京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21375号 / 農博第2299号 / 新制||農||1067(附属図書館) / 学位論文||H30||N5148(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻 / (主査)教授 入江 一浩, 教授 橋本 渉, 准教授 後藤 剛 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

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Dans l’optique de comprendre et maitriser le vieillissement des vins, en particulier des vins blancs, il est nécessaire d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes physico-chimiques d’oxydation liés aux processus d’oxygénation. Pour cela, il est important d’avoir des outils permettant la quantification de la capacité antioxydante des vins blancs, et l’identification des composés impliqués dans celle-ci, afin de pouvoir anticiper l’aptitude au vieillissement d’un vin.Lors de cette étude, des analyses de la capacité antioxydante par DPPH et Résonnance Paramagnétique Electronique (RPE) ont été réalisées sur un grand nombre de vins en cours d’élevage et issus de plusieurs millésimes. En parallèle des analyses métabolomiques, principalement par Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse (UPLC-Q-TOF-MS) mais également par Spectrométrie de Masse à Résonance Cyclotronique des Ions et à Transformée de Fourier (FT-ICR-MS) ont été réalisées.L’optimisation de la méthode DPPH, pour l’analyse des vins blancs a révélé une réactivité importante des composés soufrés, avec des capacités antioxydantes similaires à celles des composés phénoliques. La comparaison de cette méthode optimisée à la méthode de référence du laboratoire (RPE) sur plus de 106 vins, a montré la complémentarité de l’information apportée par ces deux différentes méthodes de mesure de capacité antioxydante. Le traitement statistique des corrélations avec les analyses métabolomiques réalisées sur 287 vins a permis de révéler une liste de 380 marqueurs moléculaires associés à la capacité antioxydante des vins. Une méthode alternative de mesure du potentiel antioxydant des vins blancs a également été développée, qui repose sur l’identification de composés nucléophiles naturellement présents et susceptibles de piéger les quinones formées au cours de mécanismes d’oxydation. Outre des composés soufrés, nous avons montré que différents peptides ayant des propriétés antioxydantes présentent de telles propriétés nucléophiles. Dans un second temps, l’étude de différentes pratiques œnologiques (élevage, hyperoxygénation ou sulfitage) a permis de déterminer leurs impacts sur la capacité antioxydante des vins mais également sur les marqueurs moléculaires associés. Il apparait ainsi une augmentation significative de la capacité antioxydante des vins au cours de l’élevage. De plus, cette augmentation de la capacité antioxydante est associée à une consommation de peptides en début d’élevage, ainsi qu’à l’apparition de nouveaux composés dans les vins et ce indépendamment du millésime. Les composés qui apparaissent semblent être majoritairement des composés phénoliques provenant potentiellement du bois ou de l’autolyse des levures. Les vins issus de moûts protégés par l’ajout précoce de sulfites ont une capacité antioxydante plus élevée par rapport aux vins issus de moûts hyperoxygénés. De plus, la protection du moût à un impact important sur la composante moléculaire soufrée retrouvée dans les vins. Ainsi, il a été observé une quantité beaucoup plus faible de composés soufrés (peptides ou non) dans les vins issus de moûts hyperoxygénés montrant donc une consommation de ces composés dans les mécanismes d’oxydation du vin. En résumé, ces résultats révèlent pour la première fois l’importance des composés soufrés dans les mécanismes de protection des vins blancs de Bourgogne vis-à-vis de l’oxydation, par leur capacité de piégeur de radicaux mais également de piégeur de quinones. / In order to understand and control the aging of wines, particularly white wines, it is necessary to deepen our knowledge about the physico-chemical mechanisms of oxidation related to oxygenation processes. For this, it is important to have tools to quantify the antioxidant capacity of white wines, and to identify the compoiunds involved, in order to anticipate the aging ability of a wine.In this study, analyzes of the antioxidant capacity by DPPH and Electron Paramagnetic Resonance (EPR) were carried out on a large number of wines during aging and from several vintages, in parallel with metabolomic analyzes, mainly carried out by