Patient Outcomes and Recurrence Categories 5.6 Statistical Analysis 6 Results 6. 1 Patient demographics 6. 2 Spectroscopy Results 6. 3 Immunohistochemistry 6. 3. 1 Evaluation of Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS MRS 6. 3. 2 Qualitative Immunohistochemistry 6. 4 Quantitative Immunohistochemistry 6. 4. 1 Quantitative IHC Slide Review 6. 4. 2 Computer-Automated Quantitative IHC Evaluation using QIAP 6. 5 Quantitative Histopathology 6. 6 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers using QIAP 6. 7 Patient Outcomes and Recurrence 7 Discussion 8 Summary / Abstract 9 Zusammenfassung 10 References 11 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 12 Danksagung 13 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis Appendix A.1 Immunostaining protocols A.2 Spectral Intensities Measured by 1H HRMAS MRS in 51 Samples A.3 Graphs for Correlations of Spectral Intensities and CaE% determined by QIAP in 34 Additional Regions of Interest

Einleitung: Die Transitphase ist bei Milchkühen mit gravierenden Veränderungen im Metabolismus verbunden. Darüber hinaus ist sie mit Umstellungen im Haltungsumfeld verbunden, welche die Adaptationsmechanismen der Kühe beanspruchen. Aufgrund dieser Herausforderungen erhöht sich das Risiko für produktionsbedingte Erkran¬kungen. Die Leber übernimmt aufgrund ihrer vielfältigen Funktionen, u.a. als Hauptorgan des Stoffwechsels, eine besondere Rolle. Nach wie vor sind die zu Grunde liegenden pathophysiologischen Abläufe nicht vollständig ergründet. Neue Analysemethoden, wie die Metabolomics Technologie, ermöglichen tiefere Einsichten in Stoffwechselvorgänge und Ursachen für individuelle Unterschiede der Erkran¬kungswahrscheinlichkeit sowie die Wirkweise von metaphylaktischen bzw. therapeu¬tischen Maßnahmen. Die positiven Wirkungen von Butafosfan und Cyanocobalamin (BCC) hinsichtlich Ketoseprävention und Leistung wurden bereits aufgezeigt. Die zugrundeliegenden Wirkmechanismen sind jedoch unzureichend erforscht. Zur Erlan¬gung evidenzbasierter Erkenntnisse sind auch in der Buiatrik aktuell noch prospektive, randomisierte, verblindete Tierversuche nötig. Sie sind mit Risiken für die Gesundheit und Produktivitätsverlusten bei den Versuchstieren verbunden. Genaue Angaben zu Qualität und Quantität derartiger Ausfälle für Feldversuche gibt es allerdings kaum. Ziele der Untersuchung: Die Dissertationsschrift hatte das Ziel, das Metabolom im Lebergewebe in Bezug zu klinischen und laborchemischen Merkmalen sowie zu Gesundheits- und Produktionsdaten von Milchkühen während der Transitphase zu charakterisieren. Weiterhin sollte der Effekt der metaphylaktischen Behandlung mit BCC auf das Leber-Metabolom evaluiert sowie die Auswirkungen eines intensiven Versuchsprotokolls auf die Gesundheit und Leistungskennzahlen erfasst werden. Tiere, Material und Methoden: Aus einer Herde mit 660 Deutsch-Holstein-Kühen wurden im ersten Teil der Studie 87 gesunde Kühe einbezogen (Publikation 1). Diese wurden ab Tag 14 ante partum (Tag –14) bis Tag 49 post partum (Tag 49) täglich klinisch überwacht. An den Tagen –7 bis –5 und 1 bis 3 wurden die Kühe intravenös mit BCC in zwei Dosierungen (5 / 10 ml Catosal® pro 100 kg Körpermasse; 0,05 mg / ml Cyanocobalamin, 100 mg / ml Butafosfan; Bayer Animal Health GmbH, Leverkusen, Deutschland) bzw. Natriumchlorid-haltigem Placebo behandelt. Die statistische Analyse wurde mit multivariaten [partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA)] und univariaten Methoden (lineares gemischtes Modell) durchgeführt. Den Kühen wurden mehrfach Blut- (n = 8), Lebergewebe- (n = 4) und Harnproben (n = 13) entnommen. Zu sieben Zeitpunkten wurde die Leber sonographisch untersucht bzw. die Rückenfettdicke vermessen. Sämtliche Gesundheits-, Leistungs- und Reproduk¬tionsmerkmale wurden digital im Programm Herde® (dsp-Agrosoft GmbH, Ketzin / Havel, Deutschland) dokumentiert. Im