Liquid Chromatography Coupled to Mass Spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) but also by Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (FT-ICR-MS).Optimization of the DPPH method for the analysis of white wines, showed a high reactivity of sulfur compounds with similar antioxidant capacities to those of phenolic compounds. The comparison of this optimized method with the laboratory reference method (EPR) on more than 106 wines, showed the complementarity of the information provided by these two different methods of measuring an antioxidant capacity.Combining antioxidant capacity measurements and metabolomic analyzes, it was possible to determine a list of molecular markers related to the antioxidant capacity of white wines. During this study, a focus on nucleophilic compounds present in wines has also been realized, these compounds being able to react with the quinones formed during oxidation and thus to play a role in the oxidation mechanisms of white wines. Besides sulfur compounds, we showed that several peptides with antioxidant properties could exhibit such nucleophilic behavior. In a second step, the study of different oenological practices (aging, hyperoxygenation or adding SO2 to must) allowed to determine their impacts on the antioxidant capacity of wines but also on the associated molecular markers. It thus appears a significant increase in the antioxidant capacity of the wines during aging. In addition, this increase in antioxidant capacity is associated with a consumption of peptides at the beginning of aging, but also with the appearance of compounds in wines, regardless of the vintage. The compounds that appear are potentially phenolic compounds which can come from wood or lees autolysis. Wines from protected musts with sulfites addition, have a higher antioxidant capacity compared to wines from hyperoxygenated musts. In addition, the protection of musts has a significant impact on the sulfur component found in wines. Thus, a much smaller amount of sulfur compounds (peptides or not) has been observed in wines derived from hyperoxygenated musts, showing a consumption of these compounds in the oxidation mechanisms. Overall, these results reveal for the first time the importance of sulfur compounds in the mechanisms of protection of white wines from Burgundy against oxidation, by radical scavenging capacity and quinone trapping.

Le colza est une culture oléagineuse très exigeante en intrants azotés associée à une faible efficience d’usage de l’azote (EUA). Le défi majeur vise à améliorer le bilan agroenvironnemental du colza par une optimisation de l’EUA, notamment en condition où l’azote est limitant dans le sol. L’EUA est limitée par une faible efficience de remobilisation de l’azote (ERA) lors de la sénescence des feuilles. L’objectif de ce travail de thèse a consisté à rechercher, chez le colza, la topologie et l’orientation des attributs métaboliques associées à l’ERA pendant la sénescence foliaire.Les résultats montrent que le métabolome des feuilles évolue tout au long de leur développement végétatif, de leur croissance à leur chute. Il est spécifique à chaque étage foliaire et traduit des relations trophiques et environnementales particulières liées au positionnement des feuilles dans le couvert végétal. Ces spécificités sont associées à des variations de teneurs en glucides, d’acides aminés,de glucosinolates et de coumarines en lien étroit avec la régulation phytohormonale du développement foliaire et avec leur translocation dans le phloème. Le cas de la Proline a été plus particulièrement approfondi et l’activation de son catabolisme sous régulation circadienne dans les tissus sénescents a été mise en évidence. Une approche combinée de transcriptomique et de métabolomique a permis de démontrer une variabilité génotypique importante dans les processus de dégradation et de transport des protéines, glucides et acides aminés entre deux génotypes à forte ERA. De la même manière, des relati / Oilseed rape is a very demanding oleaginous crop for nitrogen inputs associated with a low nitrogen use efficiency (NUE). The main challenge to improve the agri-environmental balance of oilseed rape is to optimize the NUE, especially under nitrogen deprivation. The NUE is limited by a low nitrogen remobilization efficiency (NRE) during leaf senescence. The aim of this thesis was to define the metabolome topology and orientation associated