zweiten Teil der Studie wurden gesundheitliche Schäden, die potenziell mit den Versuchsmaßnahmen im Zusammenhang standen, erfasst und ausgewertet. Dazu wurden 206 Kühe als nicht manipulierte Vergleichstiere für die Gesundheits- und Produktionsmerkmale hinzugezogen (Publikation 2). Die Milchleistung Ergebnisse: Insgesamt bestätigen die Ergebnisse stoffwechselassoziierte Veränder¬ungen im Metabolom während der Transitphase. Die Kühe wurden anhand derartiger Unterschiede des Leber-Metaboloms in drei Metabotypen (A – C) eingeteilt. Die Be¬handlung mit BCC wirkte sich unterschiedlich auf diese Stoffwechselprofile aus. Die Veränderungen im Leber-Metabolom deuten auf die Steigerung der Beta-Oxidation und den effizienteren Triacylglycerol-Export in der Leber hin. Dieser Effekt war auf phänotypische Merkmale beim Einsatz der höheren Dosis im Vergleich zur niedrigeren Dosis signifikant. Der deutlichste Behandlungseffekt wurde beim Metabotyp B am Tag 7 beobachtet. Für den zweiten Teil der Dissertation wurden die Folgen des durch¬geführten Tierversuches näher untersucht. Die meisten Schäden waren mit der Entnahme der Leberbiopsien assoziiert (Biopsiestelle: diffuse Entzündung der Bauch¬wand, erhöhte Echogenität im Lebergewebe). Die Milchleistung der Versuchskühe lag unter und die somatische Zellzahl über der der nicht-manipulierten Vergleichskühe (statistisch signifikant, P=0.001). Bei den Versuchskühen wurde eine geringere Totgeburtenrate erreicht. Der Versuch hatte keinen Einfluss auf die Überlebensdauer der Versuchstiere. Schlussfolgerungen: Es konnten Kühe identifiziert werden, die aufgrund ihres Metabotyps während der Transitphase einem besonderen Risiko ausgesetzt waren (Metabotyp B). Für diese Risikotiere konnte eine dosisabhängige, positive Wirkung der Behandlung mit BCC auf den Gesundheitsstatus erzielt werden. Weiterhin zeigte sich, dass ein intensives Studienprotokoll bei Milchkühen im Herkunftsbetrieb unterschiedliche Auswirkungen auf Gesundheits- und Produktionskennzahlen haben kann. Diese Analyse trägt zur Abschätzung der Risiken derartiger Verfahren bei und kann somit hilfreich bei der Planung und Durchführung weiterer Studien sein.:1. EINLEITUNG 1 2. LITERATURÜBERSICHT 4 2.1 Die Transitphase bei Milchkühen 4 2.1.1 Physiologie der Adaptation 4 2.1.2 Das Lipomobilisationssyndrom 7 2.2 Untersuchungen des Metaboloms zur Ergründung pathophysiologischer Reaktionsnetzwerke in der Transitphase 10 2.2.1 „Omics“-Methoden 10 2.2.2 Metabolomics 11 2.2.3 Technische Durchführung 11 2.2.4 Anwendung in der Veterinärmedizin 12 2.3 Prinzipien pro- und metaphylaktischer Maßnahmen in der Transitphase 14 2.3.1 Zufuhr von Energieträgern 19 2.3.2 Beeinflussung des Pansenmikrobioms 19 2.3.3 Beeinflussung des Leberstoffwechsels 220 2.4 Auswirkungen von Studienprotokollen auf den Organismus von Versuchstieren 23 2.4.1 Evidenzbasierte Medizin 23 2.4.2 Evidenzbasierte Veterinärmedizin: Versuche am Tier 24 2.4.3 Belastungen durch Studienprotokolle 25 2.4.4 Beurteilung studienassoziierter Belastungen 26 2.5 Schlussfolgerungen aus der Literaturrecherche und Arbeitshypothesen 27 3. MATERIAL UND METHODEN 29 3.1 Studiendesign 29 3.1.1 Tierversuchsantrag und Präambel 29 3.1.2 Patientenmaterial 29 3.2 Spezielle Untersuchungsgänge der Kühe der Versuchsgruppe 30 3.2.1 Untersuchungen 30 3.2.2 Probenentnahme 30 3.2.3 Probenhandling und Analyse von Blut-, Leber- und Harnproben 32 3.2.4 Sonographische Untersuchung 321 4. PUBLIKATION 1 332 5. PUBLIKATION 2 565 6. DISKUSSION 743 6.1 Präambel 743 6.2 Diskussion der Eignung des Versuchsprotokolls zur Beantwortung der Zielstellung 74 6.3 Angewandtes Therapieschema und Effekte der Butafosfan- und Cyanocobalamintherapie 75 6.3.1 Dosierung, Applikationsart und Behandlungshäufigkeit 754 6.3.2 Diskussion des Therapieschemas im Kontext der neuen EU-Tierarznei¬mittel-Verordnung 78 6.3.3 Mögliche Effekte