with NRE during leaf senescence in oilseed rape.The results show that leaf metabolome dynamically evolves throughout their vegetative growth, until their fall. Metabolome was found specific to each leaf rank, reflecting the trophic and environmental relationships related to the leaf positioning in the canopy. These specificities are associated with variations in carbohydrates, amino acids, glucosinolates and coumarins contents in close connection with the phytohormonal regulation of leaf development and with their translocation in the phloem.In particular, the activation of Proline circadian-controlled catabolism in senescent tissues was demonstrated. Finally, significant variations in the degradation and transport of proteins, carbohydrates and amino acids between two highly efficient NRE genotypes were highlighted using a combined transcriptomic and metabolomic approach. Similarly, a close relationship has been described between the genes expression levels and the metabolic content involved to increase NRE under low nitrogen input.The results are discussed regarding nitrogen remobilization improvement and more generally nutrients i

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Cette thèse présente une approche multicompartimentée en métabolomique appliquée au diagnostic des tumeurs indéterminées de la thyroïde et à la caractérisation de l’effet du fructo-oligosaccharide sous condition de régime hyperlipidique chez la souris. L’objectif était de montrer qu’une telle approche permettrait de visualiser de façon plus globale des modulations du métabolisme induites, et par conséquent, d’améliorer la pertinence des marqueurs discriminants identifiés. Dans le cas de l'analyse nutritionnelle, l’analyse mono-compartimentée des différentes organes/segments intestinaux des souris ont permis de mettre en évidence les voies métaboliques affectées par le régime hyperlipidique mais pas d’observer un effet significatif du prébiotique FOS. Dans le cas du cancer de la thyroïde, l’étude multicompartimentée n’a pas pu être mise en place dans de bonnes conditions (problème de prélèvement d’échantillons). Cependant, l’analyse métabolomique monocompartimentée basée sur l’analyse HR-MAS des ponctions prélevées à l’aiguille fine a mené à une discrimination significative entre les lésions bénignes et malignes avec une prédictivité similaire aux tests moléculaires actuellement disponibles. En parallèle, nous avons exploré la technique HR-MAS à rotation lente dans le but de préserver l’intégrité des tissus au cours des expériences. L’utilisation de cette technique s’accompagne d’un certain nombre d’inconvénients que nous avons contournés en utilisant des séquences RMN particulières, et en mettant en place un protocole robuste de préparation d’échantillons. Enfin, nous avons évalué le filtre T1ρ et son application en métabolomique comme alternative au filtre T2. / This thesis presents a multicompartmental metabolomics approach applied to the diagnosis of indeterminate thyroid tumours and to the characterization of the effect of fructo-oligosaccharide (FOS), a prebiotic, under high fat diet condition in a mouse model. The aim of this project is to show that such approach could lead to a more global visualization of the induced metabolic modulations, and therefore, improve the identified discriminant markers relevance. Regarding the diet study, the mono-compartmental analysis of the different mouse organs/intestine segments enabled us to identify metabolic pathways affected by the high fat diet whereas the effect of FOS could only be characterized for the feces samples collected at day 28. Regarding the thyroid cancer study, the multi-compartmental approach could not have been continued due to sample handling issues. However, the classical metabolomics analysis of the fine-needle aspiration biopsies (FNAB) from patients with benign or malignant tumours led to a clear discrimination between both groups with a predictivity similar to that of commercial diagnosis tests. In the meantime, we explored the slow-spinning NMR HR-MAS technique in order to preserve the integrity of the tissues during the experiments. The use of this technique is accompanied by a number of drawbacks that we have avoided using special NMR sequences, and putting in place a robust protocol for sample preparation. Finally, we evaluated the T1ρ filter and its applications to metabolomics as an alternative to T2 filter.

Au cours des dernières années, de nombreuses études ont porté sur les relations entre le microbiote intestinal et l'obésité. Des groupes bactériens ont été incriminés et des hypothèses proposées mais les mécanismes liant microbiote et obésité restent en grande partie inconnus. Le microbiote intestinal est constitué de plusieurs centaines d’espèces et est spécifique de chaque individu. Récemment, il a été révélé l’implication potentielle de ce microbiote dans le développement de l’obésité. Lors d’une étude précédente, notre équipe a ainsi montré que les souris sans germes (dites « axéniques ») sont résistantes à l’obésité et aux désordres métaboliques induits par un régime hypercalorique (Roy et al. 2012). Par ailleurs, nous avons observé que certaines souris conventionnelles soumises à un tel régime développent une obésité et une insulinorésistance importantes (phénotype dit répondeur) tandis que d'autres restent minces et tolérantes au glucose (phénotype dit non répondeur) indépendamment de la quantité de nourriture consommée. Les mécanismes expliquant cette hétérogénéité de phénotype sont actuellement peu connus. Ce projet de thèse vise donc à élucider les mécanismes liant le microbiote intestinal au développement de l'obésité et des désordres associés en partant du principe que l'hétérogénéité (en termes de composition et de fonctions) du microbiote intestinal, spécifique de chaque individu (aussi bien chez l'homme que chez le rongeur), joue un rôle dans ces réponses différentes à un même régime hypercalorique. Pour ce faire, des souris conventionnelles ont reçu un régime contrôle ou un régime hyperlipidique pendant 12 semaines. A l’issu de ce régime, des souris ont été sélectionnées en tant que répondeuses ou non-répondeuses Une approche par métagénomique à partir d’échantillons fécaux prélevés avant et après régime hyperlipidique et issus des souris répondeuses et non-répondeuses ont été analysés. Les profils de microbiotes avant et après régime hyperlipidique ont été comparés afin de déterminer les effets de ce régime sur le microbiote intestinal. De plus, le profil du microbiote des souris répondeuses a été comparé à celui des souris non-répondeuses afin de détecter des espèces bactériennes, des gènes ou des voies métaboliques sous- ou sur-représentés dans les deux phénotypes. Par ailleurs, des échantillons de fèces, d’urine et de plasma prélevés avant et après le régime hyperlipidique ont été analysés par métabolomique et nous avons ainsi analysé les fluctuations métaboliques induites par l’effet du régime. L’ensemble de ces travaux a eu pour but d’identifier s’il existe un microbiote de prédisposition au développement ou à la résistance du développement d’une obésité induite. Au cours de ce projet de thèse nous avons utilisé l’approche de métagénomique à partir d’échantillon fécaux afin d’identifier les profils du microbiote intestinal des souris NR et des souris R avant et après régime hyperlipidique en vue de mesurer l’impact de ce type de régime sur le microbiote, et surtout de détecter les espèces bactériennes, les gènes ou les voies métaboliques potentiellement sous- ou sur-représentés dans les deux phénotypes. D’autre part, l’approche de métabolomique a été utilisée sur des échantillons d’urine, de fèces et de plasma avant et après régime afin de visualiser les fluctuations métaboliques induites par l’effet du régime d’une part et d’identifier les métabolites (biomarqueurs) associés à chacun des phénotypes d’autre part. / In recent years, numerous studies have examined the relationship between the gut microbiota and obesity. Bacterial groups have been incriminated but the mechanisms linking microbiota and obesity remain largely unknown. Intestinal microbiota consists of several hundred species and is specific for each individual. Recently, it was revealed that the potential contribution of microbiota in the development of obesity. In a previous study, our team has shown that mice without germs (called "germ-free") are resistant to obesity and metabolic disorders induced by a high calorie diet (Roy et al. 2012). Furthermore, we observed that certain conventional mice subjected to such a plan develop an important obesity and insulin resistance (responder phenotype) while others remain thin and glucose tolerant (non responder phenotype) regardless of the amount of food consumed. The mechanisms explaining this phenotype heterogeneity are currently poorly known. This PhD project aims to elucidate the mechanisms linking the intestinal microbiota in the development of obesity and disorders associated with the assumption that heterogeneity (in terms of composition and functions) of the intestinal microbiota, specific for each individual ( both in humans than in rodents), plays a role in these different responses to the same high-fat diet. To do this, conventional mice received control diet or a high fat diet for 12 weeks. At the end of this diet, mice were selected as a responder or non-responder A metagenomics approach from fecal samples taken before and after high fat diet and from responder and non-responder mice were analyzed. Microbiota profiles before and after fat diet were compared to determine the effects of this diet on the intestinal microbiota. In addition, the profile of the microbiota of responder mice was compared to that of non-responder mice in order to detect bacterial species, genes or pathways under- or over-represented in both phenotypes. Furthermore, samples of feces, urine and plasma collected before and after fat diet were analyzed by metabolomics and we have analyzed the metabolic changes induced by the effect of diet. All of this work has been aimed to identify if there is a predisposition microbiota to the development or the resistance of induced obesity. In this PhD project we used the metagenomic approach from fecal sample to identify the profiles of the intestinal microbiota in mice NR and R mice before and after fat diet in order to measure the impact of this type of diet on the microbiota, and especially to detect bacterial species, genes or metabolic pathways potentially under- or over-represented in both phenotypes. On the other hand, the approach of metabolomics has been used on samples of urine, feces and plasma before and after diet in order to visualize the metabolic changes induced by the effect of diet on the one hand and to identify metabolites (biomarkers) associated with each other hand phenotypes.