bei erkrankten Tieren, Ausblick 79 6.4 Diskussion der Auswirkungen des intensiven Versuchsprotokolls auf die Gesundheit und Leistungskennzahlen der Milchkühe während des Versuchs 80 6.4.1. Direkte Schäden an den Tieren durch studienbedingte Manipulationen 80 6.4.2. Auswirkung auf die Gesamtgesundheit der Tiere 821 6.4.3. Einfluss auf das Abgangsgeschehen bei den Tieren 843 6.5 Bedeutung der Befunddokumentation in Protokollen und Verwendung von Scoring-Sheets zur Datenerhebung sowie der Wert einer Überwachung der Versuchstiere durch erfahrene Tierärzte 84 7 ZUSAMMENFASSUNG 87 8 SUMMARY 89 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 10 ANHANG 118 11 DANKSAGUNG 151 / Introduction: The transition period in dairy cows is characterised by significant metabolic changes. Management changes commonly occur at the same time, causing stress and impairing the adaptation mechanisms of the cows, which increases the risk of production diseases. The liver is the main metabolic organ and therefore plays a crucial role in the adaptive changes that occur in the transition period. However, several basic pathophysiological mechanisms that occur in the transition period are not completely understood. Novel methods of analysis such as metabolomics technology improve the interpretation of metabolic processes and the individual differences in the probability of illness among cows. Furthermore, these techniques allow a better understanding of the modes of action of metaphylactic and therapeutic measures. The beneficial effects of Butafosfan and cyanocobalamin (BCC) with respect to ketosis prevention and milk yield have been established but the underlying mechanisms of action are not completely understood. Prospective, randomised and blinded animal testing remains a cornerstone of the search for evidence-based knowledge in many medical fields including buiatrics. However, animal testing is associated with an increased risk of health problems and loss of production, and the magnitude and types of risks are not clearly defined. Objectives: The primary goal of this dissertation was to characterise the metabolome of liver tissue in relation to clinical and laboratory variables as well as health and production parameters in transitional dairy cows. A secondary goal was to investigate the effect of metaphylactic treatment with BCC on the metabolome of the liver and the effect of an intensive experimental protocol on the health and production parameters in dairy cows. Animals, Materials and Methods: In the first part of the study (publication 1), 87 healthy cows from a herd of 660 German Holstein cows were used. The cows were monitored clinically every day from day 14 antepartum (day –14) until day 49 postpartum (day 49). On days –7 to –5 and 1 to 3, the cows received either 5 or 10 ml BCC (Catosal® per 100 kg body weight; 0.05 mg/ml cyanocobalamin, 100 mg/ml Buta¬fosfan; Bayer Animal Health GmbH, Leverkusen, Germany) or a placebo of coloured isotonic saline solution administered intravenously. Statistical analysis was performed using multivariate [partial least squares discriminant analysis (PLS-DA)] and univariate methods (linear mixed model). The cows underwent serial blood (n = 8), liver biopsy sample (n = 4) and urine (n = 13) collection and sonographic examination of the liver (n = 7) and measurement of the back fat (n = 7). The herd management software Herde® (dsp-Agrosoft GmbH, Ketzin/ Havel, Germany) was used to document health, fertility and production parameters. The second part of the study (publication 2) dealt with adverse health effects that were potentially associated with the experimental protocol. For this purpose, 206 control cows were used for the comparison of health and production data. Results: Overall, the findings of this study confirm the occurrence of metabolomic changes related to metabolic processes during the