Les travaux exposés dans cette thèse sont le reflet d'années d'efforts consacrées à la mise en place de diagnostics de qualités des hépatites virales au Laos au sein du Centre d'infectiologie Lao Christophe Mérieux (CILM), dont je suis aujourd'hui la directrice scientifique. En introduction, nous avons tenu à présenter les caractéristiques socio-économiques du Laos et ses défis sanitaires pour atteindre les Millennium Development Goals, qui guident les politiques publiques de pays en situation de développement. Nous avons jugé important de souligner ces points tout comme la présentation du CILM pour faire comprendre au lecteur le contexte de réalisation de ce travail. C'est grâce à une bio-banque riche de plus de 7,000 échantillons biologiques de patients infectés par les virus des hépatites virales B et C, que nous avons pu poser la question de recherche clé de cette thèse : Comment évoluent les hépatites virales chez les patients reçus depuis une dizaine d'années au CILM ? Cette question en a fait émerger une deuxième concernant la qualité du diagnostic dans les centres de soins à Vientiane. Ainsi, nous nous sommes intéressés aux kits de diagnostic rapide de l'hépatite B utilisés dans les structures de soins de Vientiane, comparés au standard utilisé dans notre laboratoire. Ces travaux, qui ont donné lieu à la publication de 2 articles (un troisième article a été soumis), jouent un rôle capital pour le pays, car ils donnent des axes d'intervention aux autorités de santé publique laotiennes pour combattre ce fléau. Nous avons choisi une présentation dichotomique des hépatites virales avec une partie dédiée aux hépatites B et une partie dédiée à l'hépatite C en raison de l'émergence d'une troisième question de recherche plus fondamentale. Il s'agit du risque de développement du cancer du foie chez les patients infectés, risque différent suivant que l'on est porteur d'une hépatite B ou d'une C. En effet, les outils diagnostiques pour déterminer la magnitude de ce risque sont peu ou pas accessibles pour les patients au Laos. [...] / The work presented in this thesis reflects many years of effort to devoted the implementation of quality diagnostics of viral hepatitis in Laos at the Centre d'infectiologie Lao Christophe Mérieux (CILM), of which I am now the scientific director. In the introduction, we wanted to present the socio-economic characteristics of Laos and its health challenges in order to achieve the Millennium Development Goals (MDG), which guide public policies in developing countries. We felt it was important to highlight these points as well as the presentation of the CILM to help the readers to understand the context in which this work was carried out. It is thanks to a bio-bank with more than 7,000 biological samples from patients infected with viral hepatitis B and C viruses, that we were able to ask the key research question of this thesis: What is the evolution of patients infected by viral hepatitis B/C who have been follow the viral load at CILM for the past ten years or so? This question raised a second one concerning the quality of diagnosis in health centres in Vientiane. For example, we were interested in the rapid diagnostic kits for hepatitis B used in Vientiane's health facilities, compared to the standard used in our laboratory. This work, which has resulted in the publication of 2 articles (a third article has been submitted), plays a crucial role for the country, as it provides Laotian public health authorities with a focus for action to combat this scourge.

<p>   </p> <p>Ambient Mass Spectrometry Imaging (MSI) is a powerful analytical tool in biomedical research that enables simultaneous label-free spatial mapping of hundreds of molecules in biological samples under native conditions. Nanospray desorption electrospray ionization (nano-DESI) is an emergent ambient MSI technique developed in 2010 that uses localized liquid extraction of molecules directly from surfaces. Like other liquid-extraction based techniques, nano-DESI relies on gentle removal of molecules from surfaces and soft ionization. High sensitivity and spatial resolution, versatility of the solvent composition, which may be used to tailor the extraction and ionization of selected molecules, quantification capabilities at the single-pixel level as well as compensation for matrix effects by adding a known standard to the solvent, and online derivatization are key features of nano-DESI MSI that position it as a unique analytical tool for studying biological systems. </p> <p>Despite the advantages that nano-DESI provides, there are still challenges associated with the structural characterization, extraction, and detection of certain molecular classes. Therefore, my dissertation research has focused on addressing these analytical challenges by developing innovative approaches that substantially enhance the performance of the nano-DESI technique in the study of complex biological systems. </p> <p>In this thesis, a systematic study of the solvent composition is carried out to aid in the detection of neutral lipids such as triglycerides thereby expanding the molecular coverage of nano-DESI experiments. Taking advantage of the versatility of the solvent composition, I developed an approach for the online derivatization of unsaturated lipids into lipid hydroperoxides using the reaction of singlet oxygen with C=C bonds. This method further expands the specificity of nano-DESI MSI by enabling the detection and imaging of positional lipid isomers. To aid in the analysis of complex mixtures and provide additional structural information in the form of collision cross sections, coupling of nano-DESI with a drift-tube ion mobility spectrometry is also reported along with examples of the powerful capabilities of this platform. Lastly, nano-DESI MSI is used to address the complexity in the analysis of individual skeletal muscle fibers. This collaborative project involves the development of a robust image registration approach of immunofluorescence imaging and high-spatial resolution nano-DESI MSI to obtain accurate chemical maps specific to each fiber type. The developments described in this thesis are key to understanding the dynamic metabolic processes on a molecular level with an unprecedented specificity and sensitivity.</p> <p>  </p>

Background Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed malignant disease among adult males in the USA and the second leading cause of cancer deaths in men. Due to the lack of diagnostic tools that are able to differentiate highly malignant and aggressive cases from indolent tumors, overtreatment has become very common in the era of prostate specific antigen (PSA) screening. New diagnostic methods to determine biological status, malignancy, aggressiveness and extent of PCa are urgently needed. 1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H HRMAS MRS) can be used to establish PCa metabolomic profiles while preserving tissue architecture for subsequent histopathological analysis. Immunohistochemistry (IHC), as opposed to conventional histopathology methods, has the potential to provide objective, more accurate and quantitative knowledge of tissue pathology. This diagnostic- accuracy study sought to evaluate a novel approach to quantitatively identify metabolomic markers of PCa by exploring the potential of PCa immunomarkers to quantify metabolomic profiles established by 1H HRMAS MRS. Material and Methods 1H HRMAS MRS was performed on tissue samples of 51 prostate cancer patients using a 14.1 Tesla NMR spectrometer (BRUKER Biospin, Billerica, MA) with a rotor synchronized CPMG pulse sequence. Spectral intensities of 36 regions of interest were measured as integrals of curve fittings with Lorentzian-Gaussian line shapes. Immunohistochemistry (IHC) was carried out following the spectroscopy scan, using three prostate immunomarkers to identify cancerous and benign glands: P504S (Alpha-methylacyl-CoA-racemace), CK903 (high-molecular weight cytokeratin) and p63. The immunostaining quality following 1H HRMAS MRS was evaluated and compared to unscanned sections of the same sample, to verify the stability and accessibility of the proposed immunomarkers. IHC images were automatically and quantitatively evaluated, using a quantitative image analysis program (QIAP), to determine the