transition period. The cows were divided into 3 metabolomic profiles (A to C) based on the changes in the liver metabolome. The effect of BCC on these profiles differed. The changes in the liver metabolome suggested an increase in β-oxidation and more efficient triacylglycerol export in the liver of cows treated with the higher dose of BCC. A comparison of the 2 doses of BCC showed that the higher dose had a significant effect on phenotypic traits. The largest treatment effect was seen in metabolomic profile B on day 7. Most study protocol-associated lesions were related to the liver biopsy procedure and included diffuse inflammation of the abdominal wall at the biopsy site and increased echogenicity of the hepatic tissue. In the experimental cows, the milk yield was lower, the somatic cell count was higher and the stillbirth rate was lower compared with the control cows (statistically significant, P=0.001). The survival rate did not differ between the experimental and control cows. Conclusions: This study allowed the identification of cows with an increased risk of metabolic disease based on their metabolic profile (profile B) during the transition period. A positive and dose-dependent effect of BCC on the health status was seen in those cows. An intensive experimental protocol can have different effects on health and production parameters in dairy cows. This study improves risk assessment for intensive experimental protocols and facilitates the planning and execution of future studies that involve animal testing.:1. EINLEITUNG 1 2. LITERATURÜBERSICHT 4 2.1 Die Transitphase bei Milchkühen 4 2.1.1 Physiologie der Adaptation 4 2.1.2 Das Lipomobilisationssyndrom 7 2.2 Untersuchungen des Metaboloms zur Ergründung pathophysiologischer Reaktionsnetzwerke in der Transitphase 10 2.2.1 „Omics“-Methoden 10 2.2.2 Metabolomics 11 2.2.3 Technische Durchführung 11 2.2.4 Anwendung in der Veterinärmedizin 12 2.3 Prinzipien pro- und metaphylaktischer Maßnahmen in der Transitphase 14 2.3.1 Zufuhr von Energieträgern 19 2.3.2 Beeinflussung des Pansenmikrobioms 19 2.3.3 Beeinflussung des Leberstoffwechsels 220 2.4 Auswirkungen von Studienprotokollen auf den Organismus von Versuchstieren 23 2.4.1 Evidenzbasierte Medizin 23 2.4.2 Evidenzbasierte Veterinärmedizin: Versuche am Tier 24 2.4.3 Belastungen durch Studienprotokolle 25 2.4.4 Beurteilung studienassoziierter Belastungen 26 2.5 Schlussfolgerungen aus der Literaturrecherche und Arbeitshypothesen 27 3. MATERIAL UND METHODEN 29 3.1 Studiendesign 29 3.1.1 Tierversuchsantrag und Präambel 29 3.1.2 Patientenmaterial 29 3.2 Spezielle Untersuchungsgänge der Kühe der Versuchsgruppe 30 3.2.1 Untersuchungen 30 3.2.2 Probenentnahme 30 3.2.3 Probenhandling und Analyse von Blut-, Leber- und Harnproben 32 3.2.4 Sonographische Untersuchung 321 4. PUBLIKATION 1 332 5. PUBLIKATION 2 565 6. DISKUSSION 743 6.1 Präambel 743 6.2 Diskussion der Eignung des Versuchsprotokolls zur Beantwortung der Zielstellung 74 6.3 Angewandtes Therapieschema und Effekte der Butafosfan- und Cyanocobalamintherapie 75 6.3.1 Dosierung, Applikationsart und Behandlungshäufigkeit 754 6.3.2 Diskussion des Therapieschemas im Kontext der neuen EU-Tierarznei¬mittel-Verordnung 78 6.3.3 Mögliche Effekte bei erkrankten Tieren, Ausblick 79 6.4 Diskussion der Auswirkungen des intensiven Versuchsprotokolls auf die Gesundheit und Leistungskennzahlen der Milchkühe während des Versuchs 80 6.4.1. Direkte Schäden an den Tieren durch studienbedingte Manipulationen 80 6.4.2. Auswirkung auf die Gesamtgesundheit der Tiere 821 6.4.3. Einfluss auf das Abgangsgeschehen bei den Tieren 843 6.5 Bedeutung der Befunddokumentation in Protokollen und Verwendung von Scoring-Sheets zur Datenerhebung sowie der Wert einer Überwachung der Versuchstiere durch erfahrene Tierärzte 84 7 ZUSAMMENFASSUNG 87 8 SUMMARY 89 9 LITERATURVERZEICHNIS 91 10 ANHANG 118 11 DANKSAGUNG 151