percentage of cancerous and benign epithelia in the tissue cross- sections. The results of the program were validated by a correlation with the results of a quantitative IHC review and quantitative conventional histopathology analysis performed by an experienced pathologist. Ultimately, spectral intensities and the cancer epithelium percentage, obtained from quantitative immunohistochemistry, were correlated in order to validate PCa metabolomic markers identified by 1H HRMAS MRS. Patient outcomes and incidence of recurrence were determined by retrospective review of medical records five years after initial surgery. Categories of recurrence were correlated to spectral intensities to explore potential metabolomic markers of recurrence in the cohort. Results Immunostainings with P504S and CK903 showed excellent staining quality and accessibility following 1H HRMAS MRS, suggesting these markers to be suitable for the presented quantitative approach to determine metabolomics profiles of PCa. In contrast, the quality of p63 IHC was impaired after previously performed spectroscopy. IHC using the immunomarkers P504S and CK903 on adjacent slides was found to present a feasible quantitative diagnostic method to distinguish between benign and cancerous conditions in prostate tissue. The cancer epithelium percentage as determined by QIAP showed a significant correlation to the results of quantitative IHC analysis performed by a pathologist (p < 0.001), as well as to a quantitative conventional histopathology review (p = 0.001). The same was true for the benign epithelium percentage (p < 0.001 and p = 0.0183), validating the presented approach. Two metabolomic regions showed a significant correlation between relative spectral intensities and the cancer epithelium percentage as determined by QIAP: 3.22 ppm (p = 0.015) and 2.68 ppm (p = 0.0144). The metabolites corresponding to these regions, phosphocholine and citrate, could be identified as metabolomic markers of PCa in the present cohort. 45 patients were followed for more than 12 months. Of these, 97.8% were still alive five years after initial surgery. 11 patients (24.4%) experienced a recurrence during the follow- up time. The categories of recurrence showed a correlation to the spectral intensities of two regions, 2.33 – 2.3 ppm (p = 0.0403) and 1.28 ppm (p = 0.0144), corresponding to the metabolites phosphocreatine and lipids. Conclusion This study introduces a method that allows an observer-independent, quantitative analysis of IHC to help establish metabolomic profiles and identify metabolomic markers of PCa from spectral intensities obtained with 1H HRMAS NMR Spectroscopy. The immunomarkers P504S and CK903 have been found suitable IHC analysis following 1H HRMAS MRS. A prospective in vivo application of PCa metabolite profiles and metabolomic markers determined by the presented method could serve as highly sensitive, non- invasive diagnostic tool. This observer- independent, computer- automated, quantitative analysis could help to distinguish highly aggressive tumors from low-malignant conditions, avoid overtreatment and reduce risks and complications for cancer patients in the future. Further studies are needed to verify the identified PCa metabolomic markers and to establish clinical applicability. / Einführung Prostatakrebs ist eine häufigsten Krebserkrankungen in den USA und die zweithäufigste malignom- assoziierte Todesursache männlicher Patienten weltweit. Seit der Einführung des Prostata- spezifischen Antigen (PSA)- Screeningtests wird diese Krebsart in früheren Stadien diagnostiziert und therapiert, wodurch die Mortalitätsrate in den letzten Jahren deutlich reduziert werden konnte. Da moderne diagnostische Methoden bislang jedoch nicht ausreichend in der Lage sind, suffizient zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Varianten dieses bösartigen Krebsleidens zu unterscheiden, werden häufig auch Patienten aggressiv therapiert, deren niedriggradiges Prostatakarzinom keine klinische Relevanz gehabt hätte. Es besteht daher ein großes wissenschaftliches Interesse an der Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zur akkuraten Bestimmung von biologischem Status, Malignität, Aggressivität und Ausmaß einer Prostatakrebserkrankung. \\\\\\\"1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy\\\\\\\" (1H HRMAS MRS) ist eine vielversprechende diagnostische Methode, welche es ermöglicht, metabolomische Profile von Prostatakrebs zu erstellen, ohne die Gewebsstruktur der analysierten Proben zu zerstören. Durch anschließende histopathologische Begutachtung lassen sich die erstellten Metabolitprofile validieren und evaluieren. Im Gegensatz zu konventionellen histopathologischen Methoden können durch immunhistochemische Verfahren dabei objektivere, akkuratere und quantifizierbare histopathologische Erkenntnisse gewonnen werden. Die vorliegende Studie präsentiert einen neuentwickelten diagnostischen Ansatz zur quantitativen Bestimmung von metabolomischen Markern von Prostatakrebs, basierend auf der Durchführung von 1H HRMAS NMR Spektroskopie und quantitativer Immunhistochemie. Material und Methoden Einundfünfzig Gewebsproben von Prostatakrebspatienten wurden mittels 1H HRMAS MRS an einem 14.1 T BRUKER NMR Spektrometer unter Einsatz einer CPMG-Pulssequenz untersucht. Spektrale Intensitäten in 36 Metabolitregionen wurden gemessen. Anschließend wurden die analysierten Gewebeproben mit drei Immunfärbemarkern für sowohl malignes (P504S, Alpha-methylacyl-CoA-racemase) als auch benignes (CK903, High-molecular weight cytokeratin, und p63) Prostatagewebe angefärbt und quantitativ mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (QIAP) ausgewertet. Die Anwendbarkeit und Auswertbarkeit der genannten Immunomarker nach Spektroskopie wurde evaluiert und mit der Färbungsqualität von nicht- gescannten Schnitten verglichen. Die Resultate der automatischen Auswertung durch QIAP konnten durch einen erfahrenen Pathologen in einer quantitativen Analyse der Immunfärbungen sowie konventioneller histologischer Färbungen derselben Gewebsproben validiert werden. Die spektralen Intensitäten aus den Messungen mit 1H HRMAS MRS wurden mit den korrespondierenden Ergebnissen der quantitativen Auswertung der Immunfärbungen korreliert, um metabolomische Marker von Prostatakrebs zu identifizieren. Der klinische Verlauf und die Rezidivrate der Patienten wurden 5 Jahre nach der initialen Prostatektomie retrospektiv bestimmt. Rezidivkategorien wurden erstellt und mit den bestimmten spektralen Intensitäten korreliert, um metabolomische Marker für das Auftreten von Prostatakrebsrezidiven zu identifizieren. Ergebnisse Die Immunfärbungen mit P504S und CK903 zeigten exzellente Qualität und Auswertbarkeit nach vorheriger 1H HRMAS MRS. Beide Marker eigneten sich zur Durchführung von quantitativer Immunhistochemie an spektroskopierten Gewebeproben. Im Gegensatz dazu war die Qualität der Immunfärbungen mit p63 nach Spektroskopie vermindert. Quantitative Immunfärbungen unter Einsatz der Immunmarker P504S und CK903 stellten eine praktikable diagnostische Methode dar, um zwischen malignen und benignem Prostatagewebe zu unterscheiden. Der Anteil von bösartig verändertem Prostatagewebe, bestimmt durch QIAP, korrelierte signifikant mit den Ergebnissen der quantitativen Analyse der Immunfärbungen durch den Pathologen (p < 0.001), sowie mit der quantitativen Auswertung der konventionellen histopathologischen Färbung (p = 0.001). Ebenso ließ sich die Bestimmung des Anteils von benignem Gewebe mit QIAP zu den Ergebnissen der pathologischen Analyse korrelieren (p < 0.001 und p = 0.0183). Für zwei metabolomische Regionen konnte ein signifikante Korrelation zwischen relativen spektralen Intensitäten, bestimmt mit 1H HRMAS NMR Spektroskopie, und dem Anteil von malignem Epithelium in derselben Gewebeprobe, ermittelt durch QIAP, festgestellt werden: 3.22 ppm (p = 0.015) und 2.68 ppm (p = 0.0144). Die zu diesen Regionen korrespondierenden Metaboliten, Phosphocholin und Zitrat, konnten als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Die retrospektiven Analyse der klinischen Daten der Patienten fünf Jahre nach Prostatektomie ergab eine Überlebensrate von 97.8%. Elf dieser Patienten (24.4%) erlitten ein Rezidiv ihrer Erkrankung. Die bestimmten Rezidivkategorien korrelierten signifikant mit zwei metabolomischen Regionen (2.33 – 2.3 ppm, p = 0.0403 und 1.28 ppm, p = 0.0144), welche zu den Metaboliten Phosphokreatin und Lipiden korrespondierten. Schlussfolgerung Die vorliegende Studie präsentiert einen diagnostischen Ansatz zur objektiven und quantitativen Bestimmung metabolomischer Marker von Prostatakrebs unter Verwendung von 1H HRMAS MRS und Immunhistochemie. P504S und CK903 eignen sich als Immunmarker für quantitative Immunfärbungen nach vorheriger Durchführung von 1H HRMAS MRS. Die Metaboliten Phosphocholin und Zitrat konnten in der vorliegenden Patientenkohorte als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Eine mögliche in vivo Anwendung der gefundenen metabolomischen Marker könnte als hochsensitives, objektives und nicht- invasives diagnostisches Werkzeug der Prostatakrebsdiagnostik dienen. Der vorliegende untersucherunabhängige, automatisierte und quantitative diagnostischer Ansatz hat das Potential, zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Krebsfällen zu unterscheiden und somit unnötige Risiken und Komplikationen für Prostatakrebspatienten zu reduzieren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die identifizierten metabolomischen Marker zu verifizieren und eine klinische Anwendung zu etablieren.